CN114350514B - 一种多细胞链状培养装置及其在制备肝索结构中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种多细胞链状培养装置及其在制备肝索结构中的应用，属于细胞培养装置领域，所述培养装置包括培养装置本体和设于所述培养装置本体的微孔阵列模块，所述微孔阵列模块包括至少两排微孔列，每排微孔列设有依次排列的多个微孔，相邻的两个微孔之间开设有用于连通相邻两个微孔的连通通道。本发明的多细胞链状培养装置及肝索结构培养方法可以有效地提高细胞培养维度以及细胞间信息互联以提供细胞在体外培养的功能。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养芯片制造技术领域，特别是涉及一种多细胞链状培养装置及其在制备肝索结构中的应用。
背景技术
肝脏是人体最大的消化器官，承担着人体绝大多数外源物质的消化作用。肝脏的生理结构复杂，有特殊的双重供血***，一部分血液从肺部组织吸收氧气后通过肝动脉流入肝脏，一部分血液经消化***吸收营养物质后经门静脉注入肝脏，通过丰富的微血管，流入肝脏内部。肝脏内部有许多肝小叶，是肝脏组成的基本单元。肝小叶呈六边形状，中央有一条沿其长轴走行的中央静脉，肝索和肝血窦以中央静脉为中心向周围呈放射状排列。肝细胞单层排列成凹凸不平的板状结构，称肝板，肝板的断面呈索状，称肝索。现代医学工程难以在体外复刻出肝脏的复杂结构，绝大多数的仿生器官构建于复杂的工程结构，通过可设计加工的器件或是具备一定生理功能的高分子材料来增加传统二维平面培养的复杂度来模拟人体器官，实现部分已知的生理功能。然而这些方式获得的细胞或组织与人体仍存在较大的差异，人体许多的功能仍是以一种自发的形式获得而非被动获取。
传统的平面培养的细胞连接往往仅基于有限的细胞间膜接触，细胞间的联接十分有限。近年来，相当多的研究致力于提高细胞培养的维度来增强细胞的信息交流来增加细胞的体外培养功能，例如通过细胞自组装形成立体的球状，增强细胞与细胞之间的接触；培养体系中加入水凝胶，来达到提高细胞培养维度以增强细胞间相互作用的效果。但是这些方式仍有限制，球状培养的细胞会因为营养物质和氧气输送受到阻碍，而导致球体中心区域的细胞死亡，球体直径也因此被限制在200μm以下，这一尺寸大小与真实的肝脏相去甚远。如何有效的增加细胞立体培养体积，同时保证物质输送是各大器官组织工程上亟需解决的一大难题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多细胞链状培养装置及其在制备肝索结构中的应用，可以有效地提高细胞培养维度以及细胞间信息互联以提供细胞在体外培养的功能。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明的一方面提供一种多细胞链状培养装置，包括培养装置本体和设于所述培养装置本体的微孔阵列模块，所述微孔阵列模块包括至少两排微孔列；
每排微孔列设有依次排列的多个微孔，相邻的两个微孔之间开设有用于连通相邻两个微孔的连通通道。
在本发明的一些实施方式中，所述微孔为圆柱形微孔；
优选的，所述微孔的直径为200～2000微米，所述微孔的深度为200～5000微米。
在本发明的一些实施方式中，所述每排微孔列中相邻的两个微孔之间的间距为2～10微米。
在本发明的一些实施方式中，所述每排微孔列中相邻的两个微孔的孔壁开设槽口用于形成连通通道；
优选的，所述槽口的开口度自所述微孔底部向微孔口部方向逐渐增大；
更优选的，所述槽口为V型槽口。
在本发明的一些实施方式中，所述微孔阵列模块中相邻的两排微孔列中的各个微孔依次相对设置；
优选的，相邻的两排微孔列中的各个微孔依次相对设置，相对设置的两个微孔之间的间距为10～1000微米。
在本发明的一些实施方式中，所述微孔阵列模块包括至少一个组微孔列；所述组微孔列至少包括两排相邻排布的微孔列，用于细胞链状培养；
优选的，各所述组微孔列之间的间距为50～50000微米；
和/或，各所述组微孔列中的微孔列以直线阵列或曲线阵列排布；
