CN114349736A

CN114349736A - 一种化合物及其应用

Info

Publication number: CN114349736A
Application number: CN202111192495.9A
Authority: CN
Inventors: 唐本忠; 郑正; 何威; 郭子健
Original assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Current assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了如下式(1)的化合物以及包括其的双聚集诱导发光的荧光发光剂***：

本发明还公开了本发明的化合物用于对微生物进行染色，以及本发明的双聚集诱导发光的荧光发光剂***用于监测微生物的代谢状态和微生物的生物膜的形态和代谢状态。

Description

一种化合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种化合物，该化合物在对微生物进行染色中的应用，对微生物进行染色的方法，包括该化合物的双聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***，以及利用双聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***监测微生物的代谢状态、定量监测微生物的活性、监测微生物的生物膜的形态和代谢状态的方法。

背景技术

微生物是地球上最古老，最丰富的种群。自从40亿年前出现在这个世界上以来，它们在各个方面都在统治着这个星球。它们的总量估计有一万亿种，其中一些已被人类驯化并用于我们的日常生活中。然而，其中的病原微生物一直威胁着我们人类的生命。人类的发展似乎是一部与微生物作斗争的历史。由于普遍存在的微生物太小而无法观察到的事实，到目前为止，仅发现和了解了1400种病原体。当流行病发生时，这种困境给社会带来恐惧、恐慌和巨大的负担。例如，黑死病是人类历史上最致命的流行病之一，在欧亚大陆和北非造成了0.75～2亿人死亡。直到1894年，罪魁祸首致病菌鼠疫耶尔森氏菌才被发现，严峻的形势得到了很好的控制。因此，开发检测、鉴别和定量测定微生物非常重要。另外，微生物通常形成生物膜以在各种环境中生存并适应。在微生物世界中，聚集的样式较为普遍但也较为复杂，并且缺乏足够的了解。迄今为止，对生物膜形成的原位可视化是迫切的需求。

在临床和研究中，通常用于微生物检测的方法有几种，例如革兰氏染色法、平板计数法、最小抑制浓度(MIC)测试和电子显微镜(SEM和TEM)。革兰氏染色法是区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的最广泛使用的方法，但是它需要复杂的程序，其中包括洗涤和对比染色的步骤，并且它只能将细菌粗略地分为两大类，而不管活/死状态。平板计数法通过将稀释的细菌悬浮液散布在适当的琼脂上，而被开发出来定量活细菌，但是需要24小时以上的较长培养时间，而且只能在合适的培养基琼脂上准确培养一小部分微生物。MIC是表征药物和生物材料的抗微生物能力的最常用方法。然而，MIC结果是基于肉眼的浊度读出的，这不够灵敏并且在实践中可能产生***误差。SEM和TEM的应用使研究人员能够观察到更详细的微生物结构，但是这些技术需要复杂的样品制备。需要进一步指出的是，这四种方法都不属于原位表征技术，很难满足对动态微生物的实时监测。因此，需要进一步推进技术创新，实现微生物原位可视化。

荧光技术具有许多优势，例如高灵敏度、纳米级分辨率和原位/现场可视化特性。因此，荧光探针可以很好地满足生物和医学领域微生物研究的所有这些要求。但是，传统的荧光探针在生物***中的完美使用受到聚集引起的猝灭(ACQ)的固有缺陷的限制。大多数疏水性ACQ发光体可以在水中形成聚集体，强烈的pi-pi相互作用可能导致部分或全部荧光猝灭。另外，该缺陷在复杂的生物***中将加剧，并阻止这些传统的荧光探针被纳入生物膜监测中。由于生物膜中含有大量的细菌，因此需要足够的荧光分子来匹配细菌的数量，而ACQ发光体无法在如此高的浓度下有效地工作。为了避免ACQ效应，较少和微弱的荧光探针是唯一的选择，即使它们只能应用所测生物膜的不完整信息。此外，传统的荧光探针总是受到其毒性的困扰，例如PI和SYTO9(常用于商业细菌成像试剂盒)。为了减少高毒性的干扰，必须在成像前将这些探针从样品上冲洗掉。辅助冲洗程序似乎完全不能进行生物膜观察。除了相当大的光谱重叠外，配对的SYTO9和PI还将不可避免的***误差引入到结果中。因此，迫切需要一种具有免洗和最小光谱重叠特性的用于荧光微生物成像的生物相容性***。

众所周知，聚集诱导发光的荧光发光剂(aggregation-induced emissionluminogens，AIEgen)作为一种新型的荧光材料，可以完全弥补上述所有缺陷。

AIEgen的工作机制是基于分子内运动的限制(RIM)，其包括分子内旋转的限制(RIR)和分子内振动的限制(RIV)。AIEgen具有许多优势，例如可调的化学结构和生物相容性，开启特性和可调的发射光谱。对于第一种组分，近红外AIEgen探针可以容易地设计为具有广谱靶向能力，从而赋予该组分高效染色所有微生物的能力。然后，通过调节供体-pi-受体结构，可以获得红色发射的AIEgen。红色发射在生物应用中非常重要，因为它具有较少的自发荧光和较高的分辨率。此外，使用红色发射的AIE探针可以实现更深的穿透深度。接下来，将两个正电荷引入到具有短碳链的结构中，以同时实现普遍的靶向能力和良好的生物相容性。对于传统的荧光探针开发，由于其复杂的化学结构，繁琐的合成路线和复杂的纯化程序，设计近红外探针很麻烦。为了实现最小的光谱重叠，第二个组分应该足够蓝。然而，紫外线对生物样品有害，因此选择了蓝色的AIEgen。含硼酸结构的四苯乙烯衍生物(TPE-2BA)是被广泛报道的AIEgen，它具有广谱靶向能力，可以选择性地对死微生物进行成像。

因此，本领域亟需一种能够对微生物进行染色，实现微生物的原位可视化，并且能够对生物膜进行可视化的生物相容性***。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对微生物具有光谱的染色能力的化合物，并将其应用于微生物的染色中，以及提供一种能够对生物膜进行可视化的生物相容性***，并将其应用于生物膜的动态监测中。

本发明成功设计并合成了式(1)所示的化合物，并使该化合物具有特定的AIE特性和良好的生物相容性。该化合物的广谱染色能力有助于在活和死状态下对微生物进行原位和实时成像。通过引用仅适用于死微生物染色的TPE-2BA，本发明进一步提供了具有最小光谱重叠的用于微生物活性检测的双组分AIEgen***。此外，还将该***成功地应用于监测微生物的代谢状态、定量检测微生物的活性，监测微生物的生物膜的形态和代谢状态。大量的实验已经证明，这种双组分AIEgen***在微生物的检测、可视化和定量分析方面具有巨大的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。

