CN115820702A - 一种重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇高效制备冷杉醇的方法 - Google Patents

Abstract

冷杉醇降解产生龙涎香香气物质，可改善烟草香味品质，广泛应用于香料工业。本发明开发了一种低成本、高效的静息细胞催化制备冷杉醇新方法。通过敲除去磷酸化酶编码基因phoA、ybjG、pgpB及外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ，组成型过表达脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR和甘油代谢操纵子基因glpFK，过表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ‑异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当‑13‑烯‑8‑醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶获得重组大肠杆菌。采用静息细胞催化工艺可于24h催化3.0g/L异戊烯醇生成1.80g/L冷杉醇，转化率达71.15％，远高于目前文献及专利报道水平。静息细胞可重复使用5‑6次，操作简单、经济性好，相比发酵法有更佳的规模制备冷杉醇潜力。

Description

一种重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇高效制备冷杉醇的 方法

技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇高效制备冷杉醇的方法，属于生物工程领域。

背景技术

萜类物质是普遍存在的植物次生代谢物，也是烟草最重要的一类致香组分。尤其是烟草中二萜烯醇类化合物——主要包括西柏烯醇类与赖百当醇类化合物，对于烟草的香气品质具有重要影响；其含量差异与不同类型烟草的品质特征具有显著相关性，且其降解产物均是代表性的烟草香味物质。在香料烟中，赖百当类是常见二萜烯醇化合物，其中顺-冷杉醇是大部分香料烟和部分雪茄烟中特有的香气前体物，对烟草香气特征具有重要作用，其降解产生强烈龙涎香香气的物质，对增加卷烟香气和吸味非常有效，与烟草的特征香韵谐调和合，并可掩盖杂气，即使微量使用，也可改善烟草的香味品质，尤其适合混合型卷烟加香，常用于卷烟浸膏。顺-冷杉醇作为琥珀样龙涎香的半合成前体物，因其优美的香气、良好的定香效果及对烟气质量的影响，被广泛应用于香料工业。目前烟草特征香味前体物质冷杉醇多采用提取法，以富含冷杉醇烟叶中提取而来，而冷杉醇在烟叶中含量较低，同时受制于烟草原料的获得，成为制约提取法大规模应用的瓶颈。近年来，随着合成生物学迅速发展，微生物发酵法成为冷杉醇合成研究热点，前已有文献及专利报道以葡萄糖或甘油为底物通过微生物发酵法生物合成冷杉醇。但受制于底物甘油或葡萄糖做为底物同时参与细胞多个反应，尽管强化了冷杉醇异源合成途径和前体物供给，但合成效率依然较低。Li等通过强化冷杉醇异源合成途径和前体物供给，在1.3L发酵罐中发酵培养工程菌株约100h，冷杉醇产量～634.7mg/L(Li.etal.(2019).Combinatorial Engineering of MevalonatePathway and Diterpenoid Synthases in Escherichia coli for cis-AbienolProduction.Journal of Agricultural and Food Chemistry,67(23),6523-6531.)。Cheng等同样通过强化前体物供给获得了工程菌株，发酵培养52h冷杉醇产量～220mg/L，产量较低(Cheng.et al.(2020).Improved cis-Abienol production through increasingprecursor supply in Escherichia coli.Scientific Reports,10(1),16791)。Zhang等以异戊烯醇为底物生物发酵合成冷杉醇，在1.3L发酵罐中进行发酵约144h，转化底物6.8g/L异戊烯醇合成1375.7mg/L冷杉醇，产量大幅提升，但整体发酵时间过长，且底物转化率仅为24.1％(Zhang.et al.(2022).Engineering Escherichia coli for effective andeconomic production of cis-abienol by optimizing isopentenol utilizationpathway.Journal of Cleaner Production,351)。因此目前微生物发酵法合成冷杉醇产率仍较低，合成水平不够理想。由于发酵过程采用有机相对发酵体系进行萃取，其萃取产物会掺杂除冷杉醇外大量来自于发酵液中脂溶性物质(如培养基中脂溶性成分、脂溶性细胞内含物、脂溶性细胞代谢产物等)，这对后续分离纯化及应用带来困难。因此，亟待开发一种产率高、成本低且具有高效率的冷杉醇合成方法。

静息细胞生物催化已被广泛应用于多种高附加值化学品的合成，该方法利用了细胞内完整的多酶体系实现生物转化。相对于发酵法来说具有如下优点：首先，静息细胞比发酵法具有更好的可操作性和经济性；其次，静息细胞具有更好的稳定性，可以重复使用进行多次生物转化，活性损失小，还可以采用固定化细胞形式进行催化，进一步节省生产成本；最后，静息细胞对底物和产物的耐受性高于发酵法。特别地，冷杉醇合成代谢途径存在对细胞有较强毒性的中间代谢产物(如异戊烯基二磷酸(IPP)、法呢基二磷酸(FPP))，影响菌株生长，不利于冷杉醇发酵法合成。而静息细胞将菌株培养阶段与冷杉醇催化合成阶段分开，避免了毒性底物、中间代谢产物对菌株的生长抑制。这些特性表明，静息细胞生物催化比发酵法更适合冷杉醇的规模制备。本发明创新的提出了静息细胞生物催化高效制备冷杉醇的新方法。