和/或，曲线阵列排布选自圆形阵列排布、椭圆形阵列排布、半圆形阵列排布、三角形阵列排布、梯形阵列排布或多边形阵列排布中的至少一种，或者其他所需要的图形进行排列。
在本发明的一些实施方式中，各所述微孔采用表面疏水试剂处理，优选的，所述疏水化试剂选用琼脂糖或Pluronic F-127；
和/或，所述微孔微孔阵列模块表面涂覆有改性材料，所述改性材料为具有良好生物相容性、良好的光学通透性、易成型、且具有疏水性的材料；优选的，所述改性材料选自琼脂糖、聚乙二醇或海藻酸钠中的一种或多种组合；
和/或，所述微孔微孔阵列模块采用具有热固成型、注塑成型或光固成型的可塑材料，优选的，所述可塑材料选自聚甲基丙烯基明胶(GelMA)、聚甲氧基硅氧烷(PDMS)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中的一种或多种组合。
本发明第二方面提供一种多细胞链状培养装置的制备方法，包括如下步骤：
S1、采用计算机图形设计软件制作微孔阵列模块设计图；
S2、采用光刻、三维打印工艺或浇筑成型的工艺，制备微孔阵列模块模具或微孔阵列模块；
S3、采用预制具有热固成型、注塑成型或光固成型的可塑材料倒入所述微孔阵列模具，固化倒模得到微孔阵列模块；
所述可塑材料选自GelMA、PDMS、PEG、PMMA或PET中的至少一种；
S4、使用疏水化处理试剂对微孔阵列模块的微孔进行疏水化处理。
本发明第三方面为多细胞链状培养装置在以下至少一项技术特征中的应用：
A1、在组织或器官的多细胞培养中的应用；
A2、在类似肝索结构的组织或器官的多细胞培养中的应用；
A3、在肝索结构的组织或器官的多细胞培养中的应用；
A4、在制备仿生肝小叶结构中肝索结构中的应用。
本发明第四方面提供一种肝索或类肝索结构的多细胞链状培养方法，采用上述多细胞链状培养装置，所述培养方法包括如下步骤：
S100、分别制备第一细胞的悬液和第二细胞的悬液；所述第一细胞选自肝实质细胞、多能干细胞分化形成的肝细胞、由病人肝癌组织消化分离的原代肝细胞中的一种或多种；第二细胞选自肝窦内皮细胞、由病人肝癌组织消化分离的内皮细胞中的一种或多种；
优选的，将细胞融合度达到80％-90％的第一细胞与细胞融合度达到80-90％的第二细胞分别制成细胞悬液；
优选的，第一细胞和第二细胞选自具备链状细胞结构的器官；更优选的，具备链状细胞结构的器官选自肝脏、肠道或肺；
S200、将第一细胞和第一细胞按照特定的比例混合，并调整细胞悬液细胞浓度为5×10^4～1×10^7个/mL；其中，特定的比例为按照器官内细胞数量的特定的比例，将两种细胞混合配比为3：1或4：1或10：1或其他具有特殊意义的比例；
S300、向细胞悬液中添加1％～20％的基质胶材料，混合均匀；优选的，基质胶材料为具有支架功能的凝胶；更优选的，基质胶材料为Matrigel基质胶；
S400、将S400所得的细胞悬液添加于多细胞链状培养装置的微孔阵列模块中的微孔中；优选的，每个微孔中置入5000～100000个细胞；
S500、经过培养得到肝索或类肝索结构。
附图说明
图1为多细胞链状培养装置置于芯片或孔板中进行细胞链状培养示意图；
图2为具有V型槽口的部分微孔阵列模块扫描电镜图，比例尺为100微米；其中A为一组微孔列的部分扫描电镜图，B为开设V型槽口的相邻的两个微孔的扫描电镜图；
图3为细胞团状培养与链状培养蛋白表达统计图；
图4为多细胞链状培养装置的光学图片。
图中标号：
100、培养器皿；200、微孔阵列模块；201、微孔；202、V型槽口。
具体实施方式
本发明的发明人提供一种多细胞链状培养装置，适用于不同来源或者是不同组织类型的细胞培养，微孔阵列模块可匹配各种市售的培养器皿，充分考虑生物学家的操作习惯，降低学习成本，具有很高的用户友好性。此外，微孔阵列模块与现有的细胞培养孔板具有适配性，对现有的生物分析及成像仪器均有良好的兼容性。细胞链状培养在细胞球状培养的基础上进一步提高细胞连接的紧密性，加强细胞与细胞之间的信息互联。在此基础上，完成了本发明。
