CN114350726A

CN114350726A - 一种以纤维素为底物合成海藻糖的方法

Info

Publication number: CN114350726A
Application number: CN202210026372.6A
Authority: CN
Inventors: 郑穗平; 郑一文; 唐士茗; 林影
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-01-11
Filing date: 2022-01-11
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明属于合成生物学技术领域，公开了一种以纤维素为底物合成海藻糖的方法，具体公开了一种合成海藻糖的方法，所述方法以纤维素为底物，经内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶共同作用合成海藻糖。本发明提供了一种以纤维素为底物，利用Tre P途径合成海藻糖的新途径，通过在纤维素中添加内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶，进行多酶催化反应生成海藻糖，其纤维素的转化率大于14％。

Description

一种以纤维素为底物合成海藻糖的方法

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，具体涉及一种以纤维素为底物合成海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖作为天然食品甜味剂，稳定、甜度低、抗蛀牙、抗逆保鲜，同时又不发生美拉德反应，是维持食品色泽、香气和风味的理想保鲜剂。海藻糖可显著提高植物对环境的抗逆性，它的相关调控基因在不断的被人们挖掘。海藻糖在医疗领域的应用也越来越广阔。起初，由于生物医学领域中的生物制剂环境敏感性高且易失活，为了降低保存成本并延长保存期，人们发现海藻糖在提高生物制剂的环境抗逆性方面有着重要作用。

研究表明，目前海藻糖有五条合成途径：(1)TPS-TPP***，其中海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose 6-phosphate synthase，TPS)催化从葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸合成海藻糖-6-磷酸，进一步利用海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(Trehalose 6-phosphate phosphate，TPP)催化海藻糖-6-磷酸水解为海藻糖；(2)Tre P途径，葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖经过海藻糖磷酸化酶(Trehalose phosphorylase，TP)催化生成海藻糖；(3)Tre T途径，利用海藻糖苷转移酶(Trehalose transferase，Tre T)将ADP-葡萄糖和葡萄糖转化为海藻糖；(4)TreY/Tre Z途径，用麦芽糖基海藻糖合酶和麦芽糖基海藻糖水解酶与α-淀粉酶和普鲁兰酶结合，从淀粉或麦芽低聚糖中制备海藻糖；(5)TS途径，利用海藻糖合酶(Trehalosesynthase，TS)通过分子内葡萄糖转移直接从麦芽糖中生成海藻糖。其中，利用Tre Y/Tre Z途径和TS途径两种途径生产海藻糖得到了商业化发展，但均是以麦芽糖或者淀粉为底物。

自然界中植物产生的纤维素大约是产生淀粉量的40倍。每年收获的富含纤维素的农作物大多数被焚烧或浪费，其利用率较低，对于其纤维素生物提炼更是少之又少。如何将非食物纤维素转化为其他具有高价值的化学品是目前一大研究热点，不仅可以提高生物资源利用率，还可以减少焚烧时对环境的损坏与污染。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种合成海藻糖的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种合成海藻糖的方法，所述方法以纤维素为底物，经内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶共同作用合成海藻糖。

优选地，所述方法具体为：将纤维素与内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶混合，反应，得到海藻糖；或

将纤维素与内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖磷酸化酶混合，反应，加入纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶，反应，得到海藻糖。

进一步优选地，所述方法具体为：将纤维素与内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶混合，37～45℃反应12～72h，得到海藻糖；或

将纤维素与内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖磷酸化酶混合，37～50℃反应20～48h，加入纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶，37～45℃反应12～24h，得到海藻糖。

更进一步优选地，所述方法具体为：将纤维素与内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶混合，40～42℃反应12～48h，得到海藻糖；或

将纤维素与内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖磷酸化酶，37～45℃反应20～48h，加入纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶，40～42℃反应12～24h，得到海藻糖。

