CN112442484A - 一种基于多孔纳米级温敏软胶体的细胞大规模培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学材料技术领域，具体是一种基于多孔纳米级温敏软胶体的细胞大规模培养的方法。本发明方法以多孔纳米级温敏软胶体与细胞或组织培养物混合，液态输送至中空柱反应器中，在32‑37℃条件下固化进行培养。本发明培养方法，细胞洗脱过程不需要胰酶消化对细胞没有任何影响，而且方便扩增到更多级别的反应器中。一般第一级的细胞扩增后密度可以达到108每毫升，通过温度变化使胶体载有细胞一同消化下来，重复之前接种的做法将细胞输入进其他反应器中，以实现扩增，或者扩大中空柱腔体的直径以达到扩大体积的做法，通过扩大中控纤维柱的数量来实现工艺放大，培养体积放大。

Description

一种基于多孔纳米级温敏软胶体的细胞大规模培养的方法
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种用于基于多孔纳米级温敏软胶体和中空柱的细胞大规模培养的方法，可以较大面积的3D培养动物干细胞或其他组织细胞。
背景技术
随着现代医学的发展，对动物干细胞或其他组织细胞的大规模扩增需求越加旺盛。使用CHO细胞表达单克隆抗体的生物制药行业已经使得悬浮培养细胞的工艺非常成熟，实现了数以万升级别的商业化生产。培养CHO细胞的设备也随着技术的进步不断的扩增到万升级别。但是这些***有着他们的局限性。例如，大部分贴壁细胞无法直接悬浮在10L以上体积的反应器内。大部分用于细胞治疗的原代组织细胞无法直接在悬浮培养体系下扩增，而即使扩增其细胞特征标志物的表达也差异极大，给治疗的效果和安全性代来很大的调账。另外，即使使用微载体工艺，多次扩增过程中的消化工艺也会对细胞代来极大的损伤。因此，可以归纳总结为，适用于传统的悬浮培养反应器并一定适用于干细胞或其他特定的组织细胞。
在CarT细胞治疗，干细胞治疗和未来的组织工程治疗中的细胞扩增密度一般在107-108每公斤的量级，即人体的一次临床注射需要109到1010次方级别的细胞。传统的培养方式主要有贴壁细胞培养和3D液态细胞培养。贴壁细胞培养一般为常规实验室的方瓶培养或使用商业化的多层细胞工厂进行，但是一方面由于细胞只生长在一个平面上，因此培养的利用面积非常有限，往往每平方厘米范围内只能有104级别的细胞，如果要达到109-1010级别的细胞数量，需要大量的细胞工厂货细胞板堆叠，需要大量的人工和检测工作，而且一旦感染其他病毒或微生物对病人来说都是致命的。除此之外平板培养属于2D培养，没有类似动物体内3D的组织结构，因此多项研究表面2D培养条件下，很多干细胞没有在动物体内培养的生物特征标记物，在某些基因表达上也存在很大的差异，会使得细胞治疗的效果大打折扣。第二种传统的培养方式为悬浮培养，比如滚瓶，摇瓶或类似Wave波浪式反应器等小型剪切力可控的生物反应器，该种方法的优点在于大大的扩增了三维的培养空间，因此其细胞密度可以大大提高，但是由于悬浮培养一般都带来流体的剪切和空气气泡对细胞代来的剪切伤害，治疗用的干细胞或组织往往都是原代细胞，对流体或者空气气泡代来的剪切极其的敏感，因此也有学者指出在该种环境下生长的细胞也会丢失一些生物特征标记物或在基因表达上显现出差异。此外，行业中也有不少微载体工艺的应用，先将干细胞或组织细胞先贴附在微载体上，然后在进行悬浮培养，微载体表面一般与细胞表面进行化学键或物理键的连接。微载体的培养工艺有效的处理了流体和气泡的剪切力对细胞的影响，使得细胞在一定程度上适应了反应器内液态悬浮培养的条件。但是微载体工艺的弊端在于细胞与微载体的分离往往都需要复杂的工艺。据应用最为广泛的美国通用电气推出的cydexII微载体，就需要用胰酶或其他化学药剂进行消化，而消化的过程往往会对细胞代来严重的伤害。而在细胞扩增，逐级放大的过程中细胞需要经历若干次的消化，细胞的受损严重，因此此种工艺一般只能应用在较小体积范围内。