图1示出水溶性NIR AIEgen DCQA的设计原理及合成路线(A)；DCQA在不同甲苯含量(体积分数％)的DMSO/甲苯混合溶剂中的荧光光谱(B)；PL的最大强度和相对强度(α_AIE＝I/I₀)与DCQA的DMSO/甲苯混合溶剂的图(C)，其中I₀是f_t＝0％时的PL强度；浓度＝10×10^- ⁶M，λ_ex＝519nm，(插图:DCQA粉末的荧光显微镜图像，λ_ex＝510-550nm，λ_em＝590-800nm)。

图2示出DCQA的细菌染色特性。(A-C)示出用DCQA染色的活微生物(上图)和死微生物(下图)的CLSM图像，激发波长:561nm，发射范围:590-759nm。(A)：S.aureus.，比例尺为5μm。(B)：E.coli.，比例尺为5μm；(C)：C.albicans.，比例尺为10μm。(D-F)示出CLSM生成的DCQA的原位发射光谱。(D)：S.aureus.；(E)：E.coli.；(F)：C.albicans.，激发波长:561nm，发射范围:530–780nm，DCQA的浓度是10μM。

图3示出被DCQA和TPE-2BA共染色的死/活微生物细胞的混合物的CLSM图像。(A)：***，左:S.aureus.，右:B.sublitis.，比例尺为5μm。(B)：革兰氏阴性细菌，左:E.coli.，右:S.marcescens.，比例尺为5μm。(C)：真菌，左:C.albicans.，右:S.cerevisiae.，比例尺为10μm。激发波长:561nm(DCQA)和405nm(TPE-2BA)。发射范围:590-759nm(DCQA)和410-580nm(TPE-2BA)。DCQA和TPE-2BA的浓度分别是10μM和50μM。

图4示出DCQA和TPE-2BA混合物的定量研究结果。(A)在荧光酶标仪中分析E.coli悬浮液的相对活性。获得在310±10nm和519±10nm激发的悬浮液的蓝色(460±5nm)和红色(730±5nm)发射的积分强度，并且对于每个活/死E.coli的比率，计算红色/蓝色荧光比(比率R/B)。每个点代表四个测量值的平均值。该线是活细菌百分比(x)与比率R/B(y)之间关系的最小二乘拟合。(B)激光共聚焦显微镜分析E.coli悬浮液的相对活性。用DCQA和TPE-2BA对不同的给定百分比的活E.coli进行染色。通过每个给定百分比的活E.coli的CLSM图像计算E.coli悬浮液的活性。(C)通过流式细胞术对不同活/死比率下的被TPE-2BA和DCQA混合物染色的E.coli进行统计分析。对于TPE-2BA通道:λ_ex＝405nm,λ_em＝450±40nm。对于DCQA通道:λ_ex＝561nm,λ_em＝780±60nm。(D)通过流式细胞仪获得的平均强度分析E.coli悬浮液的相对活性。获得在405nm和561nm激发的悬浮液的蓝色(450±40nm)和红色(780±60nm)发射的积分强度，并对于每个活/死E.coli的比率，计算红色/蓝色荧光比(比率R/B)。每个点代表5000个计数的平均值。该线是活细菌百分比(x)与比率R/B(y)之间关系的最小二乘拟合。

图5示出通过DCQA和TPE-2BA的结合实现生物膜形态和代谢状态监测。DCQA和TPE-2BA染色的微生物生物膜(三天大)的CLSM图像。(A)S.aureus.(B)E.coli.(C)C.albicans.比例尺:20μm。

图6示出DCQA的HOMO和LUMO能级的分子轨道振幅图。

图7示出(A)DMSO中DCQA的消光光谱。(B)固态DCQA的荧光衰减曲线。

图8示出DCQA染色的微生物在不同时间点的FL发射光谱。(A)S.aureus.(B)E.coli.(C)C.albicans.。激发波长:519nm，发射范围:540–840nm。DCQA的浓度是10μM。(D-E)在不同时间处的FL强度。波长峰值＝720nm。

图9示出不同细菌组分与DCQA相互作用的PL强度。激发波长:519nm.。发射范围:530–900nm。DCQA的浓度是10μM。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。

定义和一般术语

现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

除非另外说明，应当应用本文所使用的下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和“March'sAdvanced Organic Chemistry”by Michael B.Smith and Jerry March,JohnWiley&Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。

除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。

术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。然而，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，实施方案可以替代地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”进行描述。

另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本发明中所采用的描述方式“各…独立地为”与“…各自独立地为”和“…独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。

如本文所用，术语“λ_ex”是指激发波长。

如本文所用，术语“λ_em”是指发射波长。

如本文所用，短语“聚集引起的猝灭”或“ACQ”是指其中π-共轭荧光团的聚集显著降低了荧光团的荧光强度的现象。据说聚集体的形成“抑制”了荧光团的发光。

如本文所用，短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指化合物以无定形或结晶(固态)状态聚集时表现出显著增强的光发射，而在稀溶液中表现出微弱的光发射或几乎没有发射的现象。

如本文所用，术语“发射强度”是指通常从荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光强度；

如本文所用，术语“荧光团”或“氟原子”是指表现出荧光的分子。

如本文所用，术语“发光剂”或“发光体”是指表现出发光的分子。

如本文所用，术语“AIEgen”是指表现出AIE特性的分子。

如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘，“卤代”是指被“卤素”所取代。

如本文所用，术语“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和z'-丙基)、丁基(例如，正丁基、z'-丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，正戊基、z'-戊基、-戊基)，己基等。在各个实施方案中，烷基可具有1至40个碳原子(即，C 1-40烷基)，例如1-30个碳原子(即，C 1-30烷基)。在一些实施方案中，烷基可以具有1至6个碳原子，并且可以被称为“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和z'-丙基)和丁基(例如，正丁基、z'-丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可以如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷基、烯基或炔基取代。

如本文所用，“不饱和烷烃基”是指含有双键、三键或π键的烃基，其中，含有双键的烃基为“烯基”，含有三键的为“炔基”，含有π键的烃基可以形成苯环。

如本领域技术人员所理解的，术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。在各个实施方案中，烯基可具有2至40个碳原子(即，C 2-40烯基)，例如2至20个碳原子(即，C 2-20烯基)。在一些实施方案中，烯基可如本文所述被取代。烯基通常不被另一个烯基、烷基或炔基取代。

