CN211713118U - 一种用于类器官球体培养的孔板装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及生物细胞培养技术领域，进一步涉及类器官培养领域，具体涉及一种用于类器官球体培养的孔板装置，其包括孔板盖、多个培养孔单元和孔板底座，所述培养孔单元可拆卸地安装在所述孔板底座中，培养孔单元由上到下包括定位缓冲环、第一导流腔和第二类器官球体培养腔。本实用新型可实现对类器官细胞球的安全换液操作，缩短细胞球的成球时间，避免形成卫星细胞球，极佳的显微成像果以及兼容组织制片技术便于后期对类器官细胞球进行组织切片分析，有望为构建三维类器官细胞球模型提供一种新的研究工具。

Description

一种用于类器官球体培养的孔板装置

技术领域

本实用新型涉及生物细胞培养技术领域，进一步涉及类器官培养领域，具体涉及一种用于类器官球体培养的孔板装置。

背景技术

类器官(Organoids)是一种在体外培育而成的具有来源器官显微解剖特征的多细胞三维结构。类器官的工具细胞主要为组织特异性多能干细胞或前体细胞。迄今为止，来源于多种器官的类器官业已面世，包括脑、肠道、胃、舌、甲状腺、胸腺、睾丸、肝脏、胰腺、皮肤、肺、肾、心脏及视网膜。除了来源于健康组织的类器官，大量疾病模型(包括肿瘤模型)的类器官也不断涌现。类器官的主要特征包括基于细胞类别的自我组织及空间限制的定向分化，与体内发育过程相似。他们含有多种器官特异性细胞，这些细胞的空间组织、排列与来源器官类似。因此，类器官不仅可用于药物的毒性检测、药效评价和新药筛选等，用于建立疾病模型研究遗传病、传染病和癌症，还可用于精准医疗、研究组织器官发育及用于组织器官的移植和修复。

目前，类器官培养技术主要分为依赖外源支架的三维培养技术和不依赖外源支架的三维培养技术。其中，依赖外源支架的三维培养技术主要是在三维空间内构建细胞附着和生长的类似脚手架的多孔结构，细胞依附于支架进行三维生长、迁移和聚集，主要的支架材料有细胞外基质和各类水凝胶等。但是，支架的空间占位影响细胞形成规则致密的类器官三维结构，影响细胞生长分化，培养类器官体积偏小，最终导致形成类器官三维结构过程周期过长，此外动物源或人源的支架材料有一定病原风险，且这类材料可能存在批次差别性。另外，依赖外源支架的三维培养技术大多存在操作过程复杂，后续检测操作不便和成本高昂等问题，离理想的类器官培养模型还存在较大的差距。为了弥补依赖外源支架的三维培养技术的不足，不依赖外源支架的三维培养技术近年逐渐受到重视，该技术主要是

通过物理方法使悬浮于培养基中的细胞聚集到一定密度形成紧密的细胞-细胞连接，使其自组装成为不依赖外源支架结构的类器官三维结构。目前应用于市场的技术方法主要有悬浮法，悬滴法和低粘附表面法。其中，悬浮培养法可制备大量类器官细胞球，但是得到的细胞球大小不一，所制备的类器官细胞球缺乏可控性，应用受到很大限制。悬滴法可很好地控制细胞球的分布和大小，但是商用化产品结构复杂，操作繁琐且转移过程须谨慎小心防止悬滴脱落，且不能大量制备。而低粘附表面法主要利用经低粘附表面修饰的U型和V型孔板促进细胞聚集于凹孔底部形成类器官细胞球，因其相对结构简单及操作方便而被更多的研究人员采用。然而，目前用于类器官细胞球培养的U型和V型孔板仍具有许多严重缺陷：首先，目前商用的U型和V型孔板中细胞培养孔的侧壁到凹型底部中心均采用平滑的弧形过渡结构，在更换培养液或添加药液时，由于平滑的弧形过渡结构的导流作用，凹型底部中心易受到高速流体冲击，其中所培养的类器官细胞球经常被吹出指定的培养区域，或由于极高的流体剪切力导致细胞球外表面细胞受到不同程度的损伤甚至坏死；另外，U型孔板培养孔底部的半圆形凹孔结构的曲率过小，导致接种的细胞形成致密的类器官细胞球时间过长，且极易形成不规则类器官细胞球(例如，产生多个卫星细胞球)，虽然V型孔板提高了培养孔底部的半圆形凹孔结构的曲率，但是相对常用直径为50-500μm的类器官细胞球培养仍然存在细胞聚球过程时间过长，且目前商用的V型孔板培养孔底部的外部轮廓也是采用弧度设计这也导致光在外部空气与培养孔底部外部轮廓界面处产生严重折射，造成V型孔板中的类器官细胞球的显微成像效果不佳；最后，组织制片技术是观察类器官细胞球生理和病理形态变化的一种主要的方法，目前的U型和V型孔板并无法兼容这一技术要求，其细胞培养孔结构均采用一体化设计造成样品包埋后不经暴力破坏后非常难取出进行后续切片操作，为了对细胞球进行制片分析往往需要先将细胞球取出后再在进行包埋处理并进行后续切片操作，这就导致了取出后的细胞球包埋位置不固定，切片时定位困难，这极大限制了研究人员对类器官细胞球的检测操作并难以实现大规模高通量检测。