此外，新兴的培养工艺还有中空纤维柱培养设备，一般由外部套筒和中间的中空纤维柱组成。内部的中空纤维柱以平行阵列的方式包含数千个半渗透中空纤维。中空纤维内部与外部形成两个腔体，单独的液体进出口。一般情况下细胞贴附在中空纤维柱的内壁或者外壁，另外一侧循环培养基，氧气等营养成分。提供了一个类贴壁的培养环境，又避免了悬浮培养剪切力对干细胞或其他组织等的影响。其最大的问题在于依然需要使用胰蛋白酶或其他类似物进行洗脱，大大的影响细胞的活性和工艺放大的可能性。其次，其中空纤维的表面依然是2D的环境，尽管很多更新的设计优化了中空纤维柱的表面变成多孔等结构，但是依然很难模拟3D的组织环境，会影响到细胞表面特征蛋白的表达以及整个细胞的基因水平表达。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种基于多孔纳米级温敏软胶的中空柱细胞大规模培养的方法，可以较大面积的3D培养动物干细胞或其他组织细胞，可以有效保证细胞或组织培养物在大规模培养过程中的3D组织支撑的物理环境以及其他温度，氧气，营养物质的供应，从而保证细胞的生物活性，生物特征标记物及基因表达的正确性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明一方面提供了一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，所述方法以多孔纳米级温敏软胶体与细胞或组织培养物混合，液态输送至中空柱反应器中，在32-37℃条件下固化进行培养。
上述技术方案中，进一步地，所述方法以细胞培养***进行培养，所述***包括：细胞培养维持单元，中空柱反应器，接种及收获单元；细胞培养维持单元为中空柱反应器内的细胞或组织培养物提供营养物质并维持中空柱反应器内温度。
上述技术方案中，进一步地，所述细胞培养维持单元包括培养基容器，罐外控温夹套，透析装置，检测电极以及气体质量控制模块；气体的质量流量与溶液中溶氧和pH值关联控制；所述接种及收获单元包括带有温控装置的罐体，罐体内设有检测电极、培养基透析装置、气体传输***，气体传输***将气体通入罐体内，通过控制氧气与空气或氧气与氮气的比例控制培养基中溶解氧浓度，还有通过控制二氧化碳浓度控制溶液中pH的值在酸方向上的控制；所述中空反应器包括中空柱，中空反应器上下两端分别设有细胞入口和细胞出口，中空反应器侧面设有培养基入口和培养基出口。
上述技术方案中，进一步地，所述透析装置为半透膜透析袋；所述检测电极包括温度电极，溶液中溶氧电极，pH电极，活细胞电极；所述气体质量控制模块包括气体质量流量计和空气分布器。
上述技术方案中，进一步地，所述中空柱反应器的中空柱表面为致密多孔结构，其孔道表面经亲疏水处理或正负电荷处理，温敏多孔纳米级软胶体与细胞或组织的培养物在孔道内缓慢流动；所述致密多孔结构为辐照刻蚀多孔，纤维状多孔，烧结多孔或激光加工、机械加工、注塑的多孔；纤维状多孔的形成为纤维堆叠，烧结多孔为多孔贯穿结构；所述多孔的孔径为0.2-100um，可以渗流中空柱反应器外腔体的培养基与气体等进行物质交换；所述中空柱的直径为2-50mm，长度为10-1000mm，个数随着反应器体积的增加持续增加，通过增加中空柱直径、长度、个数等方式增加中空柱反应器的几何尺寸，以扩大细胞扩增水平；；中空柱平行阵列，形成圆形，长方形或六边形以便于封装；所述中空柱外壁与反应器内壁密闭空腔，中空柱内壁与反应器的细胞入口形成密闭空腔，两个空间彼此独立。