如本领域技术人员所理解的，术语“炔基”表示指具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烷基。在一实施方案中，炔基基团包含2-8个碳原子；在另一实施方案中，炔基基团包含2-6个碳原子；在又一实施方案中，炔基基团包含2-4个碳原子。炔基基团的实例包括，但并不限于，乙炔基、炔丙基、1-丙炔基等等。在一些实施方案中，炔基可如本文所述被取代。炔基通常不被另一个烯基、烷基或炔基取代。

如本领域技术人员所理解的，“苯环”是是苯分子的结构，苯的分子式为C₆H₆，其为平面正六边形，每个顶点是一个碳原子，每一个碳原子和一个氢原子结合，苯环中的碳碳键是介于单键和双键之间的独特的键。在一些实施方案中，苯环可如本文所述被取代。

如本文所用，术语“杂烷基”是指包含杂原子的烷基。

如本领域技术人员所理解的，术语“杂原子”是指除碳或氢以外的任何元素的原子，包括但不限于氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)、硒(Se)和磷(P)。

如本文所用，术语“环烷基”是指含有脂环结构的饱和烃基，其中脂环结构有单环脂环和稠环脂环。含有1个脂环且环上无取代烷基的环烷基的分子通式为-C_nH_2n(n≥3)。环烷基的实例包括环丙烷、环丁烷、环己烷等。

如本文所用，术语“杂环烷基”是指包含杂原子的环烷基，其中“杂原子”如上所定义。

如本文所用，术语“芳基”是指芳族单环烃环体系或多环体系，其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共同的键)在一起，或至少一个芳族单环烃环为芳族单环烃环体系或多环体系。与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的基团。芳基在其环系中可以具有6至24个碳原子(例如，C 6-24芳基)，其可以包括多个稠合环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8至24个碳原子。芳基的任何合适的环位置可以共价连接至限定的化学结构。仅具有芳族碳环的芳基的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、戊烯基(五环)等基团。其中至少一个芳族碳环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的多环体系的实例包括环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-双环环烷基/芳环***)、环己烷(即四氢萘基，为6,6-双环烷基/芳环***)、咪唑啉(即苯并咪唑啉基，为5,6-双环杂环烷基/芳环***)和吡喃(即，色烯基，其为6,6-双环杂环烷基/芳族环***)。芳基的其他实例包括苯并二恶烷基、苯并二恶唑基、苯并二氢吡喃基、吲哚基等。在一些实施方案中，芳基可如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基可以具有一个或多个卤素取代基，并且可以被称为“卤代芳基”基团。全卤代芳基，即其中所有氢原子均被卤素原子取代的芳基(例如-C₆F₅)，其包括在“卤代芳基”的定义内。在某些实施方案中，芳基被另一个芳基取代并且可以被称为联芳基。联芳基中的每个芳基可以如本文公开的那样被取代。

如本文所用，术语“杂芳基”是指包含选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)或多环中的至少一个环杂原子的芳族单环***。环***，其中存在于该环***中的至少一个环是芳族的并且包含至少一个环杂原子。多环杂芳基包括具有两个或多个稠合在一起的杂芳基的那些，以及具有与一个或多个芳族碳环，非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的至少一个单环杂芳基的那些。整体上，杂芳基可具有例如5至24个环原子并且含有1-5个环杂原子(即5-20元杂芳基)。杂芳基可在导致稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接至定义的化学结构。通常，杂芳基环不包含O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可以被氧化(例如，吡啶N-氧化物噻吩S-氧化物、噻吩S，S-二氧化物)。杂芳基的实例包括，例如，5或6元单环和5-6双环***：其中可以包含O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH₂、SiH(烷基)、Si(烷基)₂、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)₂或Si(烷基)(芳基烷基)。此类杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、***基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异恶唑基、恶唑基、氧杂二唑基、恶二唑基、氧杂二唑基、氧二唑基2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、苯并***基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑、苯并异恶唑基、苯并恶二唑、苯并恶唑基、噌啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、中氮茚基、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、唑并、噻唑并、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并吡嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基的其他实例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃基吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可如本文所述被取代。

如本文所用，术语“供体”材料是指具有空穴作为主要电流或电荷载流子的有机材料，例如有机纳米颗粒材料。

如本文所用，术语“受体”材料是指具有电子作为主要电流或电荷载流子的有机材料，例如有机纳米颗粒材料。

在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。

为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。

应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。

在本发明中，发明人设计出了一种新型的近红外AIEgen，该化合物的结构如下式(1)所示：

其中，两个R₁独立地选自H、烷基、不饱和烷烃基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基-NCS、烷基-N₃和烷基-NH₂，其中，两个R₁可以相同或不同；

D为

其中，R₂为具有季铵端基的烷基链；

X^-是抗衡离子，优选地，X独立地选自F、Cl、Br、I和PF₆。

如本领域技术人员所理解的，“抗衡离子”是指双电层中电荷符号与胶体颗粒表面电荷符号相反的离子。抗衡离子主要起平衡胶体颗粒表面电荷的作用，使胶体表面双电层体系呈电中性状态。在本发明中，除了上述例举的抗衡离子外还可以使用本领域技术人员已知的其他具有相同作用的离子，本发明对此不作进一步的限制。

在一些实施方案中，所述化合物为所述化合物的结构如式(2)、(3)所示：

在一些实施方案中，所述化合物为所述化合物的结构如式(4)、(5)所示：

在一个具体的实施方案中，所述化合物为(E)-4-(2-(7-(二苯基氨基)-9-乙基-9H-咔唑-2-基)乙烯基)-1-(3-(三甲基氨)丙基)喹啉-1-溴化铵(DCQA)，其结构如式(6)所示：

式(1)所示的上述化合物具有强大的D-A强度，其可以促进分子内电荷转移(ICT)，从而导致较小的电子带隙和较长的吸收/发射波长。除了吸电子能力外，带正电荷的电子受体的引入还可以使荧光团具有独特的生物学功能，具有通用的微生物靶向性和成像能力。经研究发现，上述化合物表现出大的斯托克斯位移、近红外发射以及带有短碳链的两个正电荷的AIE特性的集成使式(1)所示的上述化合物成为生物应用的有前景的候选者。