本发明第一方面提供一种多细胞链状培养装置，包括培养装置本体和设于所述培养装置本体的微孔阵列模块，所述微孔阵列模块包括至少两排微孔列，每排微孔列设有依次排列的多个微孔，相邻的两个微孔之间开设有用于连通相邻两个微孔的连通通道。连通通道优选由每排微孔列中相邻的两个微孔的孔壁开设槽口形成，优选的，所述槽口的开口度自所述微孔底部向微孔口部方向逐渐增大，更优选的，所述槽口为V型槽口。
通过连通通道可以增加相邻两个细胞团信息交互，加速肝索结构形成。微孔经过表面疏水化处理，疏水化试剂为生物相容性良好、光学通透性良好、易于操作的试剂，例如琼脂糖、Pluronic F-127，以及其他可改变表面吸附性能的试剂，以降低细胞对于培养壁面的附着。
在一优选的实施方式中，微孔为圆柱形微孔，所述微孔的直径为200～2000微米，可选200～500微米，500～700微米，700～1000微米，1000～2000微米；所述微孔的深度为200～5000微米，合适的微孔直径和深度可稳定形成直径范围在200～300微米左右的细胞球体。
在一优选的实施方式中，所述每排微孔列中相邻的两个微孔之间的间距为2～200微米，优选5～10微米，可选2～10微米，10～50微米，50～100微米，100～200微米，具体的相邻两个微孔之间的间距是指两个微孔之间的最小距离，更具体的，可以是相邻两个微孔之间的壁厚，保证一定的壁厚用来形成V型槽口。
在一优选的实施方式中，所述微孔阵列模块每一组中相邻的两排微孔列之间的间距为10～1000微米。具体的相邻两排微孔列之间的间距是指两排微孔列之间的最小距离，设置一定的距离以形成连接细胞链，连接组内不同排微孔阵列中的微孔。
在一优选的实施方式中，所述微孔阵列模块包括至少一个组微孔列；所述组微孔列至少包括两排相邻排布的微孔列，用于细胞链状培养。优选的，各所述组微孔列之间的间距为50～5000微米，可选50～100微米，100～500微米，500～1000微米，1000～2000微米，2000～3000微米，3000～5000微米。具体的，所述组微孔列之间的间距是指各组之间的最小距离，每组之间设置较宽的距离，不同细胞链之间可进行独立生长，不互相干扰。
各所述组微孔列中的微孔列以直线阵列或曲线阵列排布；曲线阵列排布选自圆形阵列排布、椭圆形阵列排布、半圆形阵列排布、三角形阵列排布、梯形阵列排布或多边形阵列排布中的至少一种。
多细胞链状培养装置的使用方法：第一置于培养器皿100中培养，培养器皿可为具有液体流通功能的微流道芯片中或者可以通过设计制备不同尺寸以直接放入微流道芯片或细胞培养板100，所述培养板包括96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、3.5cm培养皿、6cm培养皿和10cm培养皿中的一种；第二可通过直接滴加细胞悬液或者通过微孔进行流体输送至微孔阵列模块中进行细胞链状培养。
在一优选的实施方式中，各所述微孔采用表面疏水试剂处理，优选的，所述疏水化试剂选用Pluronic F-127，以降低细胞对于培养壁面的附着，并且生物相容性良好、光学通透性良好、易于操作。优选的，所述微孔微孔阵列模块采用GelMA、PDMS、PEG、PMMA、PET等至少一种材料制成。
多细胞链状培养装置在制备仿生肝小叶结构中肝索结构中的应用，适用于不同来源或者是不同组织类型的细胞培养，微孔阵列模块可匹配各种市售的培养器皿，充分考虑生物学家的操作习惯，降低学习成本，具有很高的用户友好性。此外，微孔阵列模块与现有的细胞培养孔板具有适配性，对现有的生物分析及成像仪器均有良好的兼容性。细胞链状培养在细胞球状培养的基础上进一步提高细胞连接的紧密性，加强细胞与细胞之间的信息互联。
多细胞链状培养装置适用于肝脏器官肝索结构中的两种或两种以上的细胞进行共培养，具体的可为肝实质细胞、多能干细胞分化形成的肝细胞、由病人肝癌组织消化分离的原代肝细胞、肝窦内皮细胞、由病人肝癌组织消化分离的内皮细胞等其他器官或组织细胞。该装置不限于肝索结构的应用，还适用于其他具备类似结构组织或者器官的的多细胞培养中。