发明内容

针对现有发酵法合成冷杉醇的方法所存在的问题，如发酵周期长，低收率，分离纯化步骤繁琐等问题，本发明的目的是提供一种利用重组大肠杆菌静息细胞的制备方法。

还提供一种利用得到的重组大肠杆菌静息细胞生物催化异戊烯醇高效制备冷杉醇的方法，该方法具有静息细胞可循环使用、工艺简单、生产成本低和转化率高等优点。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种重组大肠杆菌静息细胞的制备方法，敲除大肠杆菌宿主中磷酸酶编码基因phoA、ybjG、pgpB及外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ，脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR的组成型过表达，甘油代谢操纵子基因glpFK的组成型过表达，构建大肠杆菌工程菌株LSC-06；在所述大肠杆菌工程菌株LSC-06的基础上构建共表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的大肠杆菌工程菌株LSC-07；对大肠杆菌工程菌株LSC-07进行培养获得重组大肠杆菌静息细胞。

所述大肠杆菌工程菌株LSC-06的构建方法为：

(1)碱性磷酸酶编码基因phoA的敲除：

以Escherichia coli C41(DE3)基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除phoA基因的大肠杆菌工程菌株LSC-01；

(2)十一异戊酸二磷酸酶编码基因ybjG的敲除：

以大肠杆菌工程菌株LSC-01基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除ybjG基因的大肠杆菌工程菌株LSC-02；

(3)磷脂酰甘油磷酸酯酶编码基因pgpB的敲除；

以大肠杆菌工程菌株LSC-02基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除pgpB基因的大肠杆菌工程菌株LSC-03；

(4)外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ的敲除

以大肠杆菌工程菌株LSC-03基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除nlpⅠ基因的大肠杆菌工程菌株LSC-04；

(5)脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR的组成型过表达

以大肠杆菌工程菌株LSC-04基因组为模板，设计供体DNA，构建置换脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR启动子为组成型强启动子P_tac的大肠杆菌工程菌株LSC-05；

(6)甘油代谢操纵子glpFK的组成型过表达

以大肠杆菌工程菌株LSC-05基因组为模板，设计供体DNA，构建甘油激酶编码基因glpFK启动子为组成型强启动子P_tac的大肠杆菌工程菌株LSC-06。

所述大肠杆菌工程菌株LSC-07的构建方法为：

(1)构建含有羟乙基噻唑激酶编码基因EcThiM和异戊烯基磷酸激酶MthIPK的重组表达载体pCTI；

(2)构建含有双功能二磷酸法呢基合酶编码基因ScERG20、异戊烯基二磷酸δ-异构酶编码基因ScIDI和香叶基香叶基二磷酸合酶编码基因TcGGPPS的重组表达载体pAEIG；

(3)构建含有赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶编码基因CcCLS和冷杉醇合酶编码基因NtABS的重组表达载体pRCA；

(4)通过质粒共转化的方式，将步骤(1)-(3)中构建的重组表达载体pCTI、pAEIG、pRCA，共同转入要求1所述的大肠杆菌工程菌株LSC-06，构建同时表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的大肠杆菌工程菌株LSC-07。

利用所述制备方法得到的重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇制备冷杉醇的方法。

在100mL催化反应体系中，分别加入终浓度为1.0-5.0g/L的异戊烯醇、20-200g/L的重组大肠杆菌静息细胞、0-40g/L甘油，添加20mM pH 7.0PB缓冲液至体积为100mL，最后添加占反应体系总体积10-20％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯；25℃催化反应12-24h，合成冷杉醇。

在100mL催化反应体系中添加终浓度为10-40g/L的甘油。

在100mL催化反应体系中分别加入终浓度为3.0g/L异戊烯醇、100g/L的重组大肠杆菌静息细胞、20g/L甘油，添加20mM pH 7.0PB缓冲液至体积为100mL，最后添加占反应体系总体积10％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯；25℃催化24h，合成冷杉醇。

反应结束后重组大肠杆菌静息细胞经离心回收，进行重复使用。

所述的重组大肠杆菌静息细胞的制备方法在催化异戊烯醇制备冷杉醇中的应用。

本发明有益效果：

由于大肠杆菌宿主基因组存在的phoA、ybjG、pgpB基因分别编码了碱性磷酸酶、十一异戊酸二磷酸酶和磷脂酰甘油磷酸酯酶，均为具有宽底物谱的去磷酸化活性，可催化冷杉醇合成途径重要中间代谢产物GPP(香叶基二磷酸)、FPP(法呢基二磷酸)、GGPP(香叶基香叶基二磷酸)发生去磷酸化反应，分别生成香叶醇(geraniol)、法呢醇(farnesol)、香叶基香叶醇(geranylgeraniol)。在静息细胞催化冷杉醇生物合成中，会降低底物转化冷杉醇得率。因此，本发明敲除上述去磷酸化活性酶编码基因phoA、ybjG、pgpB，构建上述基因敲除工程菌株。

由于产物冷杉醇脂溶性强，因此对宿主细胞膜相关编码基因进行基因修饰：对外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ进行敲除和置换脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR启动子为组成型强启动子P_tac，增强细胞膜脂溶性，提升对底物异戊烯醇和产物冷杉醇毒性耐受能力；强化宿主细胞膜外膜囊泡合成，提升宿主对底物和产物的跨膜运输，有利于降低冷杉醇对催化反应的产物抑制。

由于冷杉醇合成途径需要消耗ATP，在催化反应体系中加入甘油能增强静息细胞ATP合成能力，满足冷杉醇催化合成过程对ATP的需求，因此对宿主甘油代谢途径关键操纵子基因glpFK进行基因修饰：大肠杆菌glpFK操纵子编码甘油转运蛋白(GlpF)和甘油激酶(GlpK)。胞外甘油在甘油转运蛋白GlpF协助下被动运输进入胞内，并在甘油激酶GlpK作用下生成甘油-3-磷酸，并进一步脱氢生成二羟丙酮磷酸，从而进入糖酵解途径和三羧酸循环，并进行有氧氧化产生ATP(每1mol甘油理论上可合成18.5molATP)。因此选择将甘油代谢途径关键操纵子基因glpFK启动子置换为组成型强启动子P_tac，强化宿主代谢甘油生成ATP的能力，满足冷杉醇合成对ATP的能量需求，提升冷杉醇合成效率。