有鉴于此，特提出本实用新型。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种用于类器官球体培养的孔板装置，该孔板装置通过可拆卸地安装若干经结构优化的培养孔单元，可实现对类器官细胞球的安全换液操作，缩短细胞球的成球时间，避免形成卫星细胞球，极佳的显微成像效果以及兼容组织制片技术便于后期对类器官细胞球进行组织切片分析。

为了实现上述目的，本实用新型提供的一种用于类器官球体培养的孔板装置，包括孔板盖、多个培养孔单元和孔板底座，所述培养孔单元可拆卸地安装在所述孔板底座中，所述培养孔单元由上到下包括定位缓冲环、第一导流腔和第二类器官球体培养腔。

进一步地，所述孔板底座上设置有若干孔，所述培养孔单元可拆卸地安装在所述孔板底座的孔中。

进一步地，所述培养孔单元由高分子有机硅化合物或水凝胶材料制成。

进一步地，所述定位缓冲环的宽度为0.2-1mm。

进一步地，所述第一导流腔为倒圆锥形，其中心截面处的夹角为60-150°。

进一步地，所述第二类器官球体培养腔为倒圆锥形，其中心截面处的夹角为30-120°。

进一步地，所述第二类器官球体培养腔的倒圆锥形的底部为半球形，其半径为0.2-1.5mm。

进一步地，所述第二类器官球体培养腔的底部与所述培养孔单元下表面之间的距离为0.1-1mm。

进一步地，所述第一导流腔的下部开口与所述第二类器官球体培养腔的上部开口相匹配，以形成一体的异形倒圆锥结构。

进一步地，当所述培养孔单元安装在所述孔板底座的孔中时，所述培养孔单元与所述孔板底座的孔相接触的底部接触面和外底面为光滑、透明平面。

本实用新型提供了一种用于类器官球体培养的孔板装置的技术方案，能够较好解决现有相关商用技术的不足。本实用新型的有益效果是：与现有的商用类器官细胞球制备技术相比，主要有如下几个优点：

(1)本实用新型所涉及的孔板装置，通过培养孔单元中的定位缓冲环结构，即可实现移液器枪头的精确定位，又可用于缓冲液体换液过程中产生的高速液体冲击和扰动，避免类器官细胞球被吹出指定的培养区域，或由于极高的流体剪切力导致细胞球外表面细胞受到不同程度的损伤甚至坏死。

(2)本实用新型所涉及的孔板装置，通过第一导流腔和第二类器官球体培养腔的双倒圆锥形结构，在有限的空间中使较大的培养孔直径快速地汇聚为较小直径，即实现了兼容标准化96或384孔板结构，又可实现类器官细胞球的快速形成并避免卫星细胞球的产生。

(3)本实用新型所涉及的孔板装置，通过设置培养孔单元与孔板底座中孔的底部接触面和外底面均为光滑、透明平面，最大程度降低光在外部空气与培养孔底部外部轮廓界面处产生的折射，实现类器官细胞球的最佳显微成像效果。

(4)本实用新型所涉及的孔板装置，通过设置可拆卸地嵌入的培养孔单元，便于类器官细胞球的原位包埋处理，同时在不破坏孔板装置下任意取出经包埋的细胞球并快速对细胞球进行定位切片，极大地降低研究人员对类器官细胞球的切片检测操作难度并容易实现大规模高通量检测。

附图说明

图1为本实用新型所述孔板装置的整体结构示意图；

图2为本实用新型所述孔板装置中的培养孔单元的中心截面图；

图3A为本实用新型所述孔板装置中的培养孔单元与孔板底座组装后的中心截面图；

图3B为本实用新型所述孔板装置中的培养孔单元与孔板底座组装后的俯视图；

图4为本实用新型所述孔板装置中培养孔单元取出方式示意图；

图5为不同类器官球体培养孔板中细胞球状态对比图(培养3天)；

图6为不同类器官球体培养孔板中细胞球的成球时间对比图；

图7为经5次换液后不同类器官球体培养孔板中细胞球的丢失率对比图；

图8为本实用新型所述孔板装置中培养的类器官细胞球切片结构图。

图中：

1.孔板盖，2.培养孔单元，3.孔板底座，2-1.定位缓冲环，2-2.第一导流腔，2-3.第二类器官球体培养腔，3-1.底部接触面，3-2.外底面。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本实用新型方案，下面结合具体实施方式对本实用新型作进一步的详细说明。