因此，本发明提供了式(1)所示的上述化合物在对微生物进行染色中的应用。

式(1)所示的上述化合物由于通用的微生物靶向性和成像能力而可以在短时间内与各种微生物相互作用，并且对所有微生物都具有广谱的染色能力。此外，实验结果还表明其在活和死两种状态下均显示出良好的染色能力，并且对于成像和高通量分析均具有合适的染色窗口，因此，其可以作用一种通用的检测探针，从而用于各种微生物。

此外，本发明还提供了一种对微生物进行染色的方法，所述方法包括使用式(1)所示的上述化合物对微生物进行染色。

式(1)所示的上述化合物具有的上述特性可以使得使用式(1)所示的上述化合物对微生物进行染色的方法具有较高的染色效率，快速的反应性能和较短的相互作用时间等优势。

微生物的代谢状态与其功能、生物膜形成能力、毒力因子分泌、耐药性产生等特征密切相关。随着环境的变化，微生物的代谢状态也会发生变化。特别是对于机会性病原体，其代谢水平的变化可能会导致对我们有害的情况。微生物的活性是微生物代谢的关键因素。据报道，当面对特定抗生素时，部分细菌会牺牲自己，通过分散其耐药基因，向其他细菌发出危险警告。其余的微生物物种将接受耐药基因并直接获得对特定抗生素的耐药性。因此，监测微生物的代谢状态具有非常重要的意义，在这项工作中，微生物的活性的因素被选为标准。

如上所述，式(1)所示的上述化合物作为一种新型的荧光探针，对所有微生物都具有广谱的染色能力。此外，本领域技术人员已知，TPE-2BA可用于监测浮游微生物及其生物膜的代谢状态，是一种专门用于死微生物成像的蓝色荧光探针，因此，可以选择经过验证的死微生物AIEgen探针TPE-2BA作为式(1)所示的上述化合物的协同代谢传感器，从而用于监测微生物的代谢状态。此外，TPE-2BA的发射峰在450nm左右，可以实现与式(1)所示的上述化合物的最小光谱重叠，这使其成为微生物活性监测和形态追踪的完美组合。

因此，本发明还提供了双组分聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***，所述***包括：式(1)所示的上述化合物和TPE-2BA。

如上所述，本发明提供的双组分聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***可以用于监测微生物的代谢状态。因此，本发明还提供了一种监测微生物的代谢状态的方法，所述方法包括：使用上述双聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***来监测所述微生物的代谢状态。

具体地，双组分聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***中的式(1)所示的上述化合物响应整个微生物细胞成像，可以用于检测总微生物的准确数量，而TPE-2BA响应微生物的活性，因此，微生物的活性可以通过精确确定死微生物细胞和总微生物细胞的数量来准确计算。

本领域技术人员已知，在开发抗生素和抗微生物材料的过程中，需要表征和量化这些材料的杀灭效率。因此，本发明还将本发明提供的双组分聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***应用于微生物的活性的定量检测中，并由此提供了一种定量检测微生物的活性的方法，所述方法包括：使用如上所述的双聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***来定量检测所述微生物的活性。

本发明主要通过酶标仪(plate reader)、荧光显微镜/激光共聚焦显微镜、流式细胞术这三种方法来测试双组分AIEgen***的定量能力。

对于酶标仪方法，将活的和死的细菌以不同的比例混合，以产生给定百分比的活细菌。然后将混合物用DCQA和TPE-2BA染色。最后，使用酶标仪测量不同激发波长下的峰强度。由于红色/蓝色荧光比与给定百分比的活菌混合物具有良好的线性相关性，因此双组分AIEgen***能够通过使用酶标仪有效且可靠地表征微生物的活性。

对于荧光显微镜/激光共聚焦显微镜方法，由于式(1)所示的上述化合物和TPE-2BA之间具有最小的光谱重叠，因此可以大大减少串扰，并且***误差降至最小。样品制备过程与酶标仪方法相同。染色后，通过激光共聚焦显微镜对不同活菌百分比的混合物进行成像，通过式(1)所示的上述化合物的通道(N_总数)可以获得细菌细胞总数，而使用TPE-2BA通道(N_死)可以计算出死细胞的数量，然后通过可以通过方程式1计算出计数的活细菌的百分比(L％)：

方程式1:

对于流式细胞术，应用于测试双组分AIEgen***的染色能力，通过读取标记样品的荧光信号，可以分析不同活细菌百分比的混合物，从而可以容易地区分微生物的活性。

微生物生物膜是自然界中微生物最常见的生命形式，可以在生物膜状态下实现对环境的快速适应、耐药性的产生以及与其他微生物的合作。根据IUPAC，生物膜是微生物的聚集体，在生物膜中细胞经常嵌入相互粘附和/或粘附于表面的细胞外聚合物(EPS)的自生基质中。因此，由于生物膜由许多物质组成，其结构复杂，并使得对其结构和相对功能的研究变得极为困难。因此，迫切需要一种可以对生物膜的结构和功能进行可视化的方法。

如上所述，双组分AIEgen***对于浮游微生物成像和活性识别非常有效，由于该***的AIE特性，该***在生物膜中应该能很好地工作。

因此，本发明将如上所述的双组分AIEgen***应用于微生物的生物膜的形态和代谢状态的监测中，并由此提出了一种监测微生物的生物膜的形态和代谢状态的方法，所述方法包括：使用上述双聚集诱导发光的荧光发光剂(AIEgen)***来对所述生物膜的形态和代谢状态进行可视化，从而监测微生物的生物膜的形态和代谢状态。

在上述双组分AIEgen***中，发红色光的式(1)所示的上述化合物基于其广泛的染色性能和低毒性负责监测形态，两个正电荷通过静电相互作用有效而牢固地赋予式(1)所示的上述化合物对负电荷微生物的普遍的染色能力。此外，本领域技术人员已知，当生物膜达到成熟阶段时，核心区域趋向于缺氧且营养较少，因此内部有更多的死细胞，因此，发蓝色光的AIEgen TPE-2BA负责对死微生物进行染色。在这种情况下，将DCQA和TPE-2BA的图像合并，这样同时观察生物膜的形态和活性更为直接。因此，以总生物膜形态为背景，可以更清楚地表现出死细胞的分布，从而将生物膜的形态和活性可视化。