本发明首先构建了敲除多个宽底物谱去磷酸化活性酶的大肠杆菌宿主菌E.coliC41(DE3)，并构建共表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的大肠杆菌工程菌，进行发酵获得静息细胞，用于催化异戊烯醇制备冷杉醇。

本发明催化途径包括：由羟乙基噻唑激酶消耗ATP(甘油代谢提供)将底物异戊烯醇转化为二甲基烯丙基单磷酸(DMAP)；由异戊烯基磷酸激酶消耗ATP将DMAP转化为二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)；由异戊烯基二磷酸δ-异构酶将DMAPP异构化为异戊烯基二磷酸(IPP)；由双功能二磷酸法呢基合酶催化DMAPP和IPP生成香叶基二磷酸(GPP)和法呢基二磷酸(FPP)；由香叶基香叶基二磷酸合酶将FPP和IPP催化生成香叶基香叶基二磷酸(GGPP)；由赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶将GGPP转化为顺式冷杉醇(cis-Abienol)(图1)。

本发明采用静息细胞催化工艺，可在24h内催化3.0g/L底物异戊烯醇，生成冷杉醇1.80g/L，转化率高达71.15％，远高于目前文献及专利报道转化率水平。静息细胞培养对营养要求低，培养时间短，制备容易；催化时间相比发酵法大幅缩短，合成效率高；静息细胞对底物异戊烯醇和产物冷杉醇毒性有更好的耐受能力，产物浓度高；因此，相比发酵法，静息细胞催化在冷杉醇规模制备有更佳的应用潜力。

附图说明

图1为本发明的静息细胞催化异戊烯醇合成冷杉醇示意图。

图2为大肠杆菌宿主菌E.coliC41(DE3)的基因phoA、ybjG、pgpB、nlpⅠ敲除成功以及fadR、glpFK基因启动子置换成功的琼脂糖凝胶电泳图。

其中，A-F分别为基因phoA、ybjG、pgpB、nlpⅠ敲除成功以及fadR、glpFK基因启动子置换成功的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为重组表达载体PCTI(A)、PAEIG(B)、PRCA(C)的图谱。

图4为不同甘油浓度对冷杉醇合成产量的影响。

图5为不同静息细胞浓度对冷杉醇合成产量的影响。

图6为不同底物浓度对冷杉醇合成产量的影响。

图7为冷杉醇标准品以及样品液相色谱图(冷杉醇出峰时间为18.74min)。

图8为静息细胞重复使用效果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。如无特别说明，实施例中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备；涉及试剂均为市售常规试剂；涉及试验方法均为常规方法；涉及基因以及引物合成由苏州金唯智公司完成；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PCR酶等来自Takara公司。

本领域已知的各种大肠杆菌菌株均可用作本发明的出发菌株，例如E.coli C41(DE3)、E.coli BL21(DE3)、E.coli C43(DE3)等。本发明实施例大肠杆菌出发菌株为E.coliC41(DE3)。

实施例1碱性磷酸酶phoA的敲除

利用pEcCas/pEcgRNA系敲除大肠杆菌宿主中碱性磷酸酶编码基因phoA基因，构建质粒pEcgRNA-phoA，其目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA的断裂。

具体方法为：

(1)使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列。选择靶序列：TGCTGATTGGCGATGGGATGGGG(SEQ 1)。质粒pEcgRNA用BsaI酶切，产生带有5‘-TAGT-3’和5‘-AAAC-3’悬突的线性化pEcgRNA。

合成寡核苷酸上游引物phoA-UP

(5‘-TAGTTGCTGATTGGCGATGGGATG-3’，SEQ 2)和下游引物phoA-DN(5‘-AAACCATCCCATCGCCAATCAGCA-3’，SEQ 3)，在由ddH₂O 35μL、T4连接酶缓冲液5μL、phoA-UP 5μL和phoA-DN 5μL组成的反应混合物中退火。

将上述退火后的双链DNA(phoA-UP和phoA-DN)稀释200倍，将稀释后的双链DNA 1μL与BsaI线性化的pEcgRNA 1μL在T4连接酶缓冲液2μL和T4连接酶1μL以及ddH₂O 15μL的混合液中16℃连接1h，将连接产物转化到DH5α中，筛选出质粒pEcgRNA-phoA。在含有50μg/mL奇霉素的LB平板上筛选连接成功的阳性克隆。

(2)供体DNA设计：以E.coli C41(DE3)基因组为模板，设计上下游同源臂扩增引物，上、下同源臂各设计在400-500bp左右。分别扩增上、下游同源臂，纯化并回收。以上游同源臂的上游引物(PhoA-F-F)和下游同源臂的下游引物(PhoA-B-R)，上述回收后的上、下游同源臂为模板，进行PCR反应，PCR条件为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。得到供体DNA片段。上述提到的引物设计如下：

PhoA-F-F:AGTTGTTATTTAAGCTTGCC(SEQ 4)

PhoA-F-R:ACTGCGCCATCTTTGGTATTTTCTGATCACCCGTTAAGCG(SEQ 5)

PhoA-B-F:CGCTTAACGGGTGATCAGAAAATACCAAAGATGGCGCAGT(SEQ 6)

PhoA-B-R:AGGCAATCACTCATGTAGGTCT(SEQ 7)

