CN111909954A

CN111909954A - 一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法

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Publication number: CN111909954A
Application number: CN202010668698.XA
Authority: CN
Inventors: 陈华友; 崔周磊; 王洪成; 蔡康涛; 梁晓玉; 齐向辉; 崔凤杰
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2040-07-13
Also published as: CN111909954B

Abstract

本发明属于生物饲料领域，涉及一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法；首先将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列进行偏爱性优化，以优化的基因为模板进行PCR扩增，与pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，获得重组穿梭质粒并导入缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌；然后与粗糙脉胞菌、重组S.pombe‑man和产阮假丝酵母混合，添加氮源、氯化钙、硫酸锰、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行菌酶协同混菌发酵玉米秸秆；本发明合理利用农业废弃物，能够有效促进秸秆中木质纤维素的转化，在短时间内显著提高发酵饲料的品质，获得高品质生物饲料。

Description

一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法

技术领域

本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法。

背景技术

2019年中国科协发布20大重大科学问题和工程技术难题，废弃物资源生态安全利用技术集成排行在列。随着我国农业现代化的不断推进，农区耕地面积短缺与规模化牛羊静养需求大量优质粗饲料之间的矛盾日益突显，特别是在我国南方地区，优质粗饲料短缺是制约南方反刍动物大规模养殖的瓶颈之一。我国不仅是农业大国也是畜牧养殖业大国，每年产生大量的农业废弃物理应满足畜牧养殖的牧草饲料供应要求，但国内依然大量进口国外的优质牧草饲料。利用青储、黄储或微储技术保存秸秆新鲜度对养殖户的场地资金投入、人力物力都提出了较大的挑战，最主要问题是对秸秆饲料品质提升，包括木质素降低和真蛋白提高极有限。养殖户将新鲜的秸秆晒干以便秋冬时节饲喂牛羊，但这种秸秆细胞壁厚、木质素多，真蛋白极低，多种营养物质流失，导致饲料适口性差，阻碍养分的消化和吸收。很多报道表明，玉米秸秆中的纤维素被木质素和半纤维素紧密包被，阻碍了纤维素酶、半纤维素酶与纤维素、半纤维素的接触，这是木质纤维素转化过程中的关键问题。目前市场上已有商品化的纤维素酶和半纤维素酶，但是木质素降解酶系中只有漆酶和葡萄糖氧化酶，而锰过氧化物酶可以氧化木质素中的酚类结构单元及其他难以降解的化学结构，是一种重要的木质素降解酶，但还没有市场供应。

目前，生物饲料原料发酵过程中较重视纤维素和半纤维素的酶解，以木质素为突破口的发酵工艺报道较少，特别是采用菌酶协同混菌发酵以综合提高真蛋白，降解木质素，适量降解纤维素和半纤维素，而且在发酵过程中联合多种小分子物质协同转化的报道更加缺乏。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是协同降解玉米秸秆，构建一株重组锰过氧化物酶酵母工程菌，并提供一种经济安全高效的发酵方式，多酶协同混菌降解发酵玉米秸秆，短时间内显著提高玉米秸秆发酵饲料的品质。本发明所述的菌酶协同混菌发酵方式，把玉米秸秆转化成高品质生物粗饲料原料。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：

(1)将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；

(3)协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料：首先将步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌与粗糙脉胞菌(N.crassa)、重组S.pombe-man和产朊朊假丝酵母(C.utilis)混合，并添加氮源、CaCl₂、MnSO₄、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行菌酶协同混菌发酵玉米秸秆；并控制上述添加的所有物质组成的发酵体系中的含水量。

优选的，步骤(2)中所述重组穿梭质粒为pREP-mnp。

优选的，步骤(2)中所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌；需要在含有葡萄糖胺的培养基中生长，无抗性基因，具有生物安全性。

优选的，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母；需要在含有葡萄糖胺的培养基中生长，具有生物安全性的食品级酵母菌。

优选的，步骤(3)中所述的重组S.pombe-man发酵菌株是将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露聚糖酶基因序列，根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化后导入粟酒裂殖酵母中，构建的一株重组甘露聚糖酶酵母工程菌，记为S.pombe-man。

优选的，步骤(3)中所述N.crassa、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和C.utilis的总接菌量为1％-15％；所述粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和C.utilis的接种体积比例为2:4:4:2；整个发酵体系中的总含水量为50％-70％。

优选的，步骤(3)中所述的氮源由尿素和硫酸铵组成，其中尿素的用量为玉米秸秆质量的0.5％-1％，硫酸铵的用量为玉米秸秆质量的1％-4％。

优选的，步骤(3)中所述CaCl₂的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％，MnSO₄的用量为玉米秸秆质量的0.1％-0.7％，葡萄糖氧化酶(GOD)的用量为玉米秸秆质量的0.2％-0.6％，漆酶(Lac)的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％。

优选的，步骤(3)中所述漆酶的酶活力为10 000U/g，葡萄糖氧化酶的酶活力为200U/g。

优选的，步骤(3)中所述小分子物质激活剂为草酸和Tween-80；所述草酸在发酵体系中的终浓度为0.2-1mM，复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为玉米秸秆质量的0.02％。

优选的，步骤(3)中所述发酵的温度为26-37℃，发酵时间为2-4天。

本发明制备的重组锰过氧化物酶酵母工程菌还可应用于酶解玉米秸秆木质素，也可用于造纸等用途，具体步骤如下：

培养步骤(2)中所述的重组酵母工程菌，得到菌液，离心收集粗酶液，粗酶液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；并添加CaCl₂、MnSO₄、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解玉米秸秆木质素。

