CN117363482B - 一种用于不同种类的类器官联合培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及未分化的人类、动物或植物细胞,如细胞系的培养或维持领域,公开了一种用于不同种类的类器官联合培养的方法,所述方法使用类器官联合培养装置,包括将不同类器官或者细胞分别放置在两个第二培养板中培养的步骤,两个所述第二培养板通过拼接公件和拼接母件相连接,通过拼接公件和拼接母件上的微孔阵列实现微环境的连通,为模拟类器官联合培养提供可能。本发明的类器官联合培养方法,对联合培养装置进行了模块化设计,可以实现不同部件间的组装,实现研究不同类器官的共培养,以此可建立多种器官互作的疾病模型,为后续研究提供模型基础。
Description
技术领域
本发明涉及未分化的人类、动物或植物细胞,如细胞系的培养或维持领域,具体的说,涉一种用于不同种类的类器官联合培养的方法。
背景技术
在过去的十年中,科学家利用干细胞的自我更新和产生分化细胞的能力,通过它们能够产生发育胚胎的所有组织并维持成人的组织稳态。这些关键的干细胞特征已被利用在体外开发“微型器官”,即所谓的类器官。类器官是干细胞衍生和自组织的3D培养物,其表型细胞类型组成,结构以及一定程度上不同组织的功能。目目前在体内已经开发了了多重类器官模型,比如器官部不同区域类器官(全器官、前器官、小器官等)、肾脏类器官、肠类器官、心脏类器官、肺类器官、皮肤类器官等。类器官不管是在癌症、遗传病等多范围疾病研究、药物筛查等多方面均具备显著的优势。
但是,传统的类器官培养是在6孔板或者10cm板中独立进行,缺少必要的联系。但随着微观3D打印和微工程技术的发展,使类器官芯片的发展成为现实。“器官芯片”是微工程仿生***,其中包含由活体人类细胞衬里的微流体通道,其再现活器官的关键功能单元,以在体外重建整合的人体器官水平病理生理学。这些微器件可用于测试药物和化学品的功效和毒性,并创建人类疾病的体外模型。因此,它们可能代表用于制药、化学和环境应用的传统动物模型的低成本替代品。但目前来看,实现芯片上的“全身体”却鲜见报道。
传统类器官培养时,因为中心养料、氧气供应不足导致的类器官中心坏死的问题,难以多重类器官共培养,传统芯片进行类器官共培养时,需要将类器官从之前的培养基中取出,然后再将不同的类器官与冷的Matrigel胶混合,再放置于类器官共培养芯片中,使类器官进行共培养培养,整个操作过程繁琐低效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够用于不同种类的类器官联合培养的方法。
本发明提供一种用于不同种类的类器官联合培养的方法,使用类器官联合培养装置,所述装置包括上盖、至少两块第二培养板和与上盖可拆卸连接的共培养槽,所述第二培养板用于培养类器官;
所述第二培养板包括第二基台,所述第二基台的上设有上端开口的培养槽,所述培养槽内设有类器官放置孔;所述第二基台上还有第二培养基加液槽,所述第二培养基加液槽位于培养槽的两侧,并与培养槽相连通;
所述第二培养板的两个侧壁上,对应设置有拼接公件和/或拼接母件;所述拼接公件为向外的凸起,所述拼接母件为与拼接公件匹配的向内的凹槽,相邻的两个第二培养板的拼接公件可拆卸的***连接在拼接母件中,实现两个第二培养板的连接和连通;
所述方法包括:将不同类器官或者细胞分别放置在不同的第二培养板中培养,相邻的两个第二培养板通过拼接公件和拼接母件相连接并连通,不同的类器官或者细胞用过拼接公件和拼接母件完成微环境的连通,实现不同种类的类器官的联合培养。
其中,所述类器官联合培养装置还包括第一培养板,所述第一培养板用于培养细胞,所述第一培养板与第二培养板可拆卸连接,并且所述第一培养板中培养的细胞通过微针阵列与第二培养板中的类器官相连通;所述第一培养板包括第一基板和与第一基板连接的第一基台,所述第一基板的两端连接有第一连接件,所述第一连接件的下部与共培养槽的上沿可拆卸连接,所述第一连接件的上部与上盖的下沿可拆卸连接;所述方法还包括将不同的类器官或者组织防止在第一培养板中培养并通过微针阵列与第二培养板中的类器官或者细胞相连通的步骤。