综上，本发明成功设计了一个新型的近红外AIEgen，(E)-4-(2-(7-(二苯基氨基)-9-乙基-9H-咔唑-2-基)乙烯基)-1-(3-(三甲基氨)丙基)喹啉-1-溴化铵(DCQA)。DCQA对所有微生物都具有广谱的染色能力，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性细菌和真菌。TPE-2BA是专门用于死微生物成像的蓝色荧光探针，浮游微生物及其生物膜的代谢状态通过引入TPE-2BA可以成功地监测。因此，设计并制造了具有最小光谱重叠的双组分AIEgen***，用于微生物活性的定量和生物膜形成的监测。另外，已经通过三种不同的最常用的技术(即激光共聚焦显微镜成像、酶标仪和流式细胞术)研究了这种双组分AIEgen***的定量能力。最后，这种双组分AIEgen***成功地对三种微生物生物膜进行了成像。

实施例

在本文中，如无特殊说明，所采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。

1.实验部分

1.1仪器与材料

所有的化学药品和试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。

¹H和¹³C NMR光谱在Bruker ARX 400NMR光谱仪上测量，使用CDCl₃和DMSO-d₆作为溶剂，并选择四甲基硅烷(TMS；δ＝0ppm)作为内部参考。高分辨率质谱(HR-MS)是在以MALDI-TOF模式操作的Finnigan MAT TSQ 7000质谱仪***上获得的。吸收光谱在Milton RoySpectronic 3000Array分光光度计上测量。稳态光致发光(PL)光谱是在Perkin-Elmer分光荧光计LS 55上测量的。绝对荧光量子产率通过校准积分球(Labsphere)测量。激光共聚焦扫描显微镜图像是在Zeiss激光扫描共聚焦显微镜(LSM 710)上收集的，并使用ZEN 2009软件(Carl Zeiss)进行分析。

作为原样使用的3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)购自Sigma-Aldrich。对于细菌培养，从索拉比奥国际贸易有限公司购买了胰蛋白酶大豆肉汤培养基(TSB)、Luria-Bertani肉汤培养基(LB)、酵母抽提物-蛋白D-葡萄糖(YPD)、MuellerHinton肉汤培养基(MH)和酪蛋白水解物，并均在收货后直接使用。葡萄糖是从Sigma-Aldrich购买的。结晶紫购自索拉比奥国际贸易有限公司。对于细胞培养，从Invitrogen购买了Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)，胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素溶液。

1.2菌株信息

金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 6538)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis，ATCC6633)，藤黄微球菌(M.luteus，ATCC 9341)，大肠杆菌(E.coli，8099)，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae，ATCC 700603)，粘质沙雷菌(S.marcescens，CMCC 41002)，白念珠菌(C.albicans，ATCC 10231)，酵母(S.cerevisiae，ATCC 9763)。

1.3实验方法

1.3.1细菌培养和染色

将固体培养基上的单个细菌菌落转移到5mL液体培养基中，并在37℃下生长10h。通过测量600nm(OD600)的光密度来确定细菌的浓度，然后将10⁹CFU的细菌转移到1.5mL微量离心管中。通过在11700g下离心3分钟收获细菌。除去上清液后，用200μL 75％酒精杀死细菌(死细菌)，或用等量的PBS处理细菌(活菌)，然后用PBS洗涤。然后，将1mL染料溶液在盐水中的适当浓度加入到微量离心管中。涡旋分散后，将细菌在30℃的振荡培养箱中培养一段设计的时间。

1.3.2真菌培养和染色

将固体培养基上的单个细菌菌落转移到5mL液体培养基中，并在25℃下生长10h。通过测量600nm(OD600)的光密度来确定细菌的浓度，然后将10⁹CFU的细菌转移到1.5mL微量离心管中。通过在11700g下离心3分钟收获细菌。除去上清液后，用200μL 75％酒精杀死细菌(死细菌)，或用等量的PBS处理细菌(活菌)，然后用PBS洗涤。然后，将1mL在盐水中适当浓度的染料溶液加入到微量离心管中。涡旋分散后，将细菌在25℃的振荡培养箱中按照设计的时间培养。

1.3.3生物膜培养和染色

将过夜的微生物培养物在OD600为0.5的条件下继代培养至相关培养基中(S.aureus:补充了葡萄糖的TSB。E.coli:补充了酪蛋白水解物的LB.C.albicans:YPD肉汤培养基).然后，将2mL细菌/真菌悬浮液加入到共聚焦培养皿中。将培养皿在37℃下静态培养。72小时后，除去培养基，并用无菌PBS洗涤板。然后，将1mL探针添加到培养皿中，按照设计的时间培养。

1.3.4用酶标仪定量分析不同活力的大肠杆菌

将固体培养基上的单个大肠杆菌菌落转移到5mL液体培养基中，并在37℃下生长10h。达到对数相后，将500μL培养悬浮液转移至1.5mL微量离心管中。将细菌在11700g下离心3分钟。除去上清液后，用1.5mL 75％酒精(死细菌)杀死细菌，或用等量的PBS处理(活细菌)。然后将活细菌和死细菌以不同的比率(L/D比率)混合，也就是，0，10％，30％，50％，70％，90％和100％。接下来，将细菌在11700g下离心3分钟。然后，将200μL染料在适当的浓度的缓冲液(pH＝10)中溶解的溶液添加到微量离心管中。涡旋分散后，将100μL悬浮液转移到96孔板中，并在37℃下按照设计的时间孵育。最后，使用黑色96孔板(ThermoScientific，不透光，平底，非无菌)，通过酶标仪(Varioskan LUX多模式酶标仪)记录荧光峰。获得在310±10nm和519±10nm激发的悬浮液的蓝色(460±5nm)和红色(730±5nm)发射的积分强度，并计算每个活/死比例的大肠杆菌的红色/蓝色荧光比(Ratio R/B)。每个点代表四个测量值的平均值。

1.3.5通过流式细胞术定量分析具有不同活力的细菌/真菌。

将固体培养基上的单个大肠杆菌菌落转移到5mL液体培养基中，并在37℃下生长10h。达到对数期后，将500μL细菌悬浮液转移至1.5mL微量离心管中。在11700g下将细菌/真菌离心3分钟。除去上清液后，用1.5mL 75％酒精(死细菌)杀死细菌，或用等量的PBS处理(活细菌)。然后将活细菌/真菌和死细菌/真菌以不同的比率(L/D比率)混合，也就是，0、10％、30％、50％、70％、90％和100％。接下来，在11700g下将细菌/真菌离心3分钟。然后，将2mL在适当的浓度的缓冲液中溶解的染料溶液(pH＝10)添加到微量离心管中。涡旋分散后，将悬浮液在37℃下按照设计的时间孵育。最后，通过流式细胞术(BD FACS Ariac III)测量细菌。获得在405nm和561nm激发的悬浮液的蓝色(450±40nm)和红色(780±60nm)发射的积分强度，并计算每个活/死比例的大肠杆菌的红色/蓝色荧光比(Ratio R/B)。每个点代表5000个计数的平均值。