优选地，所述反应前在反应体系中加入磷酸钾缓冲液。

进一步优选地，所述磷酸钾缓冲液的pH值为5.5～8.0。

更进一步优选地，所述磷酸钾缓冲液的pH值为6.0～8.0。

进一步优选地，所述磷酸钾缓冲溶液中Mg²⁺浓度为5mM～50mM。

更进一步优选地，所述磷酸钾缓冲溶液中Mg²⁺浓度为10mM～50mM。

进一步优选地，合成海藻糖反应体系中所述磷酸根离子的终浓度为10mM～150mM。

更进一步优选地，合成海藻糖反应体系中所述磷酸根离子的终浓度为20mM～100mM。

优选地，合成海藻糖反应体系中所述纤维素的终浓度为4～20mg/mL。

进一步优选地，合成海藻糖反应体系中所述纤维素的终浓度为4～15mg/mL。

优选地，所述纤维素为无定型纤维素。

优选地，所述无定型纤维素为磷酸处理后的纤维素。

优选地，所述无定型纤维素的制备方法为：纤维素与水混合形成浆液，浆液与磷酸混合，得到无定形纤维素。

进一步优选地，所述纤维素和水的质量体积比为1:(1～3)。

更进一步优选地，所述纤维素和水的质量体积比为1:(2～3)。

进一步优选地，反应体系中所述磷酸的终浓度为70％～85％(w/w)。

更进一步优选地，反应体系中所述磷酸的终浓度为80％～85％(w/w)。

优选地，所述无定型纤维素的制备方法还包括加水搅拌和离心。

优选地，所述加入水搅拌为：每10～15min添加一次预冷的水，每次添加10～15mL，每次加水后剧烈搅拌。

优选地，所述离心的条件为3500～4500×g，4～8℃下离心15～30min。

优选地，所述无定型纤维素的制备方法还包括第一次洗涤，碳酸钠溶液中和，第二次洗涤，加入缓冲溶液。

进一步优选地，所述第一次洗涤为用预冷的水洗涤三次。

进一步优选地，所述碳酸钠溶液的浓度为1～4M。

进一步优选地，所述碳酸钠溶液的添加量为0.5～1mL。

进一步优选地，所述第二次洗涤为用预冷的缓冲溶液洗涤一次。

进一步优选地，所述加入的缓冲溶液为磷酸钾溶液。

更进一步优选地，所述缓冲溶液的添加量为5～15mL。

优选地，合成海藻糖反应体系中所述内切葡萄糖酶的终浓度为20～300μg/mL。

进一步优选地，合成海藻糖反应体系中所述内切葡萄糖酶的终浓度为50～150μg/mL。

优选地，合成海藻糖反应体系中所述纤维二糖水解酶的终浓度为20～200μg/mL。

进一步优选地，合成海藻糖反应体系中所述纤维二糖水解酶的终浓度为50～150μg/mL。

优选地，合成海藻糖反应体系中所述纤维二糖磷酸化酶的终浓度为20～300μg/mL。

进一步优选地，合成海藻糖反应体系中所述纤维二糖磷酸化酶的终浓度为50～200μg/mL。

优选地，合成海藻糖反应体系中所述海藻糖磷酸化酶的终浓度为20～200μg/mL。

进一步优选地，合成海藻糖反应体系中所述海藻糖磷酸化酶的终浓度为50～150μg/mL。

在本发明中，以纤维素为底物，纤维素通过磷酸处理形成无定形纤维素，通过内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶酶催化生成纤维二糖，纤维二糖通过纤维二糖磷酸化酶催化转化为α-葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖，α-葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖经海藻糖磷酸化酶催化生成海藻糖(图1)。通过上述四种酶，在不需要额外能量和底物添加的情况下，通过一锅法或级联反应成功合成了海藻糖，这是一种全新的海藻糖合成途径，通过此途径，使得秸秆等农业废弃物有了更好层次的应用。

另外，基于体外酶生物***的特点，本发明选择了大肠杆菌作为蛋白表达的工程菌，用于合成方法中酶的表达。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种以纤维素为底物，利用Tre P途径合成海藻糖的新途径，通过在纤维素中添加内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶，进行多酶催化反应生成海藻糖，其纤维素的转化率大于14％。