上述技术方案中，进一步地，所述中空柱反应器的中空柱多个单体串联或并联以增加中空柱反应器的体积，使细胞的扩增数量大幅度的扩大。
上述技术方案中，进一步地，所述中空柱的材质为PVDF、PMMA、PC、PE、PTFE、PP、尼龙、PES、PET或烧结多孔材料，柱壁孔的形成特征可以为纤维状堆叠，烧结也可以为多孔贯穿结构。
上述技术方案中，进一步地，所述中空柱反应器液体培养体积为10ml～10L，培养密度为1×107-10×107cells/ml，其中，细胞、类器官组织或肿瘤组织与软胶体的体积比达到0.6-0.85。
本发明另一方面提供了一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：
(1)多孔纳米级软胶体与细胞或组织培养物混合后，控制温度在20-25℃，输送至中空柱中，使中空柱腔体内壁面贴附满多孔纳米级软胶体与细胞混合物；所述多孔纳米级软胶体的浓度为30mg/mL-50mg/mL；
(2)培养基容器内设定温度32-37℃，从反应器侧壁注入培养基，实现温度和营养物质的传递，中空柱细胞和胶体混合物升温，直至胶体形态转变为固态进行细胞培养；
(3)细胞扩增过程中，培养基循环保持在32-37℃，通过pH电极，温度电极，溶氧电极，活细胞电极的参数值不断的调整反应器进气氧气浓度，二氧化碳浓度等参数以保证培养基中溶解氧气浓度和pH值浓度适合细胞培养，不断的调整培养基中营养物浓度和各种细胞生长需要的生长因子浓度，并且不断的监控并稀释细胞代谢产物的浓度，以保证反应器内的细胞代谢产物的排出；
(4)细胞收获过程，将培养基循环温度降低到20-25℃，中空柱细胞和胶体混合物温度降低，胶体渐渐变成可流动的液体，此时向中空柱中通入PBS缓冲液，将细胞与软胶体洗出；离心分离细胞或通过培养基体系洗出细胞；
上述技术方案中，进一步地，对于外泌体或胞外表达蛋白生产，步骤(4)中细胞洗出分离后，再以PBS缓冲液重新悬浮细胞，再次分离，以PBS重复悬浮3次分离后，再与多孔纳米级软胶体输送至中空柱中，同时培养基置换为无血清培养基重新灌入中空柱中培养，培养后离心分离得到上清液中外泌体或胞外表达蛋白。
上述技术方案中，进一步地，对于外泌体或胞外表达蛋白生产，步骤(4)中以PBS缓冲液重新悬浮细胞，将缓冲液中细胞分离后，置换为无血清培养基重新灌入中空反应器中培养，培养后离心分离得到上清液中外泌体或胞外表达蛋白。
本发明培养方法主要针对动物干细胞(包括人体)，动物细胞组织进行扩增，通过分离胶体与培养基对外泌体，胞外表达蛋白进行分离以连续生产外泌体和蛋白类药物。培养方法通过培养基循环存储单元中培养基温度的变化，通过错流壁面传热控制中空柱内的温敏胶体变成固体或者液体，从而控制细胞的生长环境和工艺过程中的接种或换液等工艺，从而大规模的培养细胞或组织培养物。在20-25℃范围内，细胞与温敏多孔纳米级软胶体混合物为液态，可流动。温度在32-37℃时，细胞与温敏胶体混合物为固体，凝固于壁面，该状态下为培养状态。在培养过程中，液体状态与固体状态可多次切换。可以多次用泵抽出，离心，进行换液，取样等操作。
本发明的有益效果：本发明培养方法，细胞洗脱过程不需要胰酶消化，对细胞没有任何影响，而且方便扩增到更多级别的反应器中。一般第一级的细胞扩增后密度可以达到108每毫升，通过温度变化使胶体载有细胞一同消化下来，重复之前接种的做法将细胞输入进其他反应器中，以实现扩增，或者扩大中空柱腔体的直径以达到扩大体积的做法，通过扩大中空柱的数量来实现工艺放大，培养体积放大。
附图说明
图1基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法工艺流程图；