(3)将pEcgRNA-phoA质粒和供体DNA片段共电转化至含有pEcCas质粒的E.coliC41(DE3)的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL奇霉素的SOB平板上，37℃过夜培养。用菌落PCR筛选阳性重组子(图2A)，保存菌株。

将上述筛选出的阳性重组子置于含有10mM鼠李糖和50μg/mL卡那霉素的LB培养基中过夜培养，目的是消除gRNA质粒。吸取1μL过夜培养的菌液转接至1mL无抗性的LB液体培养基中，混匀后，吸取50μL菌液涂布于含有卡那抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有卡那霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选奇霉素平板不生长、卡那霉素平板生长的单菌落，保存菌株。

将培养好的菌落接种于含葡萄糖(5g/L)的LB液体培养基中，37℃过夜培养，然后将大约10μL过夜培养的菌液，涂在含有葡萄糖(5g/L)和蔗糖(10g/L)的LB平板上，在37℃下培养过夜，然后随机挑选单个菌落并筛选。对点在含有和不含有卡那霉素的LB平板上，被消除质粒pEcCas的菌落在卡那霉素平板上不生长。筛选得到敲除phoA基因的菌株LSC-01。

实施例2十一异戊酸二磷酸酶ybjG的敲除

(1)使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列。选择靶序列：ATTCCCAAGCGATCACGGTACGG(SEQ 8)。质粒pEcgRNA用BsaI酶切，产生带有5‘-TAGT-3’和5‘-AAAC-3’悬突的线性化pEcgRNA。

合成寡核苷酸ybjG-UP(5‘-TAGTATTCCCAAGCGATCACGGTA-3’，SEQ 9)和ybjG-DN(5‘-AAACTACCGTGATCGCTTGGGAAT-3’，SEQ 10)，并在由ddH₂O 35μL、T4连接酶缓冲液5μL、ybjG-UP 5μL和ybjG-DN 5μL组成的反应混合物中退火。

将退火后的双链DNA(ybjG-UP和ybjG-DN)稀释200倍，将稀释后的双链DNA1μL与BsaI线性化的pEcgRNA1μL在T4连接酶缓冲液2μL和T4连接酶1μL以及ddH₂O 15μL的混合液中16℃连接1h，将连接产物转化到DH5α中，筛选出质粒pEcgRNA-ybjG。在含有50μg/mL奇霉素的LB平板上筛选连接成功的阳性克隆。

(2)供体DNA设计:以菌株LSC-01的基因组为模板，设计上下游同源臂扩增引物，上、下同源臂各设计在400-500bp左右。分别扩增上、下游同源臂，纯化并回收。以上游同源臂的上游引物(ybjG-F-F)和下游同源臂的下游引物(ybjG-B-R)，上述回收后的上、下游同源臂为模板，进行PCR反应，PCR条件为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。得到供体DNA片段。上述提到的引物设计如下：

ybjG-F-F:TATTGTTCCACCACGGCCAA(SEQ 11)

ybjG-F-R:CGGATCGGTAATGCAAAACAGAACGAGATCATCCACGGAG(SEQ 12)

ybjG-B-F:CTCCGTGGATGATCTCGTTCTGTTTTGCATTACCGATCCG(SEQ 13)

ybjG-B-R:GGTTTCTCTTTCAGCGCCAGA(SEQ 14)

(3)将pEcgRNA-ybjG质粒和供体DNA片段共电转化至含有pEcCas质粒的工程菌株LSC-01的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL奇霉素的SOB平板上，37℃过夜培养。用菌落PCR筛选阳性重组子(图2B)，保存菌株。后续质粒消除具体实施方法，参照实施例1，最终得到工程菌株LSC-02。

实施例3磷脂酰甘油磷酸酯酶编码基因pgpB的敲除

(1)使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列。选择靶序列：CTGAAACTGTCACCCAGCCCTGG(SEQ 15)。质粒pEcgRNA用BsaI酶切，产生带有5‘-TAGT-3’和5‘-AAAC-3’悬突的线性化pEcgRNA。

合成寡核苷酸pgpB-UP(5‘-TAGTCTGAAACTGTCACCCAGCCC-3’，SEQ 16)和pgpB-DN(5‘-AAACGGGCTGGGTGACAGTTTCAG-3’，SEQ 17)，并在由ddH₂O、T4连接酶缓冲液、pgpB-UP和pgpB-DN组成的反应混合物中退火。

将退火后的双链DNA(pgpB-UP和pgpB-DN)稀释200倍，将稀释后的双链DNA 1μL与BsaI线性化的pEcgRNA 1μL在T4连接酶缓冲液2μL和T4连接酶1μL以及ddH₂O 15μL的混合液中16℃连接1h，将连接产物转化到DH5α中，，筛选出质粒pEcgRNA-pgpB。在含有50μg/mL奇霉素的LB平板上筛选阳性克隆。

(2)供体DNA设计：以菌株LSC-02的基因组为模板，设计上下游同源臂扩增引物，上、下同源臂各设计在400-500bp左右。分别扩增上、下游同源臂，纯化并回收。以上游同源臂的上游引物(pgpB-F-F)和下游同源臂的下游引物(pgpB-B-R)，上述回收后的上、下游同源臂为模板，进行PCR反应，PCR条件为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。得到供体DNA片段。上述提到的引物设计如下：

pgpB-F-F:GAGCTGGAAGCCACAATCGC(SEQ 18)

pgpB-F-R:TTCCGCAGGTGGTGTTAATGATCCATACGGCTACTGGCAT(SEQ 19)

pgpB-B-F:ATGCCAGTAGCCGTATGGATCATTAACACCACCTGCGGAA(SEQ 20)

pgpB-B-R:CCAGTCGCTTTATTTTACGTTC(SEQ 21)