优选的，所述重组锰过氧化物酶在酶解过程中的适宜反应温度为20～50℃，适宜pH为2.0～4.0。

优选的，所述多酶协同酶解玉米秸秆木质素：玉米秸秆与粗酶液的料液比为0.5-5:1；CaCl₂的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％，MnSO₄的用量为玉米秸秆质量的0.1％-0.7％，葡萄糖氧化酶的用量为玉米秸秆质量的0.2％-0.6％，漆酶的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％。

优选的，所述漆酶的酶活力为10000U/g，葡萄糖氧化酶的酶活力为200U/g。

优选的，所述小分子物质激活剂由草酸和Tween-80组成；所述草酸在酶解体系中的终浓度为0.2-1mM复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为玉米秸秆质量的0.02％。

其中，漆酶和葡萄糖氧化酶购自夏盛(北京)生物科技开发有限公司，为普通饲料级商业化酶制剂，商场上均可购买；粟酒裂殖酵母、粗糙脉胞菌和产朊假丝酵母购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

本发明的优点和技术效果是：

(1)本发明提供一种具有生物安全性食品级重组锰过氧化物酶酵母工程菌，可以快速地获取大量锰过氧化物酶，实现锰过氧化物酶的工业化生产，获得良好稳定的过氧化物酶产品，用于木质素的降解。本申请中所制备的锰过氧化物酶的适宜反应温度为20～50℃，适宜pH为2.0～4.0，具有更为优良的耐酸性能；大量实验表明其联合Ca²⁺、Mn²⁺共同降解木质素时可以显著提高木质素的降解率，另外与葡萄糖氧化酶和漆酶等协同降解木质素时，均可以提高对木质素的降解率，促进秸秆中木质纤维素的转化。

(2)自然界中的Irpex lacteus诱导性表达锰过氧化物酶，直接用Irpex lacteus固体发酵时产酶量低、产酶条件不易控制，且生长速度缓慢，也有易染菌风险，会增加发酵时间和生产成本；本发明构建的重组酵母发酵工程菌可以大量分泌高活性的锰过氧化物酶以降解玉米秸秆中木质素，缩短发酵周期，降低成本支出；另一方面，本发明构建的重组发酵工程菌选用营养缺陷型筛选标记，摒弃了常规使用的抗性基因，保证了发酵饲料菌种的生物安全性。

(3)一直以来，秸秆降解的研究一般重视纤维素和半纤维素的酶解，以木质素酶解为突破口报道不多，特别是联合多种小分子物质协同酶解的报道很少；本发明首次把锰过氧化物酶粟酒裂殖酵母工程菌、粗糙脉胞菌和产朊假丝酵母等多菌种协同发酵，并与离子、酶制剂和小分子激活剂协同作用高效快速降解秸秆中木质素，是目前报道中短时间(3天)内降解秸秆木质素最有效的成果；另一方面，通过菌酶协同发酵降低秸秆中的木质纤维素，提高真蛋白含量，满足优质牛羊粗饲料木质素少，真蛋白高，纤维素、半纤维素适量的原则。

(4)本发明不仅提供一种经济安全的发酵方式，在短时间内显著提高玉米秸秆发酵饲料的品质，让玉米秸秆生物粗饲料有真正潜力走向市场化，为玉米秸秆发酵转化成高品质生物饲料产业化提供保障。合理高效经济地利用农业废弃物，解决资源浪费的问题，引导农业废弃物资源循环利用产业链和价值链提升，促进我国生态循环农业可持续发展。

(5)本品对造纸业生物制浆提供技术支持。

附图说明

图1是锰过氧化物酶基因的原始序列和密码子优化后序列比对图。

图2是载体和目标基因PCR产物片段电泳图。

图3是构建的穿梭质粒pREP-mnp在粟酒裂殖酵母中表达分泌的胞外蛋白表达图。

图4是粟酒裂殖酵母中锰过氧化物酶酶活力随培养时间的变化图。

图5是温度对重组MnP酶活力和稳定性的影响。

图6pH对重组MnP酶活力和pH稳定性的影响。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。

实施例1：

将NCBI中Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列(GenBank:MH120207.1)，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；根据粟酒裂殖酵母中密码子偏爱性，需要对基因序列进行优化，密码子优化方法为：通过Graphical Codon Usage Analyser(http://gcua.schoedl.de/)在线***，分析锰过氧化物酶(MnP)基因中密码子的使用频率，从而选择适合粟酒裂殖酵母的转录翻译***的密码子。图1是锰过氧化物酶(MnP)基因的原始序列和密码子优化后序列比对图，密码子优化后的重组MnP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

以酵母常用载体pREP为模版，设计引物扩增目的基因序列，正向引物序列如SEQID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；进行PCR扩增目的基因片段(94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环)。同时，以载体pREP为模版设计引物，正向引物序列如SEQ IDNO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；进行PCR扩增载体线性片段(98℃10s，60℃15s，72℃50s，30个循环)。割胶回收片段并纯化测定浓度。图2是载体和目的基因的PCR产物片段电泳图；按ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit试剂盒连接的要求将优化后的MnP基因线性片段与pREP载体片段混合，37℃连接30min。将连接液转化6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌中，在LB固体培养基(不含葡萄糖胺)上筛选，挑取转化子，提质粒送生物公司测序，以便确定是否正向***和有无突变。将正向***的未发生碱基突变的质粒命名为pREP-mnp，通过电转化法导入6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母中，在YES固体培养基(不含葡萄糖胺)上筛选转化子，提取基因组后通过特异性引物，正向特异性引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向特异性引物序列如SEQ ID NO.8所示，进行菌落PCR(94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环)验证正确后得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp。