以下结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解的是，本发明的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明，且本发明的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件制作，或按材料供应商推荐的条件制作。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以***其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。
实施例1
一种多细胞链状培养装置，如图1和图2所示，微孔阵列模块200置于培养器皿100中，微孔阵列模块200设有六排依次排列的多个微孔201，各排微孔201呈圆形排布。相邻的两排为一组微孔列，共有三个组微孔列，三个组微孔列以约50～50000微米的间距形成不同半径的圆形阵列，每组之间具有较宽的距离，不同细胞链之间可进行独立生长，不互相干扰。
其中，微孔201的直径为300微米，深度为250微米每排微孔列中相邻的两个微孔201之间的间距为5微米，每排微孔列中相邻的两个微孔201的孔壁开设V型槽口202。微孔阵列模块200中相邻的两排微孔列中的各个微孔201依次相对设置，相对设置的两个微孔201之间的间距为10微米。
阵列模块200采用聚甲氧基硅氧烷并经过软光刻或3D打印获得。
各所述微孔采用0.5％Pluronic F-127去离子水处理。
实施例2
多细胞链状培养装置的制备方法，包括如下步骤：
(1)利用计算机图形设计软件，将所需要的微孔阵列模块进行排布图形设计形成微孔阵列模块设计图，经过软光刻工艺，将具有光敏性光刻胶进行图案化，形成具有微小柱子阵列的光刻胶膜具(微孔阵列模块模具)；
(2)将预制好的PDMS(聚甲氧基硅氧烷)混合物经脱气处理，倒入所述光刻胶模具上，不进行真空抽气处理，静止片刻后，进行加热烘干，待PDMS完全凝固后，小心从磨具上剥离，形成具有微孔阵列与V型槽的PDMS模块；
(3)将PDMS按照设计的图形进行切割，适配于微流体通道芯片或不同尺寸的细胞培养板，获得多细胞链状培养装置；
(4)使用疏水化处理试剂(含有0.5％Pluronic F-127去离子水)浸泡多细胞链状培养装置不少于3小时，进行装置表面疏水化处理；
(5)使用PBS冲洗除去表面多余的疏水化试剂，并使用细胞培养的完全培养基进行装置表面孵育处理至少半小时，共细胞培养使用。
实施例3
一种仿生肝小叶结构中肝索结构的多细胞链状培养方法
(1)提供稳定生长的肝癌细胞(HepG2)以及内皮细胞系(EAhy926)，细胞融合度达到80％-90％。
(2)将内皮细胞与肝癌细胞按照特定的比例4：1进行混合，进行细胞计数，调整细胞悬液细胞浓度为5×10^4～1×10^7个细胞/mL。
(3)细胞悬液中添加1％～20％的Matrigel基质胶，使用移液枪吹打均匀。
(4)使用移液枪将细胞悬液添加于装置中，使每个微孔中均匀落入5000-100000个细胞。
(5)放入细胞培养箱中稳定培养至少24小时，使细胞进行自组装形成链状，后续每24h换一次液。
(6)培养至第五天进行白蛋白ALB与内皮细胞标志蛋白CD31分泌分析，免疫荧光结果通过显微镜进行获取，使用Image J进行统计分析，结果如图3和图4所示。如图3所示结果可以看出，链状培养的细胞链状结构具有更高的白蛋白表达，细胞培养功能效果明显优于球状培养。
上述实施例仅例示性说明本申请的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本申请所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种多细胞链状培养装置，其特征在于，包括培养装置本体和设于所述培养装置本体的微孔阵列模块(200)，所述微孔阵列模块(200)包括至少两排微孔列；
每排微孔列设有依次排列的多个微孔(201)，相邻的两个微孔之间开设有用于连通相邻两个微孔的连通通道；