其中,所述方法还包括:将第一培养板安装至第二培养板的上方,分别将细胞添加到第一培养板中;使第一培养板的类器官混合细胞后,将第一培养板盖合在第二培养板上方使微针阵列***类器官组织中,然后进行培养;第一培养板的细胞混同培养基通过微针阵列,利用重力向位于微针阵列末端的不同第二培养板的类器官进行转移,并通过微针阵列末端的开孔,扩散到类器官组织中。
其中,所述第一基台内与第二培养板的培养槽对应的位置设有第一U形加液槽,所述第一U形加液槽中设有至少一个第一细胞培养室,所述第一细胞培养室的下方连接有微针阵列,第一细胞培养室与微针阵列相连通,当第一培养板与下件相连接时,微针阵列的下端***类器官放置孔上培养的类器官组织中。
其中,所述第一基板的两端连接有第一连接件,所述第一连接件的下部与共培养槽的上沿可拆卸连接,所述第一连接件的上部与上盖的下沿可拆卸连接。
其中,所述第二培养板的培养槽内设有至少两个类器官放置孔,所述类器官放置孔的周围设有定位桩;相邻的两个类器官放置孔之间设有组隔板,组隔板与培养槽的底壁相连接,与培养槽的侧壁之间留有孔隙。
其中,所述拼接公件和拼接母件上均设有连通培养槽的微孔阵列,所述第二培养板的侧壁上设有连通培养槽的微孔阵列,所述拼接公件和拼接母件连接时,微孔阵列相连通。
其中,所述类器官为类脑器官、心脏类器官、肾脏类器官、肠道类器官、肺类器官中的任一种。
本发明的类器官联合培养方法,对联合培养装置进行了模块化设计,可以实现不同部件间的组装,实现研究不同类器官的共培养,以此可建立多种器官互作的疾病模型。
即可以在同个芯片内实现类器官的融合培养,又可以利用公母件的拼插方式实现不同种类类器官的共循环共培养,比如心脏类器官与其他器官类器官共培养,比如心脏类器官、肾脏类器官、肠道类器官的共培养;而第一培养板及微针阵列设置,又可以将细胞组织(如内皮细胞)与多种类器官一同共培养,实现多种可能性。
附图说明
图1为本发明的类器官联合培养装置的***图。
图2为第一培养板的俯视图。
图3为第一培养板的仰视图。
图4为第一培养板的剖面图。
图5为带有公件的第二培养板的结构示意图。
图6为带有公件的第二培养板的俯视图。
图7为带有公件的第二培养板的剖面图。
图8为带有母件的第二培养板的结构示意图。
图9为同时带有公件和母件的第二培养板的结构示意图。
图10为实施例2的荧光检测结果图,其中,蓝色MAP2-为类脑中神经元的标记物,代表类脑;红色IBA1为小胶质细胞的标记物,代表小胶质细胞。
附图标记说明:
1.上盖;2.第一培养板,21.第一基板,22.第一基台,23.微针阵列,24.第一连接件, 25.第一U形加液槽,26.第一细胞培养室,27.通孔;3.第二培养板,31.微孔阵列,32.第二基台,33.培养槽,34.类器官放置孔,35.定位桩;36.组隔板,37.第二培养基加液槽,38.拼接公件,39.拼接母件;4.共培养槽,41.容纳槽。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
如图1-9所示,本发明提供一种类器官联合培养装置,所述装置包括上盖1、第一培养板2、第二培养板3和共培养槽4,所述第一培养板2用于培养细胞,所述第二培养板3用于培养类器官,所述第一培养板2与第二培养板3可拆卸连接,并且所述第一培养板2中培养的细胞通过微针阵列23与第二培养板3中的类器官相连通;
所述第一培养板2的两端连接有第一连接件24,所述第一连接件24的下部与共培养槽4的上沿可拆卸连接,所述第一连接件24的上部与上盖1的下沿可拆卸连接。
所述第一培养板2包括第一基板21和连接在第一基板上的第一基台22,所述第一基台22上与第二培养板的培养槽对应的位置设有第一U形加液槽25,所述第一U形加液槽25中设有至少一个第一细胞培养室26,所述第一细胞培养室26的下方连接有微针阵列23,所述第一细胞培养室26与微针阵列23相连通,当第一培养板2与第二培养板3相连接时,微针阵列23的下端***类器官放置孔上培养的类器官组织中。