实施例2：

重组锰过氧化物酶的表达验证；

沾取-80℃中保存的S.pombe-pREP-mnp和对照组S.pombe-pREP菌液，平板划线，30℃恒温培养箱静止生长3天。分别挑取培养皿上大小均匀的单菌落接入50mL螺口尖底离心管中，管中YES培养液5mL，200rpm，30℃恒温震荡培养。待酵母培养至平台期，收集50mL的酵母细胞，8 000rpm高速离心，分四次取12mL上清培养液转移到蛋白浓缩住中浓缩胞外分泌蛋白。浓缩至最小量后，分两次加入12mL 20mM Tris-HCl(pH 7.0)清洗胞外分泌蛋白，除去上清培养液中的糖、离子和其他杂质。经SDS-PAGE电泳分析，实验组和对照相比有特异条带，锰过氧化物酶基因在粟酒裂殖酵母中表达的蛋白表观分子量约为43kDa。图3是构建的穿梭质粒pREP-mnp在粟酒裂殖酵母中表达分泌的胞外蛋白表达图。

在转化成功的培养皿上挑取大小均匀的单菌落接入50mL螺口尖底离心管中，管中YES培养液5mL，200rpm，30℃恒温震荡培养。每隔1天取出三支离心管做平行对照，8 000rpm高速离心，取培养基上清为测定液。以每升培养液每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。测定发现，重组MnP在第四天时酶活力急剧上升，达到活力最大值，重组酵母胞外分泌的MnP的酶活力为17.46U/L。图4是粟酒裂殖酵母中锰过氧化物酶酶活力随培养时间的变化图。

实施例3：

本实施例测定重组MnP酶的热稳定性和作用温度。在pH3.0缓冲液体系及不同温度条件下(20～90℃，每10℃为一个梯度)保持1h测定重组MnP的活力，以确定热稳定性。最高酶活力记为100％，其他酶活力与最高酶活力的比值即为相对酶活力。重组MnP在20～50℃内具有较好的稳定性，其中在40℃酶活力最高；图5为重组MnP酶的最适温度测定图。

实施例4：

本实施例测定重组MnP酶的pH稳定性和作用pH。最高酶活力记为100％，其他酶活力与最高酶活力的比值即为相对酶活力；在37℃条件下，将酶活测定液分别置于不同pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)保持1h，以确定稳定性。MnP活力在pH2.0～4.0之间时比较稳定，其中pH3.0酶活力最高，图6是重组MnP酶的pH稳定性测定图。

实施例5：

本实施例测定重组MnP酶对玉米秸秆木质素的多酶协同降解作用。本发明中的玉米秸秆取自宁夏江苏大学玉米试验田，粉碎后45℃烘干，40目过筛，贮藏于干燥环境中。

将不同质量的玉米秸秆分别与粗酶液混合，料液比分别为10:1、5:1、2:1、1:1、0.5:1，再加入CaCl₂，用量为玉米秸秆质量的0.1％～1％；加入MnSO₄，用量为玉米秸秆质量的0.3％～0.7％；加入漆酶，用量为玉米秸秆质量的0.1％～1％；加入葡萄糖氧化酶，用量为玉米秸秆质量的0.2％～0.6％；放置40℃恒温恒湿培养箱中酶解反应72h后，用VanSoest法测定木质素的含量变化。

分别按料液比10:1、5:1、2:1、1:1、0.5:1称取不同质量的玉米秸秆，加入粗酶液。表1是不同料液比的木质素降解率对比图。

表1.不同料液比的木质素降解率对比图

由表1可见，玉米秸秆中木质素的降解效率随着料液比例的降低整体呈不断增大的趋势，当料液比例为1:1时，玉米秸秆中木质素降解率效果最佳，降解率达到13.33％。

进一步测定玉米秸秆中木质素降解的条件。在料液比例1:1条件下添加不同浓度离子和酶制剂，酶解条件和测定方法同上。设置CaCl₂(A)、漆酶(B)、MnSO₄(C)和葡萄糖氧化酶(D)的添加量进行四因素三水平L9(34)正交试验。表2是玉米秸秆中木质素酶解的正交结果。

表2.玉米秸秆中木质素酶解的正交结果

实验最佳表观影响因子的组合是A₂B₃C₁D₂，木质素降解率达到53.97％。从表格中的极差来看，四种因素对木质素降解率的影响的顺序依次是D＞A＞B＞C，最佳组合即为A₂B₃C₁D₂，即酶解最优值分别为：CaCl₂添加量为0.5％，漆酶添加量为1％，MnSO₄添加量为0.3％，葡萄糖氧化酶添加量为0.4％。

实施例6：

参考实施例5的实验结果，将草酸加入玉米秸秆木质素酶解体系中，配制终浓度分别为0.2、0.5、1、2mM；表3是不同终浓度草酸木质素降解率对比图。

表3.不同终浓度草酸木质素降解率对比图

从表3分析，添加0.2～1mM终浓度的草酸，木质素降解率呈增长的趋势；当草酸的浓度为0.5mM时，木质素降解效果最好，达到最大值35.07％，故选择0.5mM浓度的草酸加入后续的酶解木质素实验中。

实施例7：

参考实施例6的实验结果，进一步优化不饱和脂肪酸Tween 80和硫醇类谷胱甘肽GSH对木质素的降解效果，以0.5mM草酸为对照组。表4不同复配小分子物质的降解率对比图。

表4.不同复配小分子物质的降解率对比图

从表4分析，草酸和不饱和脂肪酸Tween-80复配对提高木质素的降解效果最明显，木质素降解率达到65.85％；草酸和GSH复配时，木质素降解率为60.10％；所以确定添加0.02％的Tween-80作为复配小分子物质。