本发明提供的合成海藻糖的方法，不需要要加入辅酶因子以及ATP，只需要将纤维素用磷酸处理和少量的磷酸根离子，并且磷酸根离子可以完成自我循环，加入四种酶，在合适的的缓冲液、pH、温度下就可以直接合成海藻糖。

本发明通过体外酶促反应合成海藻糖，反应过程简单，反应底物廉价，分离成本低，可以提高生物质资源的利用率，缓解目前农业废弃物浪费的问题，实现了资源再利用，减少环境污染，具有良好的经济效益。

本发明提供的海藻糖合成方法操作简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。

附图说明

图1为本发明的技术原理图。

图2为纤维二塘、葡萄糖、海藻糖三种物质的标品的HPLC峰谱图。

图3为实施案例4制得的海藻糖样品的HPLC峰谱图。

图4为不同反应温度条件下一锅法和级联反应合成海藻糖的结果统计图。

具体实施方式

现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。

实验所需要的溶液配制：

LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，用去离子水配制，高压蒸汽灭菌后，室温保持，备用。

异丙基硫代半乳糖苷溶液(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)(1M)：称取IPTG28.3g，溶于去离子水中，完全溶解后，定容至100mL，分装到2mL保种管中，-20℃冷冻保存，备用。

卡那霉素溶液(100mg/mL)：称取硫酸卡那霉素10g，溶于去离子水中，完全溶解后，定容至100mL，分装到2mL保种管中，-20℃冷冻保存，备用。

磷酸钾缓冲液(Mg²⁺)(buffer A)：8.7g磷酸氢二钾，1.2g硫酸镁通过1L的去离子水配置得到磷酸氢二钾溶液；6.8g磷酸二氢钾，1.2g硫酸镁通过1L的去离子水配置得到磷酸二氢钾溶液；向磷酸二氢钾溶液中加入磷酸氢二钾溶液，调节pH到6。

在以下实施例中，所用的酶均由大肠杆菌BL21表达，其中内切葡聚糖酶(Endoglucanase，EC:3.2.1.4，EG)的氨基酸序列SEQ ID No:1所示，纤维二糖水解酶(Exocellobiohydrolases，EC:3.2.1.91，CBH)的氨基酸序列SEQ ID No:2所示，纤维二糖磷酸化酶(Cellobiose phosphorylase，EC:2.4.1.20，CBP)的氨基酸序列SEQ ID No:3所示，海藻糖磷酸化酶(Trehalose phosphorylase，EC:2.4.1.231，TP)的氨基酸序列SEQ ID No:4所示。

实施例1 EG、CBH、CBP、TP的表达与纯化

(1)EG、CBH、CBP、TP基因序列的优化与合成

通过NCBI数据库获得Bacillus subtilis来源的内切葡聚糖酶(EG)基因(GenBank：NC_000964.3)，Lachnoclostridium phytofermentans来源的纤维二糖水解酶(CBH)基因(GenBank：WP_012201370.1)，Clostridium thermocellum来源纤维二糖磷酸化酶(CBP)基因(GenBank：AAL67138.1)，Schizophyllum commune来源的海藻糖磷酸化酶(TP)基因(GenBank：ABC84380.1)。将以上四个基因送至上海捷瑞生物公司分别经大肠杆菌密码子优化后合成全基因，全基因合成后分别克隆至质粒PET-28a，得到重组质粒PET-28a-EG、PET-28a-CBH、PET-28a-CBP和PET-28a-TP。

(2)重组质粒转化大肠感受态

在超净工作台内，将上述四个重组质粒分别加入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，并用移液枪轻轻混匀，冰浴5min。涂布于含有50mg/L卡那霉素抗性LB平板，于37℃培养箱过夜培养。

(3)菌落PCR鉴定

从步骤(2)中的平板中挑取单菌落，用2×Utaq PCR MasterMix(北京庄盟国际生物基因科技有限公司，目录编号：ZT201A-1)进行菌落PCR初步鉴定，其引物如表1所示，菌落PCR体系如表2所示，扩增程序如表3所示。菌落PCR扩增结束后，将菌落PCR产物点至1％琼脂糖凝胶电泳胶孔内(另点一孔DS 5000DNA Marker作为对照)，在电泳槽内(110V)分离30min，分离结束后将琼脂糖凝胶电泳胶浸泡于Gelred染色液15min。在照胶仪内根据DS5000DNA Marker判断菌落PCR产物条带的大致大小，并与预期的条带大小相比较，从而确定表达菌株构建是否完成。