所述每排微孔列中相邻的两个微孔(201)的孔壁开设槽口用于形成连通通道，所述槽口的开口度自所述微孔(201)底部向微孔(201)口部方向逐渐增大，所述槽口为V型槽口(202)，；每排微孔列中相邻的两个微孔之间的间距为2～200微米，且相邻两个微孔之间的壁形成所述V型槽口(202)；
所述微孔阵列模块包括至少一个组微孔列；所述组微孔列至少包括两排相邻排布的微孔列，用于细胞链状培养；各所述组微孔列中的微孔列以曲线阵列排布；
各所述组微孔列之间的间距为50～50000微米，所述微孔阵列模块中相邻的两排微孔列之间的间距为10～1000微米。
2.根据权利要求1所述的多细胞链状培养装置，其特征在于，所述微孔(201)为圆柱形微孔；
优选的，所述微孔(201)的直径为200～2000微米，所述微孔(201)的深度为200～5000微米。
3.根据权利要求1所述的多细胞链状培养装置，其特征在于，；
曲线阵列排布选自圆形阵列排布、椭圆形阵列排布、半圆形阵列排布、三角形阵列排布、梯形阵列排布或多边形阵列排布中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的多细胞链状培养装置，其特征在于，各所述微孔(201)采用表面疏水试剂处理，优选的，所述疏水化试剂选用琼脂糖或Pluronic F-127；
和/或，所述微孔微孔阵列模块表面涂覆有改性材料，所述改性材料为具有良好生物相容性、良好的光学通透性、易成型、且具有疏水性的材料；优选的，所述改性材料选自琼脂糖、聚乙二醇或海藻酸钠中的一种或多种组合；
和/或，所述微孔微孔阵列模块采用具有热固成型、注塑成型或光固成型的可塑材料，优选的，所述可塑材料选自聚甲基丙烯基明胶、聚甲氧基硅氧烷和聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种或多种组合。
5.如权利要求1-4任一项所述的多细胞链状培养装置的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用计算机图形设计软件制作微孔阵列模块设计图；
S2、采用光刻、三维打印工艺或浇筑成型的工艺，制备微孔阵列模块模具或微孔阵列模块；
S3、采用预制具有热固成型、注塑成型或光固成型的可塑材料倒入所述微孔阵列模具，固化倒模得到微孔阵列模块；
S4、使用疏水化处理试剂对微孔阵列模块的微孔进行疏水化处理。
6.如权利要求1-4所述的多细胞链状培养装置在以下至少一项技术特征中的应用：
A1、在组织或器官的多细胞培养中的应用；
A2、在类似肝索结构的组织或器官的多细胞培养中的应用；
A3、在肝索结构的组织或器官的多细胞培养中的应用；
A4、在制备仿生肝小叶结构中肝索结构中的应用。
7.一种肝索或类肝索结构的多细胞链状培养方法，其特征在于，采用如权利要求1-4所述的多细胞链状培养装置，所述培养方法包括如下步骤：
S100、分别制备第一细胞的悬液和第二细胞的悬液；
优选的，将细胞融合度达到80％-90％的第一细胞与细胞融合度达到80-90％的第二细胞分别制成细胞悬液；
优选的，第一细胞和第二细胞选自具备链状细胞结构的器官；更优选的，具备链状细胞结构的器官选自肝脏、肠道或肺；
S200、将第一细胞和第一细胞按照特定的比例混合，并调整细胞悬液细胞浓度为5×10^4～1×10^7个/mL；
S300、向细胞悬液中添加1％～20％的基质胶材料，混合均匀；优选的，基质胶材料为具有支架功能的凝胶；更优选的，基质胶材料为Matrigel基质胶；
S400、将S400所得的细胞悬液添加于多细胞链状培养装置的微孔阵列模块中的微孔中；优选的，每个微孔中置入5000～100000个细胞；
S500、经过培养得到肝索或类肝索结构。
8.根据权利要求7所述的肝索或类肝索结构的多细胞链状培养方法，其特征在于，所述第一细胞选自肝实质细胞、多能干细胞分化形成的肝细胞或由病人肝癌组织消化分离的原代肝细胞中的至少一种；
第二细胞选自肝窦内皮细胞或由病人肝癌组织消化分离的内皮细胞中的至少一种。
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