实施例8：

将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露聚糖酶基因man序列(GenBank:KP090452.1)，根据粟酒裂殖酵母中密码子偏爱性进行优化，密码子优化后的甘露聚糖酶核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

以酵母常用载体pREP为模版，设计引物扩增目的基因序列，正向引物序列如SEQID NO.11所示，反向引物序列如SEQ ID NO.12所示；进行PCR扩增目的基因片段(94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环)。同时，以载体pREP为模版设计引物，正向引物序列如SEQ IDNO.13所示，反向引物序列如SEQ ID NO.14所示；进行PCR扩增载体线性片段(98℃10s，60℃15s，72℃50s，30个循环)。按ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit试剂盒连接的要求将优化后的man基因线性片段与pREP载体片段混合，37℃连接30min。将连接液转化6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母中，在LB固体培养基(不含葡萄糖胺)上筛选，挑取转化子，提质粒送生物公司测序，以便确定是否正向***和有无突变。将正向***的未发生碱基突变的质粒命名为pREP-man，通过电转化法导入6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母中，得到重组S.pombe-man。

实施例9：

从-80℃冰箱取出冻存的N.crassa，接种于PDA活化培养基斜面上，静置30℃恒温培养箱中3天直至产孢丰富，在超净工作台中，8层纱布过滤，灭菌水反复冲洗PDA斜面的N.crassa成熟孢子，洗脱液即为孢子悬液，使用血球计数板计数，调节至孢子数量为1×10⁹个/mL。接着以1％接种量将N.crassa孢子悬液接到PDA培养液中，150rpm，30℃，恒温摇床培育72h，即为发酵种子液1。

从-80℃冰箱取出冻存的S.pombe-pREP-mnp和S.pombe-man在超净工作台中使用灭菌后的牙签沾取少量菌液划线于YES固体培养基上，静置30℃恒温培养箱中3天。挑取单菌落接种于YES固体培养基中，200rpm，30℃，恒温摇床培育96h，即为发酵种子液2和3；

从-80℃冰箱取出冻存的C.utilis，从斜面培养基表面挑取C.utilis单个菌落接种于液体麦芽汁培液中180rpm，30℃恒温摇床培育12h，即为发酵种子液4。

称取玉米秸秆质量为10g，添加尿素，用量分别为玉米秸秆质量的0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、和2.5％；再接种粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和产朊假丝酵母，四种菌以发酵种子液的形式接种，四种发酵种子液的总接菌量为12％(V/m，V:发酵种子液总体积，m：玉米秸秆质量)，其中粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和产朊假丝酵母的接种体积比例为2:4:4:2；固态发酵体系的总含水量为65％，分别置于250mL摇瓶中，瓶口处用8层纱布封口后121℃灭菌20min，30℃发酵2天。表5是不同浓度尿素的真蛋白含量对比图。

表5.不同浓度尿素的真蛋白含量对比图

从表5分析，当尿素添加量为0.5％时，玉米秸秆中的真蛋白达到最大值。当尿素添加过多会抑制菌体生长；另一方面，过多尿素分解会散发浓烈的氨气，铵态氮大量积累在发酵基质中，导致pH升高，所以选取0.5％的尿素添加量适宜。

称取玉米秸秆重量为10g，先添加0.5％尿素，再添加硫酸铵，用量分别为玉米秸秆质量的1％、2％、3％、4％和5％；四种发酵种子液的总接菌量为12％(V/m)，固态发酵总含水量为65％，分别置于250mL摇瓶中，瓶口处用8层纱布封口后121℃灭菌20min，30℃发酵2天。表5是不同浓度硫酸铵的真蛋白含量和木质素降解率的对比图。

表5不同添加量硫酸铵的真蛋白含量和木质素降解率的对比图

从表10中真蛋白含量分析，在硫酸铵添加量为2％时真蛋白产量最高，说明此时添加的氮源较好地促进多菌发酵过程中菌体的生长繁殖。从木质素降解率分析：当硫酸铵添加量1％到3％范围内，木质素降解率均有增加，且在氮源添加量为3％，木质素降解率最高。综合两种指标，最终选择硫酸铵的最优添加量为3％。即固态发酵过程中最佳氮源添加量为0.5％的尿素和3％硫酸铵。

实施例10：

测定菌酶协同降解玉米秸秆各成分的效果，基于以上实验结果，添加0.5％尿素和3％硫酸铵，添加终浓度0.5mM草酸和0.02％Tween-80作为复配小分子激活剂，再添加0.5％CaCl₂和0.3％MnSO₄固态发酵，不需要添加的菌液用相同体积的无菌水替代，测定玉米秸秆中木质素降解率变化。四种发酵种子液的总接菌量为12％(V/m)，固态发酵总含水量为65％，分别置于250mL摇瓶中，瓶口处用8层纱布封口后121℃灭菌20min，30℃发酵2天。表6是菌酶协同作用对玉米秸秆降解的效果对比图。