1.3.6激光扫描共聚焦显微镜定量分析不同活力的细菌/真菌

将固体培养基上的单个大肠杆菌菌落转移到5mL液体培养基中，并在37℃下生长10h。达到对数期后，将500μL细菌转移到1.5mL微量离心管中。使用离心机将细菌在11700g下离心3分钟。除去上清液后，用1.5mL 75％酒精(死细菌)杀死细菌，或用等量的PBS处理(活细菌)。然后将活细菌和死细菌以不同的比率(L/D比率)混合，也就是，0，10％，30％，50％，70％，90％和100％。接下来，将细菌在11700g下离心3分钟。然后，将100μL染料在适当的浓度的缓冲液(pH＝10)中溶解的溶液添加到微量离心管中。涡旋分散后，将悬浮液在37℃下孵育设计的时间。最后，用Zeiss LSM 800共聚焦激光扫描显微镜获得了共聚焦荧光图像。用DCQA和TPE-2BA对不同的给定百分比的活大肠杆菌进行染色。通过每个给定百分比的活大肠杆菌的CLSM图像计算大肠杆菌悬浮液的活性。

1.3.7最小抑菌浓度(MIC)测试的实验程序

在Mueller-Hinton肉汤中培养了S.aureus、E.coli或者C.albicans的单个菌落。达到对数期后，将1×10⁶mL^-1的细胞进行MIC测试。将DCQA和TPE-2BA通过无菌MH肉汤梯度稀释。稀释探针后，将等于稀释探针体积的标准接种物添加到每个稀释容器中，使微生物浓度达到约5×10⁵细胞·mL^-1。将96孔板在37℃的培养箱中孵育24小时。孵育后，观察一系列稀释容器的微生物生长情况，通常以浊度表示。稀释系列中未显示的最后一个试管记录为探针的MIC值。

实施例1：DCQA的合成

DCQA的设计原理和合成路线如图1所示。具体地，将7-(二苯基氨基)-9-乙基-9H-咔唑-2-甲醛(0.50g，1.28mmol)和1-(3-三甲基氨丙基)-4-甲基喹啉二溴化物(0.52g，1.28mmol)溶于无水乙醇(15mL)。加入2滴哌啶，将溶液在氮气下回流过夜。冷却至室温后，通过减压蒸发除去溶剂。残余物通过中性氧化铝柱色谱法纯化，用二氯甲烷/甲醇混合物溶剂洗脱，得到DCQA，为深棕色结晶固体。(0.62g,产率:62％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ9.45(d,J＝6.5Hz,1H),9.17(d,J＝8.7Hz,1H),8.64-8.59(m,2H),8.51-8.41(m,2H),8.30-8.26(m,2H),8.17(d,J＝8.1Hz,1H),8.11-8.06(m,2H),7.82(d,J＝8.3Hz,1H),7.33-7.29(m,4H),7.18(s,1H),7.08-7.03(m,6H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),5.03(t,J＝7.3Hz,2H),4.41-4.35(m,2H),3.60-3.56(m,2H),3.08(s,9H),2.45-2.41(m,2H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,ppm):δ153.27,147.46,147.32,146.70,145.13,141.80,140.12,137.80,135.16,132.09,129.36,128.96,126.48,124.61,123.64,122.84,121.89,120.97,120.00,118.13,117.56,116.65,115.76,109.12,103.98,61.93,53.02,52.34,36.86,23.09,13.56。

荧光团中强大的D-A强度可以促进分子内电荷转移(ICT)，从而导致较小的电子带隙和较长的吸收/发射波长。除了吸电子能力外，带正电荷的电子受体的引入还可以使荧光团具有独特的生物学功能，具有通用的微生物靶向性和成像能力。为了验证这些假设，DCQA包含作为受体的喹啉鎓盐、作为供体的咔唑片段和π桥，如图1A所示。DCQA是通过典型的Knoevenagel缩合反应以高收率合成的，并且进行了充分表征(图1A)。在进行光学研究之前，进行了该新分子的密度泛函理论(DFT)计算以了解其ICT。正如图6所示，DCQA的HOMO的电子云主要位于咔唑环、二苯氨基和咔唑骨架上。LUMO主要由受体部分的轨道和部分咔唑环贡献。

随后通过紫外可见吸收和光致发光(PL)光谱研究了DCQA的光物理性质。如图7A所示，DCQA在二甲亚砜(DMSO)中在519nm处显示了最大吸收，这归因于从咔唑部分到喹啉鎓盐基团的ICT。

如图1B和1C所示，在不同甲苯含量的DMSO/甲苯混合溶剂中研究了DCQA的AIE特性。该化合物在DMSO中显示出非常微弱的发射，这是由于活跃的分子内运动通过非辐射途径消耗了激发态的能量。在将甲苯逐渐添加到DMSO溶液中之后，分子的荧光变得更强。由于RIM机理，在甲苯含量为99体积％时，DCQA的荧光强度比在纯DMSO溶液中高306倍。这些结果表明DCQA具有AIE活性，并在729nm处发射近红外光。由于AIE特性，DCQA在729nm处显示出明亮的固态荧光，由积分球测定的荧光量子产率为1.2％(图1C)。上述结果还表明，通过调节ICT强度，可以将这些荧光团的发射颜色比较容易地扩展到近红外区域。固态DCQA的时间分辨荧光测量显示寿命为1.484ns(图7B)。此外，该化合物显示出非常大的斯托克斯位移(Δν＝300nm)，这可归因于同一染料分子内电子供体与电子受体之间的激发态分子内电荷转移。由于激发和发射之间的干扰很小，因此较大的斯托克斯位移有利于生物成像。