(4)EG、CBH、CBP、TP的表达纯化

将所构建的菌种分别在含有50mg/L卡那霉素的琼脂平板上划线培养。分别挑取单菌落至10mL含有50mg/L的卡那霉素的LB培养基中，于37℃，250r/min条件下过夜培养，得到种子液。在100mL含有50mg/L的卡那霉素的LB培养基中分别接种种子液，使培养体系的OD₆₀₀为0.1，置于37℃，250r/min条件下进行培养。当培养OD₆₀₀至在0.6～0.8之间，加入50μL的1MIPTG进行诱导，诱导条件为16℃，180r/min，诱导16h；诱导结束后，将菌液移至100mL离心管中，以6000r/min，常温离心5min；弃去上清，用10mL无菌水重悬，6000r/min，常温离心5min，弃去上清。

向上述离心好的细胞中分别加入20mL buffer A，放入超声破碎仪处理，35％的频率超声3s，间隔3s，共处理40min；4℃，10000r/min离心10min，分别收集上清液。

利用AKTA和Ni柱对蛋白进行纯化，获得目的蛋白(EG、CBH、CBP和TP)。

表1 EG、CBH、CBP和TP基因的引物

表2菌落PCR反应体系

表3菌落PCR扩增反应程序

实施例2无定形纤维素的制备

将0.2g的微晶纤维素粉末添加到50mL离心管中，并添加0.6mL蒸馏水以润湿纤维素粉末，形成纤维素悬浮浆液。在剧烈搅拌下，将10mL预冷的86.2％(w/w)磷酸缓慢加入到纤维素悬浮浆液中(在加入最后2mL磷酸之前，必须将纤维素悬浮液均匀混合)，使最终磷酸浓度约为83.2％(w/w)；每10min添加一次预冷的蒸馏水，每次添加10mL，共添加4次，每次添加水的时候应剧烈搅拌，将离心管于冰上静置1h；将静置后的纤维素溶液于4000×g，4℃条件下离心20min；弃去上清，将沉淀物用预冷的蒸馏水悬浮，离心弃上清，重复三次(除去纤维素中的磷酸)；向纤维素沉淀物中加入0.5mL的2M Na₂CO₃溶液，以中和残留的磷酸；离心后，用45mL的预冷buffur A洗涤一次；再次离心后，加入10mL buffur A悬浮沉淀物，即得到无定形纤维素，，4℃保存，备用。

实施例3以无定形纤维素为底物通过一锅法合成海藻糖

以无定形纤维素为底物通过一锅法合成海藻糖。其反应条件如下：实施例2制得的无定型纤维素(反应体系中无定形纤维素终浓度为10mg/mL)，100μg EG，100μg CBH，100μgCBP，100μg TP，用buffur A补充至1mL，42℃反应48h，得到海藻糖。

利用HPLC检测合成后的海藻糖，计算无定形纤维素转化率(转化率＝(生成海藻糖质量/底物无定形纤维素质量)×100％)，其无定形纤维素转化率为14.37％。

HPLC检测条件为：色谱柱：Waters XBridge BEH Amide Column(4.6mm X 250mm)；HPLC***：Waters 2695；检测器：Waters 2424蒸发光检测器；检测条件：柱温35℃，流动相为乙腈:水＝80:20，流速1.0mL/min，进样量为10μL；ELSD蒸发光检测器参数：喷雾器预热动力水平70％，漂移管温度65℃，载气为高纯氮，载气流率30psi，增益100，数据采集率：10pps。

实施例4以无定形纤维素为底物通过一锅法合成海藻糖

以无定形纤维素为底物通过一锅法合成海藻糖，其反应条件如下：实施例2制得的无定型纤维素(反应体系中无定形纤维素终浓度为10mg/mL)，100μg EG，100μg CBH，100μgCBP，100μg TP，用buffur A补充至1mL，40℃反应48h，得到海藻糖。