表6菌酶协同作用对玉米秸秆降解的效果对比图

从表6中发酵后玉米秸秆中木质素含量分析，组合②④和组合③⑤对比均缺少了本发明中构建的产MnP的发酵工程菌S.pombe-pREP-mnp，在相同条件下发酵后测定木质素含量明显较高，这说明本发明构建的S.pombe-pREP-mnp菌株对于玉米秸秆中木质素的降解发挥着重要的作用。组合②⑤和组合③④对比均缺少了Lac和GOD两种酶制剂的添加，从木质素的含量来看，组合②中的含量是组合⑤中的近一倍的量，这表明，Lac和GOD对木质素的降解影响较大。在最优组合⑤中，菌酶协同作用使得木质素从7.84％降至3.79％，木质素降解率为51.66％。从表6中发酵后玉米秸秆中真蛋白的含量分析，组合⑤中玉米秸秆中真蛋白从1.82％增至7.59％，对比各个组合发现随着木质素降解率的增加玉米秸秆中真蛋白含量随着增大。真蛋白提高率达到317.03％。发酵过程中木质纤维素降解后生成的糖类累积于发酵基质中形成反馈抑制，降低纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶系的活性，加入N.crassa和C.utilis后可以消耗这些糖类以供菌体的生长发育。混菌发酵过程中的菌酶协同作用转化了菌种之间对碳源的竞争，提高了发酵的效率和品质。

实施例11：

基于菌酶协同实验的结果，发酵周期为6天，每天定时取样，测定发酵时间对玉米秸秆中木质素降解的影响。表7是发酵时间对玉米秸秆中木质素降解率的对比图。

表7是发酵时间对玉米秸秆中木质素降解率的对比图

从表7分析，玉米秸秆中木质素降解率随着发酵时间是不断增加的。发酵1-3天中，木质素的降解率变化明显，降解速率较快。当发酵3天后，木质素的降解率依旧提高，但是趋于稳定，降解幅度变化较小。考虑应用到产业化过程，选择发酵3天为最适发酵时间。

实施例12：

基于以上实施案例，本发明在最优发酵条件进行固态发酵后，发酵3天后测定了发酵产物中木质纤维素和真蛋白含量变化，表8是发酵前后产物成分分析。

表8发酵前后产物成分分析

从表8分析，玉米秸秆中木质素的降解效果明显，其含量从7.83％减至3.07％，木质素降解率达60.79％；纤维素含量从40.13％降至29.90％，降解率为25.49％；半纤维素含量从35.09％减至25.40％，降解率为27.61％；真蛋白含量从1.82％增至10.19％，提高率达到459.89％。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

本发明涉及序列如下：

1.SEQ ID NO.1

1ATGGTGCGTC GTGTTACCTG CCCGGACGGT GTGAACACCG CGACCAACGC GGCGTGCTGC

61AGCCTGTTTG CGGTTCGTGA CGATATCCAG CAAAACCTGT TTGACAACGG CCAGTGCGGC

121GAGGATGTGC ACGAAAGCTT CCGTCTGAGC TTTCACGACG CGATCGGCAT TAGCCCGAAG

181ATTGCGGCGA CCGGTCAATT TGGTGGCGGT GGCGCGGATG GCAGCATCAT TCTGTTCGAG

241GAAATTGAGA CCAACTTTCA CGCGAACATC GGTGTGGACG AGATTGTTGA TGAACAGAAA

301CCGTTTATCG CGCGTCACAA CATTACCCCG GGCGACTTCA TCCAATTTGC GGCGGCGGTG

361GGCGTTAGCA ACTGCCCGGG TGCGCCGCGT CTGGACTTCT TTCTGGGTCG TCCGGCGGCG

421ACCCAGCCGG CGCCGGATAA GACCGTGCCG GAGCCGTTCG ACACCGTTGA TACCATTCTG

481GAACGTTTCG CGGATGCGGG TAACTTTACC CCGGCGGAAG TGGTTGCGCT GCTGGTTAGC

541CACACCATTG CGGCGGCGGA CGAAGTTGAT CCGACCATTC CGGGTACCCC GTTTGACAGC

601ACCCCGGAAG TGTTTGATAG CCAGTTCTTT GTTGAAACCC AACTGCGTGG TACCGGTTTT

661CCGGGTACCG CGGGTAACCA AGGTGAGGTG GAAAGCCCGC TGGCGGGTGA ACTGCGTCTG

721CAAAGCGACA GCGAACTGGC GCGTGATGCG CGTACCGCGT GCGAGTGGCA GAGCTTTGTT

781GGTAACCAGC AAAAGATCCA GACCGCGTTC AAGGCGGCGT TTCAAAAAAT GGCGGTGCTG

841GGCGTTGACA CCAGCAAAAT GGTGGATTGC AGCGAGCTGA TCCCGGTTCC GCCGGAACTG

901AAGATTACCG CGGCGCACTT CCCGGCGGGT AAAACCAACG CGGACGTTGA ACAAGCGTGC

961GCGAGCACCC CGTTTCCGAC CCTGAGCACC GATCCGGGTC CGGCGACCAG CGTGGCGCCG

1021GTTCCGCCGA GCTAA

2.SEQ ID NO.2

1MVRRVTCPDG VNTATNAACC SLFAVRDDIQ QNLFDNGQCG EDVHESFRLS FHDAIGISPK

61IAATGQFGGG GADGSIILFE EIETNFHANI GVDEIVDEQK PFIARHNITP GDFIQFAAAV

121GVSNCPGAPR LDFFLGRPAA TQPAPDKTVP EPFDTVDTIL ERFADAGNFT PAEVVALLVS

181HTIAAADEVD PTIPGTPFDS TPEVFDSQFF VETQLRGTGF PGTAGNQGEV ESPLAGELRL

241QSDSELARDA RTACEWQSFV GNQQKIQTAF KAAFQKMAVL GVDTSKMVDC SELIPVPPEL

301KITAAHFPAG KTNADVEQAC ASTPFPTLST DPGPATSVAP VPPS

3.SEQ ID NO.3

人工序列：5’-GCGTCGTATCCGCTCAGTTTATGGTGCGTCGTGTTACCTGC-3’