图中，1.中空柱反应器，2.培养基循环***，3.细胞与多孔纳米级软胶体循环***，4.培养基容器，5.罐外控温夹套，6.透析装置，7.检测电极，8.气体质量流量计，9.气体质量流量计，10.罐体，11.气体传输***，12.细胞入口，13.细胞出口，14.培养基入口，15.培养基出口；
图2中空柱结构示意图；
图3多孔纳米级软胶体中细胞的营养物质交换与气体交换原理图；
图4中空柱单元的结构图；a.主视图，b.侧视图；
图5乳腺癌MCF，乳腺癌MDA细胞系肿瘤球计数图；
图6乳腺癌MCF，乳腺癌MDA细胞DNA含量图；
图7乳腺癌MCF，乳腺癌MDA细胞代谢活性图；
图8乳腺癌MDA细胞系培养图；
图9乳腺癌MCF细胞系培养图；
图10小鼠骨髓间充质干细胞细胞浓度随时间的变化图；
图11大规模培养方法流程图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。实施例中所用的多孔纳米软胶体依照专利CN 111286483 A中实施例的方法制备得到。
实施例1
如图1所示，基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，以多孔纳米级软胶体与细胞或组织培养物混合，置于接种及收获单元，液态输送至中空柱反应器中37℃培养，培养过程中以细胞培养维持单元为中空纤维柱反应器内的细胞或组织培养物提供营养物质并维持中空纤维柱反应器内温度。
本发明培养方法以细胞培养***进行培养，***包括细胞培养维持单元，中空柱反应器，接种及收获单元；接种及收获单元包括带有温控装置的罐体10，罐体内设有检测电极7、培养基透析袋6、气体传输***11。细胞培养维持单元包括培养基容器4，罐外控温夹套5，透析装置6，检测电极7以及气体质量控制模块，气体质量控制模块包括气体质量流量计8和空气分布器9，气体质量流量计8内涵4路气体流量计，分别是空气，二氧化碳，氧气和氮气；检测电极包括温度电极，溶液中溶氧电极，pH电极，活细胞电极；气体的质量流量与溶液中溶氧和pH值关联控制，透析装置采用透析袋。细胞培养维持单元中采集离线的培养基成分信息，得到营养物质的浓度变化并通过补料等维持营养物质浓度。通过分析代谢产物浓度，通过培养基循环体系中的透析袋不断调整培养基的稀释比例以减小代谢产物对细胞的影响。细胞培养维持单元中的空气分布器，与培养基中液体部分进行气体传质交换。中空柱反应器包括中空柱，中空柱反应器上下两端分别设有细胞入口12和细胞出口13，中空柱反应器侧面设有培养基入口14和培养基出口15。
多孔纳米级软胶体与细胞或组织培养物混合后置于罐体10中，控制温度在20-25℃，通过管路，经细胞入口12输送至中空柱中，中空柱腔体内壁面贴附满多孔纳米级软胶体与细胞混合物，多孔纳米级软胶体的浓度为30mg/mL-50mg/mL；培养基容器4内设定温度32-37℃，经管路从培养基入口14注入培养基，实现维度和营养物质的传递，中空柱细胞和胶体混合物升温，直至胶体形态转变为固态进行细胞培养；细胞扩增过程中，培养基循环保持在32-37℃，通过pH电极，温度电极，溶氧电极，活细胞电极的参数值不断的调整反应器进气氧气浓度，二氧化碳浓度等参数以保证培养基中溶解氧气浓度和pH值浓度适合细胞培养，不断的调整培养基中营养物浓度和各种细胞生长需要的生长因子浓度，并且不断的监控并稀释细胞代谢产物的浓度，以保证反应器内的细胞代谢产物的排出；培养结束后将培养基循环温度降低回20-25℃，中空柱细胞和胶体混合物温度降低，胶体渐渐变成可流动的液体，此时向中空柱中通入PBS缓冲液，将细胞与软胶体洗出；离心分离细胞或通过培养基体系洗出细胞。