综上，大的斯托克斯位移、近红外发射以及带有短碳链的两个正电荷的AIE特性的集成使DCQA成为生物应用的有前景的候选者。

实施例2：DCQA在微生物染色中的应用

微生物成像实验最初是通过将DCQA与三种指示类型的菌株一起孵育来进行的，这三种指示类型的菌株分别是S.aureus(代表***)、E.coli(代表革兰氏阴性细菌)、C.albicans(代表真菌)，随后是在560nm处激发的CLSM成像，如图2A-2C所示。由图2A-2C可以看出，三种微生物均被DCQA高效染色。

另外，DCQA在活和死两种状态下均显示出良好的染色能力。孵育时间测试表明，DCQA可以在短时间内与各种微生物相互作用，并且仅在5分钟内即可检测到强信号，如图8所示。之后，荧光信号变化不大，表明DCQA对于成像和高通量分析均具有合适的染色窗口。这证明DCQA可以作为一种通用的检测探针，从而用于各种微生物，具有较高的染色效率，快速的反应性能和较短的相互作用时间。

图2D-E示出了通过激光共聚焦显微镜在不同微生物中获得的DCQA的现场荧光光谱。对于所有的S.aureus、E.coli和C.albicans，在活和死的菌落都检测到了DCQA 从红到近红外的发射。尽管通过共聚焦获得的发射峰发生了蓝移，分别为686、687和690nm，这是由于与PL检测器相比，共聚焦检测器的灵敏度和检测限更低。这表明DCQA对所有微生物都具有通用的染色能力，效率高，并且没有新陈代谢的选择性。

此外，选择带负电荷主导的细菌组分如LPS、DNA和RNA来研究DCQA的结合能力(图9)。结果表明，归因于静电相互作用，DCQA可以与这三个带负电荷的组分相互作用。这与在荧光图像中观察到的现象是一致的，即整个微生物细胞被DCQA照亮。

实施例3：双组分聚集诱导发光的荧光发光剂***在监测微生物的代谢状态中的应用

微生物的代谢状态与其功能、生物膜形成能力、毒力因子分泌、耐药性产生等特征密切相关。随着环境的变化，微生物的代谢状态也会发生变化。特别是对于机会性病原体，其代谢水平的变化可能会导致对我们有害的情况。微生物的活性是微生物代谢的关键因素。据报道，当面对特定抗生素时，部分细菌会牺牲自己，通过分散其耐药基因，向其他细菌发出危险警告。其余的微生物物种将接受耐药基因并直接获得对特定抗生素的耐药性。因此，监测微生物的代谢状态非常重要。在这项工作中，微生物活性的因素被选为标准。为了实现与DCQA的最小光谱重叠，代谢传感器探针应具有合适的发射光谱以匹配DCQA。然而，紫外线或深蓝色的光对生物***有害，因此选择了经过验证的死微生物AIEgen探针TPE-2BA作为协同代谢传感器。TPE-2BA的发射峰在450nm左右，这使其成为微生物活性监测和形态追踪的完美组合。

为了证明由DCQA和TPE-2BA组成的双组分AIEgen***具有高效监测微生物代谢状态的通用能力，将三个指示菌株(S.Aureus、E.Coli、C.albicans)用于共聚焦成像。此外，在这三类中选择了另外三种类型的菌株：B.subtilis，革兰氏阳性，是由内生孢子产生的细菌；S.marcescens，革兰氏阴性，是用于空气过滤和净化***测试的指示菌株。S.cerevisiae，真菌，是我们日常生活中最常见的酵母。

选择了三种微生物，分别是***、革兰氏阴性细菌和真菌。在每个类别中，选择了两个最常研究的类型菌株，其中S.aureus和B.subtilis代表***；E.coli和S.marcescens代表革兰氏阴性细菌。C.albicans和S.cerevisiae代表真菌。

对数生长期的每个微生物被分为两组。一组接受了75％的乙醇处理，可以有效杀死微生物。另一组未接受任何处理。然后将两组以1：1的比例混合以制备样品。用双组分AIEgen***孵育30分钟后，直接获取共聚焦图像。

在图3A中，DCQA通道显示所有***均已被染色并成像。TPE-2BA通道可有效指示死细菌。活细菌和死细菌可以通过合并后的通道很容易地辨别出，红色代表活细菌，蓝色或白色代表死细菌。如图3B和3C所示，对于革兰氏阴性细菌和真菌，通过激光共聚焦显微镜可以得到相同的结果。

这些结果表明，已经成功设计和制造了双组分AIEgen***，并可用于高效检测微生物活性。在该***中，DCQA响应整个微生物细胞成像，以便检测总微生物的准确数量，而TPE-2BA响应微生物的活性。***、革兰氏阴性细菌和真菌的活性可以通过精确确定死微生物细胞和总微生物细胞的数量来准确计算。

通过MIC分析进一步研究了双组分AIEgen***对细菌活性的影响。MIC分析进一步研究了双组分AIEgen***的毒性(表1)。DCQA对三种指示菌株，S.aureus、E.coli和C.albicans的MIC值超过80uM，是其工作浓度的八倍。TPE-2BA对三个指示菌株的MIC值超过400uM，是其工作浓度的八倍。结果表明这两种组分对微生物无毒，并且该双组分AIEgen***适用于微生物形态学和活性检测以及可视化。

表1 DCQA和TPE-2BA对3株指示菌株的MIC结果

实施例4：双聚集诱导发光的荧光发光剂***在定量检测微生物的活性中的应用

除上述定性分析外，我们的双组分AIE***还可以很好地处理更有意义的定量分析。在开发抗生素和抗微生物材料的过程中，需要表征和量化这些材料的杀灭效率。通常使用几种方法来定量检测微生物的活性。最常应用的是酶标仪、荧光显微镜/激光共聚焦显微镜、流式细胞术和SEM，其中，酶标仪是效率最高且易于获得的技术，因为它具有高通量和高度灵敏的特点；荧光显微镜可以提供有关微生物的更多详细信息，例如形态和膜完整性的状态；通过使用荧光探针，可以很容易地估计活菌或死菌的数量，并通过图像进行计数；其余方法不是基于荧光的，因此其灵敏度要低于前者。此外，平板计数只能确定活微生物的数量，而SEM需要固定过程，这限制了它们在微生物活性表征中的应用，因为它们不是现场方法。因此，选用了最常用的三种技术来测试双组分AIEgen***的定量能力。E.coli被选为模型微生物。

酶标仪：首先，由于其高通量和大样品容量特性而采用了酶标仪。将活的和死的E.coli以不同的比例混合，以产生给定百分比的活细菌。然后将混合物用DCQA和TPE-2BA染色30分钟。最后，使用酶标仪测量不同激发波长下的峰强度。