4.SEQ ID NO.4

人工序列：5’-TCCTTTTACCCCCCGGATCCTTAGCTCGGCGGAACCGG-3’

5.SEQ ID NO.5

人工序列：5’-GGATCCGGGGGGTAAAAGG-3’

6.SEQ ID NO.6

人工序列：5’-AAACTGAGCGGATACGACGC-3’

7.SEQ ID NO.7

人工序列：5’-ACCTGTTTGACAACGGCCAGT-3’

8.SEQ ID NO.8

人工序列：5’-TTTGAAACGCCGCCTTGAACG-3’

9.SEQ ID NO.9

1ATGCATACCG TTTACCCGGT TAACCCGAAC GCGCAGCAGA CCACCAAAGA CATCATGAAC

61TGGCTGGCGC ACCTGCCGAA CCGTTCTGAA AACCGTGCGA TGTCTGGTGC GTTCGGTGGT

121TACTCTGACG TTACCTTCTC TATGACCGAA GAAAACCGTC TGAAAAACGC GACCGGTCAG

181TCTCCGGCGA TCTACGGTTG CGACTACGGT CGTGGTTGGC TGGAAACCGC TGACATCACC

241GACACCATCG ACTACTCTTG CAACTCTTCT CTGATCTCTT ACTGGAAATC TGGTGGTCTG

301CCGCAGGTTT CTCCGCACCT GGCGAACCCG GCATTCCCGT CTGGTAACTA CAAAACCGCG

361ATCTCTAACT CTCAGTACAA AAACATCCTG GACCCGTCTA CCGTTGAAGG TAAACGTCCG

421GAAGCGCTGC TGTCTAAAAT CGCTGACGGT CTGACCCAGC TGAAAAACCA GGGTGTTACC

481GTTCTGTTCC GTCCGCTGCA CGAAATGAAC GGTGAATGGT TCTGGTGGGG TCTGACCGGT

541TACAACCAGA AAGACAACGA ACGTATCTCT CTGTACAAAG AACTGTACAA GAAAATCTAC

601CGTTACATGA CCGAAACCCG TGGTCTGGAC AACCTGCTGT GGGTTTACTC TCCGGACGCG

661AACCGTGACT TCAAAACCGA CTTCTACCCG GGTTCTTCTT ACGTTGACAT CACCGGTCTG

721GACGCGTACT TCACCGACCC GTACGCGATC TCTGGTTACG ACGAAATGCT GTCTCTGAAA

781AAACCGTTCG CGTTCGCGGA AACCGGTCCG TCTGGTAACA TCGGTTCTTT CGACTACGCA

841GCGTTCATCA ACGCGATCCG TCAGAAATAC CCGCAGACCG CGTACTTCCT GACCTGGGAC

901GAACAGCTGT CTCCGGCAGC TAACCAGGGT GCGCAGTCTC TGTACCAGAA CTCTTGGACC

961CTGAACAAAG GTGAAATCTG GAACGGTGGT TCTCTGACCC CGATCGCGGA ATAA

10.SEQ ID NO.10

1MLKKLAVCLS IILLLLGAAS PISAHTVYPV NPNAQQTTKD IMNWLAHLPN RSENRAMSGA

61FGGYSDVTFS MTEENRLKNA TGQSPAIYGC DYGRGWLETA DITDTIDYSC NSSLISYWKS

121GGLPQVSPHL ANPAFPSGNY KTAISNSQYK NILDPSTVEG KRPEALLSKI ADGLTQLKNQ

181GVTVLFRPLH EMNGEWFWWG LTGYNQKDNE RISLYKELYK KIYRYMTETR GLDNLLWVYS

241PDANRDFKTD FYPGSSYVDI TGLDAYFTDP YAISGYDEML SLKKPFAFAE TGPSGNIGSF

301DYAAFINAIR QKYPQTAYFL TWDEQLSPAA NQGAQSLYQN SWTLNKGEIW NGGSLTPIAE

11.SEQ ID NO.11

人工序列：5’-AGTATACTAGAAGCCAACCTATGCATACCGTTTACCCGGTT-3’

12.SEQ ID NO.12

人工序列：5’-GCGAATGACATCGGATTCCCTTATTCCGCGATCGGGGT-3’

13.SEQ ID NO.13

人工序列：5’-GGGAATCCGATGTCATTCGC-3’

14.SEQ ID NO.14

人工序列：5’-AGGTTGGCTTCTAGTATACTCATGTATAAA-3’

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 白囊耙齿菌(Irpex lacteus)