以下实施例中反应器中中空纤维柱的个数为40根，中空纤维的直径为4mm，长度为20mm，中空纤维柱表面为致密多孔结构，孔道表面进行化学嫁接处理，通过酸洗产生羟基并与嫁接化学试剂接触，使其表面附着正电荷和超亲水基团马来酸酐处理以适合胶体附着，致密多孔为以纤维堆叠形成的纤维状多孔，孔径为0.2um，，中空纤维柱的材质为PET，中空纤维柱平行阵列排列，截面成圆形。
如图2、图3所示，纤维柱侧边为多孔结构，孔径在0.2um之间，营养物质以培养基的形式与纤维柱、多孔纳米软胶上的细胞或细胞球进行物质交换，气体可以通过管内壁的方式与软胶包裹的细胞或细胞球进行物质交换，以完成营养物质和气体的交换。
如图11所示，用于大规模培养时，可以增加单个中空柱的体积从而增加单个中空反应器的体积，或者增加中空反应器个数，串联一起使用，以进行大规模细胞培养。
实施例1
将子乳腺癌MCF，乳腺癌MDA细胞系肿瘤球及其ThermoFisher DMEM+10％FBS培养液，10倍的磷酸盐缓冲液以及50毫克每毫升的多孔纳米软胶体以1：1：3的配比比例混合，接种到中空纤维柱中，在37℃的温度条件下，培养基循环条件为培养基中溶解氧浓度控制在5％-6％，pH维持在7.4，培养21天后，将温度降低至25℃，细胞板室温下流出，从而收获细胞。结果如图4～6所示，细胞在培养设备中扩增，其中MFC细胞球相比之前数量增加了4倍，细胞球体积也有很大程度的增加，由于MDA肿瘤形态不是球状因此无法计数。但是DNA含量显著增加表示细胞的扩增水平。其形态的变化如图7，8所示，由于胶体的3D支撑特性，基本保持了肿瘤细胞在人体内的细胞形态特征。细胞表面生物标志物均有正常保持。
实施例2
将小鼠骨髓间充质干细胞及其ThermoFisher alpha MEM+10％FBS培养液，10倍的磷酸盐缓冲液以及50毫克每毫升的软胶体以1：1：3的配比比例混合，接种到中空纤维柱中，在37℃的温度条件下，培养基循环条件为培养基中溶解氧浓度控制在5％-6％，pH维持在7.4下培养培养21天后，将温度降低至25℃，细胞板室温下流出，从而收获细胞。AlamarBlue用来检测释放细胞的活性。结果如图9所示，细胞在软胶体可以有效且方便的促进间充质干细胞生长以及繁殖。
实施例3
对于外泌体的生产，以实施例2的方法进行培养，在培养第7天后，通过细胞培养维持单元的培养基维持中空柱降温到25℃，待细胞与胶体变成液态，抽出中空反应器外离心、过滤分离，以PBS缓冲液重新悬浮细胞，再次分离，以PBS重复悬浮3次分离后，再与多孔纳米级软胶体输送至中空柱中，同时培养基换成无血清培养基重新灌入中空柱中，培养12小时，然后换成新的无血清培养基培养48小时。收集后的无血清培养基可以用来超高速离心来分离完成上清液中外泌体。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述方法以多孔纳米级软胶体与细胞或组织培养物混合，液态输送至中空柱反应器中，在32-37℃条件下固化进行培养。
2.根据权利要求1所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述方法以细胞培养***进行培养，所述***包括：细胞培养维持单元，中空柱反应器，接种及收获单元；细胞培养维持单元为中空柱反应器内的细胞或组织培养物提供营养物质并维持中空柱反应器内温度。
3.根据权利要求2所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述细胞培养维持单元包括培养基容器(4)，罐外控温夹套(5)，透析装置(6)，检测电极(7)以及气体质量控制模块；气体的质量流量与溶液中溶氧和pH值关联控制；所述接种及收获单元包括带有温控装置的罐体(10)，罐体内设有检测电极(7)、培养基透析装置(6)、气体传输***(11)；所述中空反应器包括中空柱，中空反应器上下两端分别设有细胞入口(12)和细胞出口(13)，中空反应器侧面设有培养基入口(14)和培养基出口(15)。