对于DCQA，激发波长为519±10nm，发射峰为730±5nm。对于TPE-2BA，激发波长为310±10nm，发射峰为460±5nm。在图4A中可观察到，红色/蓝色荧光比与给定百分比(从0％到100％)的活菌混合物具有良好的线性相关性，这表明双组分AIEgen***能够通过使用酶标仪有效且可靠地表征微生物的活性。

激光共聚焦显微镜：此外，由于DCQA(730nm)和TPE-2BA(460nm)之间的最小光谱重叠，串扰已被大大减少，并且***误差降至最小。然后，用激光共聚焦显微镜研究了这种双组分AIEgen***的微生物活性区分能力。样品制备过程与酶标仪方法相同。染色30分钟后，通过激光共聚焦显微镜对不同活菌百分比的混合物进行成像，每种混合物都收集了超过300个细菌细胞。正如图3所显示的那样，通过DCQA通道(N_总数)可以获得细菌细胞总数，而使用TPE-2BA通道(N_死)可以计算出死细胞的数量。然后可以通过方程式1计算出计数的活细菌的百分比(L％)。

方程式1:

激光共焦显微镜用于DCQA的激发波长为560nm，发射范围为600-750nm。对于TPE-2BA，选择405nm作为激发波长，选择420-500nm作为发射范围。由于双组份AIEgen***的最小光谱重叠，因此两个通道之间没有串扰。从图4B中可以观察到，红色/蓝色荧光比与给定百分比(从0％到100％)的活细菌混合物具有良好的线性相关性，这表明双组份AIEgen***能够通过使用酶标仪有效且可靠地表征微生物的活性。

流式细胞术：流式细胞术是生物学研究领域中的一项强大技术，可以提供高通量的各种生物样品(例如细胞和微生物)分析。通过读取标记样品的荧光信号，可以连续性地获取并且分析数据。通过流式细胞术可以容易地区分微生物的活性。然后，流式细胞术被应用于测试双组分AIEgen***的染色能力。样品制备过程与酶标仪方法和激光共聚焦显微镜相同。染色30分钟后，通过流式细胞术分析了不同活细菌百分比的混合物，每种混合物分析了5000个细菌细胞。图4C和图4D给出了直方图和线性拟合结果。

实施例5：双聚集诱导发光的荧光发光剂***在监测微生物的生物膜的形态和代谢状态中的应用

微生物生物膜是自然界中微生物最常见的生命形式，可以在生物膜状态下实现对环境的快速适应、耐药性的产生以及与其他微生物的合作。根据IUPAC，生物膜是微生物的聚集体，在生物膜中细胞经常嵌入相互粘附和/或粘附于表面的细胞外聚合物(EPS)的自生基质中。因此，由于生物膜由许多物质组成，其结构复杂，并使得对其结构和相对功能的研究变得极为困难。但是，迫切需要对其结构和功能进行可视化。如上所示，双组分AIEgen***对于浮游微生物成像和活性识别非常有效，由于该***的AIE特性，可以认为该***在生物膜中应该能很好地工作。因此，选择了三种基本的微生物生物膜，即S.aureus生物膜、E.coli生物膜和C.albicans生物膜来进行阐述(图5)。从图5A-C的第一组中，发现DCQA已经描述了形态，可以认为DCQA使生物膜中的所有微生物细胞染色。正如在S.aureus生物膜中发现的那样，类似蘑菇的形态已被DCQA良好染色并呈现出来。同时E.coli生物膜具有松散形态的特征，也已被DCQA很好地染色和呈现出来(图5B)。发现该厚度为约40um，稍厚于S.aureus生物膜。这是因为和S.aureus生物膜相比，E.coli细菌细胞的分布要松散得多。DCQA成功地说明了两种主要细菌生物膜模型的差异。DCQA还成功地成像了具有典型形态的C.albicans生物膜(图5C)。这些结果与设计原理一致，即发红色光的DCQA基于其广泛的染色性能和低毒性负责监测形态。两个正电荷通过静电相互作用有效而牢固地赋予DCQA对负电荷微生物的普遍的染色能力。在图5A-C的第二组中，发蓝色光的AIEgen TPE-2BA已经得到了每个生物膜的代谢状态并将其可视化了。在生物膜的生长过程中，有四个阶段，即细菌粘附、生物膜形成、生物膜成熟和生物膜扩散。在成熟的生物膜中，由于自然生命周期以及生物膜结构和功能的发展，部分微生物细胞死亡。当生物膜达到成熟阶段时，核心区域趋向于缺氧且营养较少，因此内部有更多的死细胞。这种现象在类似蘑菇的S.aureus生物膜中得到了显著的体现(第二组，图5A)。死S.aureus细胞位于生物膜底部和核心区域，其与经典生物膜模型中的描述一致。对于图5B中的E.coli生物膜，它看起来像吸水泡沫，其中的细菌细胞随机分散，这是其富含多糖的细胞外基质所致。由于松散的堆积，E.coli生物膜处于较低的缺氧环境，因此在那里发现的死细胞较少。对于C.albicans生物膜，发现大多数死细胞位于聚集位置，这归因于真菌细胞的自然生命周期。在图5A-C的第三组中，呈现了DCQA和TPE-2BA的合并图像。同时观察生物膜的形态和活性更为直接。形态可以直接在3D合并图像中观察到，同时可以用颜色来报告活性，其中蓝色或白色代表死细胞，红色代表活细胞。同时，以总生物膜形态为背景，可以更清楚地表现出死细胞的分布。正交图进一步表明，双组分AIEgen***可以将生物膜的形态和活性可视化。

以上实施例表明，本发明成功设计并合成了NIR发射的AIEgen，DCQA。精确的分子设计使DCQA具有特定的AIE特性和良好的生物相容性。DCQA的广谱染色能力有助于在活和死状态下对***、革兰氏阴性细菌和真菌进行原位和实时成像。浮游微生物及其生物膜的代谢状态通过引入TPE-2BA已被成功地监测，TPE-2BA是专门用于死微生物成像的蓝色荧光探针。在仅适用于死微生物染色的TPE-2BA的支持下，我们进一步构建了用于微生物活性检测的双组分AIEgen***。此外，该***已成功应用于监测微生物生物膜的形态和代谢状态。已经证明，这种双组分AIEgen***在微生物的检测、可视化和定量分析方面具有巨大的潜力。

以上仅为本发明的较佳实施方案而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。