所述上盖的内部设有用于保证空气流通的支撑块11。
所述第二培养板3包括第二基台32,所述第二基台32的上设有上端开口的培养槽33,所述培养槽33内设有至少两个类器官放置孔34,所述类器官放置孔34的周围设有定位桩35;相邻的两个类器官放置孔34之间设有组隔板36,组隔板36与培养槽33的底壁相连接并与培养槽33的侧壁之间留有孔隙;所述第二基台32上还有第二培养基加液槽37,所述第二培养基加液槽37位于培养槽的两侧,并与培养槽通过培养基入液口相连通。
所述第一基台22上与第二培养基加液槽位37相对应的位置设有通孔27,当第一培养板连接在第二培养板上方时,可以通过通孔27向第二培养基加液槽37内添加培养基。
所述第二培养板的至少一个侧壁上,设置有拼接公件38或者拼接母件39;所述拼接公件为向外的凸起,所述拼接母件为与拼接公件匹配的向内的凹槽,相邻的两个第二培养板的拼接公件可拆卸的***连接在拼接母件中。
所述拼接公件和拼接母件上均设有连通培养槽的微孔阵列31。
所述第二培养板的侧壁上设有连通培养槽的微孔阵列31。
也就是说,第二培养板可以由三种模式:第一种是一个侧壁上设有拼接公件38,与拼接公件38所在侧壁相对的侧壁上设有微孔阵列31;第二种是一个侧壁上设有拼接母件39,与拼接母件39所在侧壁相对的侧壁上设有微孔阵列31;第三种是一个侧壁上设有拼接母件39,与拼接母件39所在侧壁相对的侧壁上设有拼接公件38,所述拼接公件和拼接母件上均设有连通培养槽的微孔阵列31;微孔阵列31能够实现不同位置的类器官培养时微环境的连通。
所述共培养槽4为顶端开口的长方形腔体,所述共培养槽4的内部设有向下凹陷的容纳槽41,所述容纳槽41的宽度与第二培养板的长度相匹配。所述容纳槽41内可以并排放置多个第二培养板3。所述拼接公件38和拼接母件39设置在第二培养板较长的侧壁上,当多个第二培养板3并排放置在容纳槽内时,可以通过拼接公件和拼接母件上均的微孔阵列,可以模拟血管实现不同类器官之间的连通。
所述培养基入液口位于培养槽的底部。
本发明还提供一种用于不同种类的类器官联合培养的方法,所述方法使用上述类器官联合培养装置,包括如下步骤:
1、将分别将不同的类器官置于第二培养板可中培养,将第二培养板依次放入共培养板内(通过公母件连接);
2、将第一培养板安装至第二培养板可上方,分别将细胞添加到第一培养板中,细胞混同培养基通过微针阵列,利用重力向位于微针阵列末端的不同的类器官进行转移,并通过微针阵列末端的开孔,扩散到类器官组织中;
3、使第一培养板的类器官混合细胞后,将上件盖合在中件上方,然后进行培养。
所述步骤1每种类器官的培养步骤具体为:11)输入基质胶:首先将6ml冷的Matrigel胶用移液器注入第二培养板的类器官放置孔中,每个孔2ml。
12)放置类器官:将类器官小心的放置在注满基质胶的类器官放置孔中;
13)注入培养基:将30ml的类器官培养基通过加液槽,缓慢的加注培养基。
此外,将装有不同类器官的第二培养板,利用两侧的公母件进行拼插,不同培养板内部培养基会通过微孔进行交互。实现共培养。
所述步骤2具体为:21)将第一培养板第二培养板的定位圆角对齐,将第一培养板的第一连接件与共培养槽的外延对齐,缓慢下压完成连接。
22)在第一培养板中培养细胞:将细胞培养基4ml转移至U形加液槽内,然后再将细胞用移液器依次接种到细胞培养室中。
23)细胞混同培养基通过微针阵列,利用重力向位于微针阵列末端的类器官进行转移,并通过微针阵列末端的开孔,扩散到类器官组织中。
所述步骤3)中的培养方法为:每天检查中件的剩余液量,如有剩余培养基,用移液器移除,重新添加4ml培养基;每3天通过下件加液槽通路(仅穿过中件),更换20ml培养基。培养条件为:放置在CO2培养箱中在37℃进行培养;将基础培养基40ml灌注到共培养槽中,模拟人体的循环体液。同时可利用电动计量泵连接上共培养槽的进口和出口,实现体液的流动。