(3)将pEcgRNA-pgpB质粒和供体DNA片段共电转化至含有pEcCas质粒的工程菌株LSC-02的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL奇霉素的SOB平板上，37℃过夜培养。用菌落PCR筛选阳性重组子(图2C)，保存菌株。后续质粒消除具体实施方法，参照实施例1，最终得到工程菌株LSC-03。

实施例4外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ的敲除

(1)使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列。选择靶序列：GCGTAAAAGTGAAGTCCTCGCGG(SEQ 22)。质粒pEcgRNA用BsaI酶切，产生带有5‘-TAGT-3’和5‘-AAAC-3’悬突的线性化pEcgRNA。

合成寡核苷酸nlpⅠ-UP(5‘-TAGTGCGTAAAAGTGAAGTCCTCG-3’，SEQ 23)和nlpⅠ-DN(5‘-AAACCGAGGACTTCACTTTTACGC-3’，SEQ 24)，并在由ddH₂O、T4连接酶缓冲液、nlpⅠ-UP和nlpⅠ-DN组成的反应混合物中退火。

将退火后的双链DNA(nlpⅠ-UP和nlpⅠ-DN)稀释200倍，将稀释后的双链DNA 1μL与BsaI线性化的pEcgRNA1μL在T4连接酶缓冲液2μL和T4连接酶1μL以及ddH₂O 15μL的混合液中16℃连接1h，将连接产物转化到DH5α中，，筛选出质粒pEcgRNA-nlpⅠ。在含有50μg/mL奇霉素的LB平板上筛选阳性克隆。

(2)供体DNA设计：以菌株LSC-03的基因组为模板，设计上下游同源臂扩增引物，上、下同源臂各设计在400-500bp左右。分别扩增上、下游同源臂，纯化并回收。以上游同源臂的上游引物(nlpⅠ-F-F)和下游同源臂的下游引物(nlpⅠ-B-R)，上述回收后的上、下游同源臂为模板，进行PCR反应，PCR条件为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。得到供体DNA片段。上述提到的引物设计如下：

nlpⅠ-F-F:AAATCGAAGTGGGCCGCGTCT(SEQ 25)

nlpⅠ-F-R:GCGATAATTCCAACAATGCGTCGCAACGAAACACCAGCGCAAA(SEQ 26)

nlpⅠ-B-F:TTTGCGCTGGTGTTTCGTTGCGACGCATTGTTGGAATTATCGC(SEQ 27)

nlpⅠ-B-R:TGCCAGCACCAGAATCTGT(SEQ 28)

(3)将pEcgRNA-nlpⅠ质粒和供体DNA片段共电转化至含有pEcCas质粒的工程菌株LSC-03的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL奇霉素的SOB平板上，37℃过夜培养。用菌落PCR筛选阳性重组子(图2D)，保存菌株。后续质粒消除具体实施方法，参照实施例1，最终得到工程菌株LSC-04。

实施例5置换脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR启动子为组成型强启动子P_tac

(1)使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列。选择靶序列：TATCAGCGTAGTTAGCCCTCTGG(SEQ 29)。质粒pEcgRNA用BsaI酶切，产生带有5‘-TAGT-3’和5‘-AAAC-3’悬突的线性化pEcgRNA。

合成寡核苷酸fadR-UP(5‘-TAGTTATCAGCGTAGTTAGCCCTC-3’，SEQ 30)和fadR-DN(5‘-AAACGAGGGCTAACTACGCTGATA-3’，SEQ 31)，并在由ddH₂O、T4连接酶缓冲液、fadR-UP和fadR-DN组成的反应混合物中退火。

将退火后的双链DNA(fadR-UP和fadR-DN)稀释200倍，将稀释后的双链DNA 1μL与BsaI线性化的pEcgRNA1μL在T4连接酶缓冲液2μL和T4连接酶1μL以及ddH₂O 15μL的混合液中16℃连接1h，将连接产物转化到DH5α中，筛选出质粒pEcgRNA-P_tac-fadR。在含有50μg/mL奇霉素的LB平板上筛选阳性克隆。

(2)供体DNA设计：以菌株LSC-04的基因组为模板，设计上下游同源臂扩增引物，上、下同源臂各设计在400-500bp左右。分别扩增上、下游同源臂，纯化并回收。以上游同源臂的上游引物(P_tac-fadR-F-F)和下游同源臂的下游引物(P_tac-fadR-B-R)，上述回收后的上、下游同源臂为模板，进行PCR反应，PCR条件为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。得到供体DNA片段。上述提到的引物设计如下：

P_tac-fadR-F-F:CTTCGATAGCCAACAGACCAC(SEQ 32)

P_tac-fadR-F-R:TAACCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCACAAAAAGAAGAAAAAGGGA(SEQ 33)

P_tac-fadR-B-F:CATCGGCTCGTATAATGTGTGGTTAGAAAGGTGTGTTTCACATATGGTCATTAAGGCGCAAA(SEQ 34)

P_tac-fadR-B-R:GATCGGCCACTTCATTAGC(SEQ 35)

(3)将pEcgRNA-fadR质粒和供体DNA片段共电转化至含有pEcCas质粒的工程菌株LSC-04的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL奇霉素的SOB平板上，37℃过夜培养。用菌落PCR筛选阳性重组子(图2E)，保存菌株。后续质粒消除具体实施方法，参照实施例1，最终得到工程菌株LSC-05。

实施例6置换甘油激酶编码基因glpFK启动子为组成型强启动子P_tac

(1)使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列。选择靶序列：CAGCATGCCTACAAGCATCGTGG(SEQ 36)。质粒pEcgRNA用BsaI酶切，产生带有5‘-TAGT-3’和5‘-AAAC-3’悬突的线性化pEcgRNA。