利用HPLC检测合成后的海藻糖(其检测条件同实施3一致)，其峰谱图如图3所示(纤维二塘、葡萄糖、海藻糖的标品的峰谱图如图2所示)，计算无定形纤维素转化率，其无定形纤维素转化率为14.13％。

实施例5以无定形纤维素为底物通过级联反应合成海藻糖

以无定形纤维素为底物通过级联反应合成海藻糖，反应条件如下：实施例2制得的无定型纤维素(反应体系中无定形纤维素终浓度为10mg/mL)，100μg EG，100μg CBH，100μgCBP buffur A补充至1mL，45℃反应24h；加入100μg CBP和100μg TP，并用buffur A补充至1mL，42℃反应24h，得到海藻糖。

利用HPLC检测合成后的海藻糖(其检测条件同实施3一致)，计算无定形纤维素转化率，其无定形纤维素转化率为16.07％。

实施例6以无定形纤维素为底物通过级联反应合成海藻糖

以无定形纤维素为底物通过级联反应合成海藻糖，反应条件如下：实施例2制得的无定型纤维素(反应体系中无定形纤维素终浓度为10mg/mL)，100μg EG，100μg CBH，100μgCBP buffur A补充至1mL，45℃反应24h；加入100μg CBP和100μg TP，并用buffur A补充至1mL，40℃反应24h，得到海藻糖。

利用HPLC检测合成后的海藻糖含量(其检测条件同实施3一致)，计算无定形纤维素转化率，其无定形纤维素转化率为15.61％(图4)。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南理工大学

<120> 一种以纤维素为底物合成海藻糖的方法

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> Endoglucanase

<400> 1

Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys

1 5 10 15

Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly

20 25 30

Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp

35 40 45

Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala

50 55 60

Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys

65 70 75 80

Asn Lys Val Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr

85 90 95

Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn

100 105 110

Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly

115 120 125

Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp

130 135 140

Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser

145 150 155 160

Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly

165 170 175

Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp

180 185 190

Ala Asn Val Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln

195 200 205

Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile

210 215 220

Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val

225 230 235 240

Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr

245 250 255

Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser

260 265 270

Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp

275 280 285

Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys

290 295 300

Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro Glu Thr Pro Ser Lys Asp Lys Pro Thr

305 310 315 320

Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met

325 330 335

Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn

340 345 350

Thr Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Lys Ala

355 360 365

Lys Asn Lys Gly Gln Asn Phe Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys

370 375 380

Gly Asn Val Thr His Lys Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly

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465 470

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<212> PRT

<213> Exocellobiohydrolases

<400> 2

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1 5 10 15

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580 585 590

Lys Tyr Leu Gln Asp Pro Ser Tyr Pro Lys Leu Leu Ala Ala Tyr Gln

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<211> 811

<212> PRT

<213> Cellobiose phosphorylase

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<211> 20

<212> DNA

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<210> 12

<211> 20

<212> DNA

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<400> 12

tcctgaactt taatgccgcc 20

Claims

1.一种合成海藻糖的方法，其特征在于，所述方法以纤维素为底物，经内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶共同作用合成海藻糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为将纤维素与内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶混合，反应，得到海藻糖；或

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素为无定型纤维素，所述无定型纤维素优选为磷酸处理后的纤维素。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无定型纤维素的制备方法为：纤维素与水混合形成浆液，浆液与磷酸混合，得到无定形纤维素。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纤维素和水的质量体积比为1:(1～3)。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反应体系中磷酸的终浓度为70w/w％～85w/w％。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，合成海藻糖反应体系中所述纤维素的终浓度为4～20mg/mL。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，合成海藻糖反应体系中所述内切葡萄糖酶的终浓度为20～300μg/mL；合成海藻糖反应体系中所述纤维二糖水解酶的终浓度优选为20～200μg/mL。

9.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，合成海藻糖反应体系中所述纤维二糖磷酸化酶的终浓度为20～300μg/mL。

10.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，合成海藻糖反应体系中所述海藻糖磷酸化酶的终浓度为20～200μg/mL。