培养过程中,可按照实验要求,在第7天,第14天,第30天,第60天、90天、120天、150天、180天甚至更久的时间节点进行取样。取样时,拿开上件,移去中件内培养基后,轻轻向上抬起中件,此时类脑球等类器官组织会附着在中件下端的微针阵列上一同被带出。
实施例1
一、材料的准备
1.类脑器官的制备:
将iPSC(人诱导多能干细胞)使用类脑分化试剂盒STEMdiff Cerebral Organoid试剂盒(StemCell Technologies,08570),按照STEMCELL TECHNOLOGIES官网的操作流程进行分化,得到类脑器官。
2.小胶质细胞的制备:
使用STEMdiff™ Hematopoietic Kit将iPSC(人诱导多能干细胞)分化为CD34+及CD45+的造血祖细胞。进一步对造血祖细胞使用STEMdiff™ Microglia kit 试剂盒诱导培养得到小胶质细胞。
3.内皮细胞的制备:
使用STEMCELL的试剂盒(STEMdiff™ Endothelial Differentiation Kit(08005, 08007)),将iPSC分化成内皮细胞后,方法同上述的小胶质细胞,加入到培养体系中。共培养7天。得到内皮细胞。
4.肺类器官的制备:
将iPSC(人诱导多能干细胞)使用肺类器官分化试剂盒STEMdiff™ BranchingLung Organoid Kit,Catalog #100-0195,按照STEMCELL TECHNOLOGIES官网的操作流程进行分化,得到肺类器官。
实施例2:小胶质细胞和类脑通过第二培养板的拼接结构实现共培养
本实施例中将小胶质细胞和类脑器官的联合培养方法,所述方法使用上述类器官联合培养装置,包括如下步骤:
1、分别将不同的类脑器官和小胶质细胞置于两个第二培养板中培养:
11)输入基质胶:首先将1.2ml冷的Matrigel胶用移液器注入其中一个第二培养板的类器官放置孔中,该第二培养板每个孔0.4 ml;另一个第二培养板不需要放置基质胶。
12)放置类脑器官:将类脑器官小心的放置在注满基质胶的类器官放置孔中;
13)注入类脑培养基:将10ml的类器官培养基通过加液槽,缓慢的加注培养基放置类器官的放置槽;将10ml小胶质细胞。
14)注入小胶质细胞和小胶质细胞培养基,按照2×105个/ml密度进行接种,将小胶质细胞和培养基一同接种到另一个第二培养板中。
2、此处不使用带微针阵列的第一培养板;将上件盖合在中件上方,然后进行培养。培养方法为:每天检查中件的剩余液量,如有剩余培养基,用移液器移除,重新添加2.5ml培养基;每3天通过下件加液槽通路(仅穿过中件),更换10ml培养基。培养条件为:放置在CO2培养箱中在37℃进行培养;将基础培养基40ml灌注到共培养槽中,模拟人体的循环体液。同时可利用电动计量泵连接上共培养槽的进口和出口,实现体液的流动。
对培养值第7天的类脑组织,进行免疫荧光检测,具体方法为:用10ml移液管将类脑球从培养装置中吸出,进行冰冻切片,厚度为8-10μm;然后分别使用IBA1和DAPI进行染色,上机观测。结果如图10所示。图中蓝色荧光为DAPI细胞核标记物,是类脑中神经细胞的细胞核标记物,代表类脑;图中红色荧光为IBA1,是小胶质细胞的标记物,代表小胶质细胞。从图中可以看出小胶质细胞沿着拼接公母件中的微孔,随着培养基迁徙到了类脑球表面,且部分小胶质迁移进入类脑球内部,提示两者共培养后出现物理上的接触,作为独立或混合状态的疾病模型,可以用于后续研究免疫细胞小胶质-神经发育类脑球在不同时间、空间的相互作用。
实施例3 类脑器官(带内皮细胞)与肺类器官(带内皮细胞)共培养
1.按照实施例1中的方法培育内皮细胞,将内皮细胞分别置于两个第一培养板中;
2.将实施例1制备的类脑器官置于带有公件的第二培养板中;并将一个步骤1中的第一培养板***有公件的第二培养板中;
3.将实施例1制备的肺类器官置于带有母件的第二培养板中;并将一个步骤1中的第一培养板***有母件的第二培养板中;
4.连接两个第二培养板的公件和母件,实现共培养。