4.根据权利要求3所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述透析装置为半透膜透析袋；所述检测电极包括温度电极，溶液中溶氧电极，pH电极，活细胞电极；所述气体质量控制模块包括气体质量流量计(8)和空气分布器(9)。
5.根据权利要求2所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述中空柱反应器的中空柱表面为致密多孔结构，孔道表面经亲疏水处理或正负电荷处理；所述致密多孔结构为辐照刻蚀多孔，纤维状多孔，烧结多孔或激光加工、机械加工、注塑的多孔；所述多孔的孔径为0.2-100um，所述中空柱的直径为2-50mm，长度为10-1000mm，个数随着反应器体积的增加持续增加；中空柱平行阵列，形成圆形、长方形或六边形以便于封装；所述中空柱外壁与反应器内壁密闭空腔，中空柱内壁与反应器的细胞入口形成密闭空腔，两个空间彼此独立。
6.根据权利要求2所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述中空柱反应器的中空柱多个单体串联或并联以增加中空柱反应器的体积。
7.根据权利要求2所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述中空柱的材质为PVDF、PMMA、PC、PE、PTFE、PP、尼龙、PES、PET或烧结多孔材料。
8.根据权利要求2所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述中空柱反应器液体培养体积为10ml～10L，培养密度为1×107-10×107cells/ml，其中，细胞、类器官组织或肿瘤组织与软胶体的体积比达到0.6-0.85。
9.根据权利要求1所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)多孔纳米级软胶体与细胞或组织培养物混合后，控制温度在20-25℃，输送至中空柱中，使中空柱腔体内壁面贴附满多孔纳米级软胶体与细胞混合物；所述多孔纳米级软胶体的浓度为30mg/mL-50mg/mL；
(2)培养基容器内设定温度32-37℃，从反应器侧壁注入培养基，实现温度和营养物质的传递，中空柱细胞和胶体混合物升温，直至胶体形态转变为固态进行细胞培养；
(3)细胞扩增过程中，培养基循环保持在32-37℃，通过pH电极，温度电极，溶氧电极，活细胞电极的参数值不断的调整反应器进气氧气浓度，二氧化碳浓度等参数以保证培养基中溶解氧气浓度和pH值浓度适合细胞培养，不断的调整培养基中营养物浓度和各种细胞生长需要的生长因子浓度，并且不断的监控并稀释细胞代谢产物的浓度，以保证反应器内的细胞代谢产物的排出；
(4)细胞收获过程，将培养基循环温度降低到20-25℃，中空柱细胞和胶体混合物温度降低，胶体渐渐变成可流动的液体，此时向中空柱中通入PBS缓冲液，将细胞与软胶体洗出；离心分离细胞或通过培养基体系洗出细胞。
10.根据权利要求1所述的一种基于多孔纳米级软胶体的细胞培养方法，其特征在于，对于外泌体或胞外表达蛋白生产，步骤(4)中细胞洗出分离后，再以PBS缓冲液重新悬浮细胞，再次分离，以PBS重复悬浮3次分离后，再与多孔纳米级软胶体输送至中空柱中，同时培养基置换为无血清培养基重新灌入中空柱中培养，培养后离心分离得到上清液中外泌体或胞外表达蛋白。
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