<400> 1

atggtgcgtc gtgttacctg cccggacggt gtgaacaccg cgaccaacgc ggcgtgctgc 60

agcctgtttg cggttcgtga cgatatccag caaaacctgt ttgacaacgg ccagtgcggc 120

gaggatgtgc acgaaagctt ccgtctgagc tttcacgacg cgatcggcat tagcccgaag 180

attgcggcga ccggtcaatt tggtggcggt ggcgcggatg gcagcatcat tctgttcgag 240

gaaattgaga ccaactttca cgcgaacatc ggtgtggacg agattgttga tgaacagaaa 300

ccgtttatcg cgcgtcacaa cattaccccg ggcgacttca tccaatttgc ggcggcggtg 360

ggcgttagca actgcccggg tgcgccgcgt ctggacttct ttctgggtcg tccggcggcg 420

acccagccgg cgccggataa gaccgtgccg gagccgttcg acaccgttga taccattctg 480

gaacgtttcg cggatgcggg taactttacc ccggcggaag tggttgcgct gctggttagc 540

cacaccattg cggcggcgga cgaagttgat ccgaccattc cgggtacccc gtttgacagc 600

accccggaag tgtttgatag ccagttcttt gttgaaaccc aactgcgtgg taccggtttt 660

ccgggtaccg cgggtaacca aggtgaggtg gaaagcccgc tggcgggtga actgcgtctg 720

caaagcgaca gcgaactggc gcgtgatgcg cgtaccgcgt gcgagtggca gagctttgtt 780

ggtaaccagc aaaagatcca gaccgcgttc aaggcggcgt ttcaaaaaat ggcggtgctg 840

ggcgttgaca ccagcaaaat ggtggattgc agcgagctga tcccggttcc gccggaactg 900

aagattaccg cggcgcactt cccggcgggt aaaaccaacg cggacgttga acaagcgtgc 960

gcgagcaccc cgtttccgac cctgagcacc gatccgggtc cggcgaccag cgtggcgccg 1020

gttccgccga gctaa 1035

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> 白囊耙齿菌(Irpex lacteus)

<400> 2

Met Val Arg Arg Val Thr Cys Pro Asp Gly Val Asn Thr Ala Thr Asn

1 5 10 15

Ala Ala Cys Cys Ser Leu Phe Ala Val Arg Asp Asp Ile Gln Gln Asn

20 25 30

Leu Phe Asp Asn Gly Gln Cys Gly Glu Asp Val His Glu Ser Phe Arg

35 40 45

Leu Ser Phe His Asp Ala Ile Gly Ile Ser Pro Lys Ile Ala Ala Thr

50 55 60

Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile Leu Phe Glu

65 70 75 80

Glu Ile Glu Thr Asn Phe His Ala Asn Ile Gly Val Asp Glu Ile Val

85 90 95

Asp Glu Gln Lys Pro Phe Ile Ala Arg His Asn Ile Thr Pro Gly Asp

100 105 110

Phe Ile Gln Phe Ala Ala Ala Val Gly Val Ser Asn Cys Pro Gly Ala

115 120 125

Pro Arg Leu Asp Phe Phe Leu Gly Arg Pro Ala Ala Thr Gln Pro Ala

130 135 140

Pro Asp Lys Thr Val Pro Glu Pro Phe Asp Thr Val Asp Thr Ile Leu

145 150 155 160

Glu Arg Phe Ala Asp Ala Gly Asn Phe Thr Pro Ala Glu Val Val Ala

165 170 175

Leu Leu Val Ser His Thr Ile Ala Ala Ala Asp Glu Val Asp Pro Thr

180 185 190

Ile Pro Gly Thr Pro Phe Asp Ser Thr Pro Glu Val Phe Asp Ser Gln

195 200 205

Phe Phe Val Glu Thr Gln Leu Arg Gly Thr Gly Phe Pro Gly Thr Ala

210 215 220

Gly Asn Gln Gly Glu Val Glu Ser Pro Leu Ala Gly Glu Leu Arg Leu

225 230 235 240

Gln Ser Asp Ser Glu Leu Ala Arg Asp Ala Arg Thr Ala Cys Glu Trp

245 250 255

Gln Ser Phe Val Gly Asn Gln Gln Lys Ile Gln Thr Ala Phe Lys Ala

260 265 270

Ala Phe Gln Lys Met Ala Val Leu Gly Val Asp Thr Ser Lys Met Val

275 280 285

Asp Cys Ser Glu Leu Ile Pro Val Pro Pro Glu Leu Lys Ile Thr Ala

290 295 300

Ala His Phe Pro Ala Gly Lys Thr Asn Ala Asp Val Glu Gln Ala Cys

305 310 315 320

Ala Ser Thr Pro Phe Pro Thr Leu Ser Thr Asp Pro Gly Pro Ala Thr

325 330 335

Ser Val Ala Pro Val Pro Pro Ser

340

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgtcgtatc cgctcagttt atggtgcgtc gtgttacctg c 41

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccttttacc ccccggatcc ttagctcggc ggaaccgg 38

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggatccgggg ggtaaaagg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaactgagcg gatacgacgc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acctgtttga caacggccag t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttgaaacgc cgccttgaac g 21

<210> 9

<211> 1014

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 9

atgcataccg tttacccggt taacccgaac gcgcagcaga ccaccaaaga catcatgaac 60

tggctggcgc acctgccgaa ccgttctgaa aaccgtgcga tgtctggtgc gttcggtggt 120

tactctgacg ttaccttctc tatgaccgaa gaaaaccgtc tgaaaaacgc gaccggtcag 180

tctccggcga tctacggttg cgactacggt cgtggttggc tggaaaccgc tgacatcacc 240

gacaccatcg actactcttg caactcttct ctgatctctt actggaaatc tggtggtctg 300

ccgcaggttt ctccgcacct ggcgaacccg gcattcccgt ctggtaacta caaaaccgcg 360

atctctaact ctcagtacaa aaacatcctg gacccgtcta ccgttgaagg taaacgtccg 420

gaagcgctgc tgtctaaaat cgctgacggt ctgacccagc tgaaaaacca gggtgttacc 480

gttctgttcc gtccgctgca cgaaatgaac ggtgaatggt tctggtgggg tctgaccggt 540

tacaaccaga aagacaacga acgtatctct ctgtacaaag aactgtacaa gaaaatctac 600

cgttacatga ccgaaacccg tggtctggac aacctgctgt gggtttactc tccggacgcg 660

aaccgtgact tcaaaaccga cttctacccg ggttcttctt acgttgacat caccggtctg 720

gacgcgtact tcaccgaccc gtacgcgatc tctggttacg acgaaatgct gtctctgaaa 780

aaaccgttcg cgttcgcgga aaccggtccg tctggtaaca tcggttcttt cgactacgca 840

gcgttcatca acgcgatccg tcagaaatac ccgcagaccg cgtacttcct gacctgggac 900

gaacagctgt ctccggcagc taaccagggt gcgcagtctc tgtaccagaa ctcttggacc 960

ctgaacaaag gtgaaatctg gaacggtggt tctctgaccc cgatcgcgga ataa 1014

<210> 10

<211> 360

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 10

Met Leu Lys Lys Leu Ala Val Cys Leu Ser Ile Ile Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ser Pro Ile Ser Ala His Thr Val Tyr Pro Val Asn Pro