合成寡核苷酸glpFK-UP(5‘-TAGTCAGCATGCCTACAAGCATCG-3’，SEQ 37)和glpFK-DN(5‘-AAACCGATGCTTGTAGGCATGCTG-3’，SEQ 38)，并在由ddH₂O、T4连接酶缓冲液、glpFK-UP和glpFK-DN组成的反应混合物中退火。

将退火后的双链DNA(glpFK-UP和glpFK-DN)稀释200倍，将稀释后的双链DNA 1μL与BsaI线性化的pEcgRNA 1μL在T4连接酶缓冲液2μL和T4连接酶1μL以及ddH₂O 15μL的混合液中16℃连接1h，将连接产物转化到DH5α中，筛选出质粒pEcgRNA-P_tac-glpFK。在含有50μg/mL奇霉素的LB平板上筛选阳性克隆。

(2)供体DNA设计：以菌株LSC-05的基因组为模板，设计上下游同源臂扩增引物，上、下同源臂各设计在400-500bp左右。分别扩增上、下游同源臂，纯化并回收。以上游同源臂的上游引物(P_tac-glpFK-F-F)和下游同源臂的下游引物(P_tac-glpFK-B-R)，上述回收后的上、下游同源臂为模板，进行PCR反应，PCR条件为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。得到供体DNA片段。上述提到的引物设计如下：

P_tac-glpFK-F-F:TCTTCGCGCTGATGCTGGG(SEQ 39)

P_tac-glpFK-F-R:TAACCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCTCGTCATAAAATGAGCGTTA(SEQ 40)

P_tac-glpFK-B-F:CATCGGCTCGTATAATGTGTGGTTAGAAAGGTGTGTTTCACATATGAGTCAAACATCAACCT(SEQ 41)

P_tac-glpFK-B-R:GCACAAAATTGATATGAGGA(SEQ 42)

(3)将pEcgRNA-glpFK质粒和供体DNA片段共电转化至含有pEcCas质粒的工程菌株LSC-04的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL奇霉素的SOB平板上，37℃过夜培养。用菌落PCR筛选阳性重组子(图2F)，保存菌株。后续质粒消除具体实施方法，参照实施例1，最终得到工程菌株LSC-06。

实施例7重组表达载体pCTI的构建

本实施例中羟乙基噻唑激酶编码基因EcThiM，来自E.coli K-12W3110；使用一对引物(EcThiM-F、EcThiM-R)对E.coli K-12W3110基因组DNA进行PCR，获得EcThiM片段。

其中，引物EcThiM-F：5’-ATGGATCCGCAAGTCGACCTGCTGGGTTC-3’(SEQ 43)；EcThiM-R：5’-CATAAGCTTTCATGCCTGCACCTCCTGCGT-3’(SEQ 44)，包含酶切位点BamHI和HindⅢ。

异戊烯基磷酸激酶编码基因MthIPK来自Methanothermobacterthermautotrophicus str.Delta H；使用一对引物(MthIPK-F、MthIPK-R)通过对实验室保存质粒pUC57-MthIPK进行PCR，获得MthIPK片段。

其中，引物MthIPK-F：5’-ATATGATTATTCTGAAACTGGGCGG-3’(SEQ 45)和MthIPK-R：5’-TCTACTCGAGTTAATGTTTGCCGGTAAT-3’(SEQ 46)，包含酶切位点NdeI和XhoI。

上述基因的PCR条件均为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用1％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒回收目的条带片段用于重组表达载体的构建。

使用限制性内切酶BamHI、HindⅢ、NdeI和XhoI，以及T4 DNA连接酶对质粒pCDuet-1以及上述片段进行酶切和连接操作，获得表达载体pCTI(图3A)。

实施例8重组表达载体pAEIG的构建

本实施例中双功能二磷酸法呢基合酶编码基因ScERG20(F96C)，来自S.cerevisiae S288c；使用一对引物(ScEGR20-F、ScEGR20-R)对S.cerevisiae S288c基因组DNA进行PCR，获得ScERG20片段。

其中，引物ScEGR20-F：5’-CAGGGAATTCGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGA-3’(SEQ 47)；

ScEGR20-R：

5’-GCTACCGCCACCGCCGCTACCGCCACCGCCTTTGCTTCTCTTGTAAACTTTG-3’(SEQ 48)，

异戊烯基二磷酸δ-异构酶编码基因ScIDI，来自S.cerevisiae S288c；使用一对引物ScIDI-F、ScIDI-R对S.cerevisiae S288c基因组DNA进行PCR，获得ScIDI片段。

其中，引物ScIDI-F：

5’-GGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCATGACTGCCGACAACAAT-3’(SEQ 49)，

ScIDI-R：5’-GCGCCTTAAGTTATAGCATTCTATGAATTTGCC-3’(SEQ 50)。

通过在引物ScEGR20-R和引物ScIDI-F上设置方向互补序列，将得到的片段ScERG20和ScIDI，通过PCR的方式融合，获得片段ScERG20-ScIDI。

同样使用PCR融合的方式将双功能二磷酸法呢基合酶高活性突变(即第96位氨基酸残基突变：F→C)引入片段ScERG20-ScIDI，获得融合片段ScERG20(F96C)-IDI。其中，引物ScEGR20-F：5’-CAGGGAATTCGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGA-3’(SEQ 51)、ScEGR20(F96C)-F：5’-GTTGTTGCAGGCTTACTGCTTGGTCGCCGATG-3’(SEQ 52)、ScEGR20(F96C)-R：5’-CATCGGCGACCAAGCAGTAAGCCTGCAACAAC-3’(SEQ 53)和ScIDI-R：5’-GCGCCTTAAGTTATAGCATTCTATGAATTTGCC-3’(SEQ 54)，引物ScEGR20-F和ScIDI-R包含酶切位点EcoRI和AflII。