结果表明,内皮细胞会通过微针阵列在类脑器官与肺类器官内形成血管网络,而通过公件和母件的连接,类脑器官与肺类器官之间的培养基,血管网络以及神经网络等,均可以通过公件和母件之间形成的通路完成信号的传输。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (8)
1.一种用于不同种类的类器官联合培养的方法,其特征在于,使用类器官联合培养装置,所述装置包括上盖、至少两块第二培养板和与上盖可拆卸连接的共培养槽,所述第二培养板用于培养类器官;
所述第二培养板包括第二基台,所述第二基台的上设有上端开口的培养槽,所述培养槽内设有类器官放置孔;所述第二基台上还有第二培养基加液槽,所述第二培养基加液槽位于培养槽的两侧,并与培养槽相连通;
所述第二培养板的两个侧壁上,对应设置有拼接公件和/或拼接母件;所述拼接公件为向外的凸起,所述拼接母件为与拼接公件匹配的向内的凹槽,相邻的两个第二培养板的拼接公件可拆卸的***连接在拼接母件中,实现两个第二培养板的连接和连通;还包括第一培养板,所述第一培养板用于培养细胞,所述第一培养板与第二培养板可拆卸连接,并且所述第一培养板中培养的细胞通过微针阵列与第二培养板中的类器官相连通;
所述方法包括:将不同类器官或者细胞分别放置在不同的第二培养板中培养,相邻的两个第二培养板通过拼接公件和拼接母件相连接并连通,不同的类器官或者细胞用过拼接公件和拼接母件完成微环境的连通,实现不同种类的类器官的联合培养;
所述方法还包括将不同的类器官或者组织放置在第一培养板中培养并通过微针阵列与第二培养板中的类器官或者细胞相连通的步骤。
2.根据权利要求1所述的用于不同种类的类器官联合培养的方法,其特征在于,所述第一培养板包括第一基板和与第一基板连接的第一基台,所述第一基板的两端连接有第一连接件,所述第一连接件的下部与共培养槽的上沿可拆卸连接,所述第一连接件的上部与上盖的下沿可拆卸连接。
3.根据权利要求2所述的用于不同种类的类器官联合培养的方法,其特征在于,所述方法还包括:将第一培养板安装至第二培养板的上方,分别将细胞添加到第一培养板中;使第一培养板的类器官混合细胞后,将第一培养板盖合在第二培养板上方使微针阵列***类器官组织中,然后进行培养;第一培养板的细胞混同培养基通过微针阵列,利用重力向位于微针阵列末端的不同第二培养板的类器官进行转移,并通过微针阵列末端的开孔,扩散到类器官组织中。
4.根据权利要求2所述的用于不同种类的类器官联合培养的方法,其特征在于,所述第一基台内与第二培养板的培养槽对应的位置设有第一U形加液槽,所述第一U形加液槽中设有至少一个第一细胞培养室,所述第一细胞培养室的下方连接有微针阵列,第一细胞培养室与微针阵列相连通,当第一培养板与第二培养板相连接时,微针阵列的下端***类器官放置孔上培养的类器官组织中。
5.根据权利要求4所述的用于不同种类的类器官联合培养的方法,其特征在于,所述第一基板的两端连接有第一连接件,所述第一连接件的下部与共培养槽的上沿可拆卸连接,所述第一连接件的上部与上盖的下沿可拆卸连接。
6.根据权利要求1所述的用于不同种类的类器官联合培养的方法,其特征在于,所述第二培养板的培养槽内设有至少两个类器官放置孔,所述类器官放置孔的周围设有定位桩;相邻的两个类器官放置孔之间设有组隔板,组隔板与培养槽的底壁相连接,与培养槽的侧壁之间留有孔隙。
7.根据权利要求6所述的用于不同种类的类器官联合培养的方法,其特征在于,所述拼接公件和拼接母件上均设有连通培养槽的微孔阵列,所述第二培养板的侧壁上设有连通培养槽的微孔阵列,所述拼接公件和拼接母件连接时,微孔阵列相连通。
8.根据权利要求1-7任一所述的用于不同种类的类器官联合培养的方法,其特征在于,所述类器官为类脑器官、心脏类器官、肾脏类器官、肠道类器官、肺类器官中的任一种。
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Citations (6)
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---|---|---|---|---|