20 25 30

Asn Ala Gln Gln Thr Thr Lys Asp Ile Met Asn Trp Leu Ala His Leu

35 40 45

Pro Asn Arg Ser Glu Asn Arg Ala Met Ser Gly Ala Phe Gly Gly Tyr

50 55 60

Ser Asp Val Thr Phe Ser Met Thr Glu Glu Asn Arg Leu Lys Asn Ala

65 70 75 80

Thr Gly Gln Ser Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Gly Arg Gly Trp

85 90 95

Leu Glu Thr Ala Asp Ile Thr Asp Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Asn Ser

100 105 110

Ser Leu Ile Ser Tyr Trp Lys Ser Gly Gly Leu Pro Gln Val Ser Pro

115 120 125

His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Pro Ser Gly Asn Tyr Lys Thr Ala Ile

130 135 140

Ser Asn Ser Gln Tyr Lys Asn Ile Leu Asp Pro Ser Thr Val Glu Gly

145 150 155 160

Lys Arg Pro Glu Ala Leu Leu Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu Thr Gln

165 170 175

Leu Lys Asn Gln Gly Val Thr Val Leu Phe Arg Pro Leu His Glu Met

180 185 190

Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Asp

195 200 205

Asn Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Ile Tyr Arg

210 215 220

Tyr Met Thr Glu Thr Arg Gly Leu Asp Asn Leu Leu Trp Val Tyr Ser

225 230 235 240

Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ser

245 250 255

Tyr Val Asp Ile Thr Gly Leu Asp Ala Tyr Phe Thr Asp Pro Tyr Ala

260 265 270

Ile Ser Gly Tyr Asp Glu Met Leu Ser Leu Lys Lys Pro Phe Ala Phe

275 280 285

Ala Glu Thr Gly Pro Ser Gly Asn Ile Gly Ser Phe Asp Tyr Ala Ala

290 295 300

Phe Ile Asn Ala Ile Arg Gln Lys Tyr Pro Gln Thr Ala Tyr Phe Leu

305 310 315 320

Thr Trp Asp Glu Gln Leu Ser Pro Ala Ala Asn Gln Gly Ala Gln Ser

325 330 335

Leu Tyr Gln Asn Ser Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Trp Asn Gly

340 345 350

Gly Ser Leu Thr Pro Ile Ala Glu

355 360

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agtatactag aagccaacct atgcataccg tttacccggt t 41

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcgaatgaca tcggattccc ttattccgcg atcggggt 38

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggaatccga tgtcattcgc 20

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aggttggctt ctagtatact catgtataaa 30

Claims

1.一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因；

(3)协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料：首先将步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌与粗糙脉胞菌、重组S.pombe-man和产朊假丝酵母混合，并添加氮源、CaCl₂、MnSO₄、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行菌酶协同混菌发酵玉米秸秆；并控制所有物质组成的发酵体系的含水量；所述的重组S.pombe-man发酵菌株是将来源于枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因序列，根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化后导入粟酒裂殖酵母中，构建的一株重组甘露聚糖酶酵母工程菌，记为S.pombe-man。

2.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组穿梭质粒为pREP-mnp；所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母。

4.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和产朊假丝酵母的总接菌量为1％-15％；所述粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和产朊假丝酵母的接种体积比例为2:4:4:2；整个发酵体系中的总含水量为50％-70％。

5.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的氮源由尿素和硫酸铵组成，其中尿素的用量为玉米秸秆质量的0.5％-1％，硫酸铵的用量为玉米秸秆质量的1％-4％；所述CaCl₂的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％，MnSO₄的用量为玉米秸秆质量的0.1％-0.7％，葡萄糖氧化酶的用量为玉米秸秆质量的0.2％-0.6％，漆酶的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％。

6.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述漆酶的酶活力为10 000U/g，葡萄糖氧化酶的酶活力为200U/g；所述小分子物质激活剂为草酸和Tween-80；所述草酸在发酵体系中的终浓度为0.2-1mM，复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为玉米秸秆质量的0.02％。

7.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵的温度为26-37℃，发酵时间为2-4天。

8.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌还可应用于酶解玉米秸秆木质素的用途，具体步骤如下：培养步骤(2)中所述的重组酵母工程菌，得到菌液，离心收集粗酶液，粗酶液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；并添加CaCl₂、MnSO₄、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解玉米秸秆木质素。

9.根据权利要求8所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，所述重组锰过氧化物酶在酶解过程中的适宜反应温度为20～50℃，适宜pH为2.0～4.0。

10.根据权利要求8所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，所述玉米秸秆与粗酶液的料液比为0.5-5:1；所述CaCl₂的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％，MnSO₄的用量为玉米秸秆质量的0.1％-0.7％，葡萄糖氧化酶的用量为玉米秸秆质量的0.2％-0.6％，漆酶的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％；所述漆酶的酶活力为10000U/g，葡萄糖氧化酶的酶活力为200U/g；所述小分子物质激活剂由草酸和Tween-80组成；所述草酸在酶解体系中的终浓度为0.2-1mM；复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为玉米秸秆质量的0.02％。