香叶基香叶基二磷酸合酶编码基因TcGGPPS，来自Taxus canadensis，使用一对引物对实验室保存质粒pUC57-TcGGPPS进行PCR，获得TcGGPPS片段。其中，引物TcGGPPS-F：5’-GCAGCATATGGCAGATCTGTTTGATTTCAATG-3’(SEQ 55)；TcGGPPS-R：5’-CGAGCTCGAGTTAGTTCTGACGAAACGCAAT-3’(SEQ 56)，包含酶切位点NdeI和XhoI。

上述基因的PCR条件均为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用1％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒回收目的条带片段用于重组表达载体的构建。

使用限制性内切酶EcoRI、AflII、NdeI、XhoI以及T4 DNA连接酶对质粒pACYCDuet-1以及上述片段进行酶切和连接操作，获得表达载体pAEIG(图3B)。

实施例9重组表达载体pRCA的构建

本实施例中赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶编码基因CcCLS，来自Cistuscreticus，使用一对引物对实验室保存质粒pUC57-CcCLS进行PCR，获得CcCLS片段。

其中，引物CcCLS-F：5’-AGCGGATCCGTGTTCAGCTAGGAG-3’(SEQ 57)；CcCLS-R：5’-ATGCGTCGACTTACACCACGCTCTCAAA-3’(SEQ 58)，包含酶切位点BamHI和SalI。

冷杉醇合酶编码基因NtABS来自Nicotiana tabaccum，使用一对引物对实验室保存质粒pUC57-NtABS进行PCR，获得NtABS片段。

其中，引物NtABS-F：5’-ATAGAGATCTGGCTATATGCCACAGGCCCTG-3’(SEQ 59)；NtABS-R：5’-ATGAGGTACCCGGAGAATACTGATTCAGGGGCTT-3’(SEQ 60)，包含酶切位点BglII和KpnI。

上述基因的PCR条件均为94℃变性5min，按照如下参数循环30次：94℃变性15s，58℃退火15s,，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用1％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。确认片段大小正确后，采用DNA纯化回收试剂盒回收目的条带片段用于重组表达载体的构建。

使用限制性内切酶BamHI、SalI、BglII、KpnI以及T4 DNA连接酶对质粒pRSFDuet-1以及上述片段进行酶切和连接操作，获得表达载体pRCA(图3C)。

实施例10重组工程菌静息细胞的构建

将上述实例7-9中构建成功的三个重组表达载体同时转化进工程菌株LSC-06。获得共表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的工程菌株LSC-07。

实施例11静息细胞催化异戊烯醇制备冷杉醇

将实施例10构建成功的菌株LSC-07接种于含有50μg/mL链霉素，30μg/mL氯霉素，25μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，37℃，200rpm震荡过夜培养。将培养物以1％接种量转接于新鲜的含有50μg/mL链霉素，30μg/mL氯霉素，25μg/mL卡那霉素的400mL TB培养基中，37℃，200rpm震荡培养，OD₆₀₀达到2.5-3.0时，加入0.5mM IPTG进行25℃，200rpm过夜诱导，4000rpm，4℃，离心10min，弃上清，使用20mM PB(pH 7.0)缓冲液洗涤两次，获得表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的静息细胞，备用。

在100mL反应体系中，分别添加终浓度为1.0-5.0g/L的异戊烯醇、0-40g/L的甘油(提供静息细胞ATP合成能力，满足冷杉醇催化合成过程对ATP的需求)及20-200g/L的上述静息细胞(上述浓度均为终浓度)，添加20mM pH 7.0PB缓冲液至体积为100mL，最后添加占反应体系总体积10％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯构成催化反应体系，25℃催化12-24h，最后得到冷杉醇。

为探究反应体系中各因素对冷杉醇产量的影响，分别改变甘油浓度、静息细胞浓度、异戊烯醇浓度进行试验。

通过改变甘油浓度(0、10、20、30、40g/L)，探究不同浓度甘油下冷杉醇产量变化(异戊烯醇终浓度2.0g/L、上述静息细胞终浓度100g/L)，25℃催化24h，结果表明甘油浓度为20g/L时冷杉醇产量最高(图4)。

通过改变静息细胞浓度(20、50、100、150、200g/L)，探究不同静息细胞浓度对冷杉醇合成产量影响(异戊烯醇终浓度2.0g/L，甘油终浓度20g/L)，25℃催化24h，结果表明静息细胞浓度为100g/L时冷杉醇产量最高(图5，图中横坐标菌体浓度即为静息细胞终浓度)。

通过改变异戊烯醇浓度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L)，探究不同异戊烯醇浓度对冷杉醇合成产量影响(静息细胞终浓度100g/L，甘油终浓度20g/L)，25℃催化24h，结果表明异戊烯醇浓度为3.0g/L时冷杉醇产量最高(图6，图中横坐标底物添加量即为异戊烯醇终浓度)。

实验表明，100mL催化反应体系中分别加入终浓度为3.0g/L的异戊烯醇、100g/L的重组大肠杆菌静息细胞、20g/L甘油，添加20mM pH 7.0PB缓冲液至体积为100mL，最后添加占反应体系总体积10％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯，25℃催化反应24h即为最佳静息细胞催化工艺。结果显示：24h内催化3.0g/L底物异戊烯醇生成冷杉醇1.80g/L，实际转化率达到71.15％，远高于目前文献及专利报道水平。