根据附图1，本实用新型的用于类器官球体培养的孔板装置，包括孔板盖1、若干培养孔单元2和孔板底座3。孔板底座3上设置有若干孔，培养孔单元2可拆卸地安装在孔板底座3上的孔中。

孔板底座3可以为兼容商用标准格式的96孔板或384孔板。

培养孔单元2由透明、无毒且具有弹性的高分子有机硅化合物或水凝胶等材料制成。

根据附图2，培养孔单元2包括定位缓冲环2-1、第一导流腔2-2和第二类器官球体培养腔2-3。定位缓冲环2-1位于培养孔单元2的顶部。定位缓冲环2-1可以实现移液器枪头的精确定位，还可以缓冲液体换液过程中产生的高速液体冲击和扰动。第一导流腔2-2位于培养孔单元的中心轴位置，其横截面为上下方均有开口的倒圆锥形，第一导流腔2-2的上方开口位于培养孔单元2的上表面处。第二类器官球体培养腔2-3位于第一导流腔2-2的下方，其横截面为上方具有开口的倒圆锥形，该倒圆锥形的下表面为半球形，第二类器官球体培养腔2-3的上方开口与第一导流腔2-2的下方开口连接，并且两个开口的形状相同。通过第一导流腔2-2和第二类器官球体培养腔2-3的双倒圆锥形结构，能够在有限的空间中使较大的培养孔直径快速地汇聚为较小直径，进而可以实现类器官细胞球的快速形成并避免卫星细胞球的产生。

培养孔单元2的定位缓冲环2-1的宽度W为0.2-1mm。培养孔单元2的第一导流腔2-2的倒圆锥形的中心截面处的夹角θ为60-150°。培养孔单元2的第二类器官球体培养腔2-3的倒圆锥形的中心截面处的夹角α为30-120°，并且其底部半球形的半径R为0.2-1.5mm，第二类器官球体培养腔2-3的底部与培养孔单元2下表面之间的距离H为0.1-1mm。

根据附图3A-B，培养孔单元2能够可拆卸地安装在孔板底座3中，当培养孔单元2安装在孔板底座3中时，培养孔单元2安装在孔板底座3中孔的底部，并且侧面与孔的内侧面相接触；并且培养孔单元2与孔板底座3中孔的底部接触面3-1和外底面3-2为光滑、透明的平面。光滑、透明的平面能够最大程度降低光在外部空气与培养孔底部外部轮廓界面处产生的折射，实现类器官细胞球的最佳显微成像效果。

通过培养孔单元2与孔板底座3之间的可拆卸结构，能够便于类器官细胞球的原位包埋处理，同时在不破坏孔板装置下任意取出经包埋的细胞球并快速对细胞球进行定位切片，极大地降低研究人员对类器官细胞球的切片检测操作难度并容易实现大规模高通量检测。

通过以下的实施例，能够体现出本实用新型的用于类器官球体培养的孔板装置相比于现有的商用的类器官球体培养孔板的优点。

实施例1

类器官细胞球培养实验：取人肝癌细胞HepG2,培养于DMEM高糖培养基中(含10％胎牛血清，及双抗：青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为100μg/ml)，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，定期观察细胞生长状态，每2-3天用胰酶消化并进行传代培养；随后，取不超10代的HepG2细胞消化并重悬在细胞培养基中，以1000个/孔的密度分别接种到商用的类器官球体培养孔板(即，U型孔和V型孔板)和本实用新型所述孔板装置中进行培养，每2小时观察细胞的状态并记录每种孔板中形成致密细胞球的时间；并在3天后，对3种孔板中的细胞球状态进行显微镜拍照。如图5所示，商用的U型类器官球体培养孔板由于底部的半圆形凹孔结构的曲率过小，造成细胞成球效果较差，在培养孔中形成大量大小不一的卫星细胞球且影响不同孔中细胞球形态的比较分析；而V型类器官球体培养孔板虽然改善了细胞成球效果，但其培养孔底部的外部轮廓也是采用弧度设计这也导致光在外部空气与培养孔底部外部轮廓界面处产生严重折射，造成V型孔板中的类器官细胞球的显微成像效果不佳且显微对焦困难；而本实用新型所述孔板装置中培养的肝癌类器官细胞球在保证较好的成球效果下又可见清晰的边缘轮廓达到很好的显微成像效果。此外，如图6所示，本实用新型所述孔板装置通过设置经结构优化的培养孔单元(2)，其培养类器官细胞球成球时间显著低于商用的U型孔和V型孔板。本实施例进一步说明本实用新型所述孔板装置可以对类器官细胞球进行高效培养并极大减少研究人员的时间成本。