WO2018081616A1 (en) * | 2016-10-27 | 2018-05-03 | Ohio State Innovation Foundation | Bioengineering of injectable encapsulated aggregates of pluripotent stem cells for therapy of myocardial infarction |
CN111269833A (zh) * | 2018-12-05 | 2020-06-12 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法 |
CN113577389A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-02 | 中国医学科学院整形外科医院 | 一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料及制备方法和应用 |
CN116179353A (zh) * | 2021-11-29 | 2023-05-30 | 上海新微技术研发中心有限公司 | 一种多器官芯片串联***及多器官芯片构建方法 |
CN116445285A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-07-18 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种类器官共培养芯片、构建方法及共培养方法 |
CN117004559A (zh) * | 2022-04-29 | 2023-11-07 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种人多能干细胞来源的脑和心肌复合模型的构建方法 |
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018081616A1 (en) * | 2016-10-27 | 2018-05-03 | Ohio State Innovation Foundation | Bioengineering of injectable encapsulated aggregates of pluripotent stem cells for therapy of myocardial infarction |
CN111269833A (zh) * | 2018-12-05 | 2020-06-12 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法 |
CN113577389A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-02 | 中国医学科学院整形外科医院 | 一种来自猪耳软骨的脱细胞软骨材料及制备方法和应用 |
CN116179353A (zh) * | 2021-11-29 | 2023-05-30 | 上海新微技术研发中心有限公司 | 一种多器官芯片串联***及多器官芯片构建方法 |
CN117004559A (zh) * | 2022-04-29 | 2023-11-07 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种人多能干细胞来源的脑和心肌复合模型的构建方法 |
CN116445285A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-07-18 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种类器官共培养芯片、构建方法及共培养方法 |
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