实际转化率计算方法：根据冷杉醇催化反应，4mol异戊烯醇完全转化生成产物1mol冷杉醇，由分子量计算得出3.0g/L异戊烯醇完全转化生成冷杉醇理论值为2.53g/L。实际检测值/理论值即可得到实际转化率。

HPLC分析：在25℃，200rpm反应24h，取样。冷杉醇在237nm处有紫外吸收，使用高效液相色谱紫外检测器进行分析(图7)。

HPLC分析条件如下：色谱柱为C18；流速为0.8mL/min；柱温为30℃；检测器为紫外检测器；进样量为5μL。检测结果为：反应24h，冷杉醇含量为1.80g/L。

从图7所示HPLC检测结果可看出：本实验所得催化合成产物样品与冷杉醇标准品出峰时间一致(均为18.74min)，说明催化合成产物即为冷杉醇。

实施例12静息细胞的重复使用

在静息细胞催化反应结束后，反应体系中静息细胞仍保留大部分催化活性，因此对静息细胞重复利用性进行验证。

反应体系离心后回收静息细胞，并重复应用于新一轮催化反应。反应条件：在100mL催化反应体系中分别加入终浓度为3.0g/L的异戊烯醇、100g/L的重组大肠杆菌静息细胞、20g/L甘油，添加20mM pH 7.0PB缓冲液至体积为100mL，最后添加占反应体系总体积10％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯，25℃连续催化反应24h。静息细胞重复使用效率见图8，实验结果表明，在静息细胞的前6次重复过程中，底物异戊烯醇生成冷杉醇的实际转化率均达到50％以上，这说明同一批静息细胞可重复利用5-6次。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不表示用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，本领域技术人员所作的类似修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种重组大肠杆菌静息细胞的制备方法，其特征在于，敲除大肠杆菌宿主中磷酸酶编码基因phoA、ybjG、pgpB及外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ，脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR的组成型过表达，甘油代谢操纵子基因glpFK的组成型过表达，构建大肠杆菌工程菌株LSC-06；在所述大肠杆菌工程菌株LSC-06的基础上构建共表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的大肠杆菌工程菌株LSC-07；对大肠杆菌工程菌株LSC-07进行培养获得重组大肠杆菌静息细胞。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株LSC-06的构建方法为：

(1)碱性磷酸酶编码基因phoA的敲除：

以Escherichia coli C41(DE3)基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除phoA基因的大肠杆菌工程菌株LSC-01；

(2)十一异戊酸二磷酸酶编码基因ybjG的敲除：

以大肠杆菌工程菌株LSC-01基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除ybjG基因的大肠杆菌工程菌株LSC-02；

(3)磷脂酰甘油磷酸酯酶编码基因pgpB的敲除；

以大肠杆菌工程菌株LSC-02基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除pgpB基因的大肠杆菌工程菌株LSC-03；

(4)外膜脂蛋白编码基因nlpⅠ的敲除

以大肠杆菌工程菌株LSC-03基因组为模板，设计供体DNA，构建敲除nlpⅠ基因的大肠杆菌工程菌株LSC-04；

(5)脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR的组成型过表达

以大肠杆菌工程菌株LSC-04基因组为模板，设计供体DNA，构建置换脂肪酸代谢转录调节子编码基因fadR启动子为组成型强启动子P_tac的大肠杆菌工程菌株LSC-05；

(6)甘油代谢操纵子glpFK的组成型过表达

以大肠杆菌工程菌株LSC-05基因组为模板，设计供体DNA，构建甘油激酶编码基因glpFK启动子为组成型强启动子P_tac的大肠杆菌工程菌株LSC-06。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株LSC-07的构建方法为：

(1)构建含有羟乙基噻唑激酶编码基因EcThiM和异戊烯基磷酸激酶MthIPK的重组表达载体pCTI；

(2)构建含有双功能二磷酸法呢基合酶编码基因ScERG20、异戊烯基二磷酸δ-异构酶编码基因ScIDI和香叶基香叶基二磷酸合酶编码基因TcGGPPS的重组表达载体pAEIG；

(3)构建含有赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶编码基因CcCLS和冷杉醇合酶编码基因NtABS的重组表达载体pRCA；

(4)通过质粒共转化的方式，将步骤(1)-(3)中构建的重组表达载体pCTI、pAEIG、pRCA，共同转入要求1所述的大肠杆菌工程菌株LSC-06，构建同时表达羟乙基噻唑激酶、异戊烯基磷酸激酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶、双功能二磷酸法呢基合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、赖百当-13-烯-8-醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶的大肠杆菌工程菌株LSC-07。

4.一种利用权利要求1-3任一项的制备方法得到的重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇制备冷杉醇的方法。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在100mL催化反应体系中，分别加入终浓度为1.0-5.0g/L的异戊烯醇、20-200g/L的重组大肠杆菌静息细胞、0-40g/L甘油，添加20mM pH7.0PB缓冲液至体积为100mL，最后添加占反应体系总体积10-20％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯；25℃催化反应12-24h，合成冷杉醇。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在100mL催化反应体系中添加终浓度为10-40g/L的甘油。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在100mL催化反应体系中分别加入终浓度为3.0g/L异戊烯醇、100g/L的重组大肠杆菌静息细胞、20g/L甘油，添加20mM pH 7.0PB缓冲液至体积为100mL，最后添加占反应体系总体积10％(v/v)的肉豆蔻酸异丙酯；25℃催化24h，合成冷杉醇。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，反应结束后重组大肠杆菌静息细胞经离心回收，进行重复使用。

9.如权利要求5所述的重组大肠杆菌静息细胞的制备方法在催化异戊烯醇制备冷杉醇中的应用。

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