实施例2

类器官细胞球换液实验：取不超10代的HepG2细胞消化并重悬在细胞培养基中，以1000个/孔的密度分别接种到商用的类器官球体培养孔板(即，U型孔和V型孔板)和本实用新型所述孔板装置中进行5天的连续培养，每24小时用移液枪按常规操作对3种孔板中的培养液进行换液操作；其中，在对本实用新型所述孔板装置进行换液操作时，移液枪头的尖端需抵靠在所述培养孔单元(2)中的定位缓冲环(2-1)部位；经过5次连续换液后，如图7所示，商用的U型和V型类器官球体培养孔板中的细胞球平均丢失率高于30％，这对后续的实验结果分析造成严重影响，尤其对于来源不易且珍贵的原代细胞或干细胞造成的损失是非常严重的，这极大地限制了类器官细胞球在临床上的大规模应用，并对类器官细胞球的培养人员的实验操作提出极高要求。而本实用新型所述孔板装置中细胞球平均丢失近乎为0(即达到无丢失)，通过经结构优化的培养孔单元(2)并在其中设置定位缓冲环(2-1)成功解决了商用类器官球体培养孔板中细胞球丢失严重等问题，利于类器官细胞球在实际应用中的大规模推广。

实施例3

类器官细胞球组织切片实验：取不超10代的HepG2细胞消化并重悬在细胞培养基中，以1000个/孔的密度分别接种到本实用新型所述孔板装置中进行3天的连续培养。随后，在本实用新型所述孔板装置中依次加入试剂进行细胞球原位的脱水、透明、浸蜡、包埋等过程，最后制成石蜡块，并通过带有微型倒刺结构(4-1)的专用取出装置(4)将培养孔单元(2)整体取出，然后快速进行定位切片和常规HE染色，其中培养孔单元的取出方式，如图4所示。最终实验结果，如图8所示，切片细胞球结构呈明显的球状结构，细胞集中且均匀，整体结构完整。本实施例说明实用新型所述孔板装置兼容常规组织制片技术，具有操作简便、无需破坏孔板装置结构且无需特殊的仪器和试剂，非常值得在科研和临床上推广，并在后期通过借助自动机械手有助于实现大规模高通量检测。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本实用新型的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于类器官球体培养的孔板装置，包括孔板盖(1)、多个培养孔单元(2)和孔板底座(3)，其特征在于，所述培养孔单元(2)可拆卸地安装在所述孔板底座(3)中，所述培养孔单元(2)由上到下包括定位缓冲环(2-1)、第一导流腔(2-2)和第二类器官球体培养腔(2-3)。

2.根据权利要求1所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，所述孔板底座(3)上设置有若干孔，所述培养孔单元(2)可拆卸地安装在所述孔板底座(3)的孔中。

3.根据权利要求1所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，所述培养孔单元(2)由高分子有机硅化合物或水凝胶材料制成。

4.根据权利要求1所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，所述定位缓冲环(2-1)的宽度(W)为0.2-1mm。

5.根据权利要求1所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，所述第一导流腔(2-2)为倒圆锥形，其中心截面处的夹角(θ)为60-150°。

6.根据权利要求1所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，所述第二类器官球体培养腔(2-3)为倒圆锥形，其中心截面处的夹角(α)为30-120°。

7.根据权利要求6所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，所述第二类器官球体培养腔(2-3)的倒圆锥形的底部为半球形，其半径(R)为0.2-1.5mm。

8.根据权利要求1所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，所述第二类器官球体培养腔(2-3)的底部与所述培养孔单元(2)下表面之间的距离(H)为0.1-1mm。

9.根据权利要求1所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，所述第一导流腔(2-2)的下部开口与所述第二类器官球体培养腔(2-3)的上部开口相匹配，以形成一体的异形倒圆锥结构。

10.根据权利要求2所述的用于类器官球体培养的孔板装置，其特征在于，当所述培养孔单元(2)安装在所述孔板底座(3)的孔中时，所述培养孔单元(2)与所述孔板底座(3)的孔相接触的底部接触面(3-1)和外底面(3-2)为光滑、透明平面。

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