CN106147752B - 一种rna荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光探针及其制备方法和在检测核酸RNA核酸中的应用。该类探针具有噻唑橙苯乙烯结构，见化学结构式(I)，且结构简单、稳定，容易制备。本发明还公开了该类探针可用于特异性检测RNA，可通过荧光分光光度计，或者直接通过肉眼观察荧光灯照射下快速检测出溶液中的RNA；也可以用于检测、标记或显示活细胞中RNA的存在与分布。本发明的荧光材料对于核酸RNA具有高效专一的识别能力，同时具有很好的细胞膜通透性，较低的光致毒性、生物毒性和光漂白性等优点，克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。

Description

一种RNA荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种荧光探针及其制备方法，以及其在水溶液中、凝胶中和细胞中检测RNA和细胞中核仁成像的用途。

背景技术

小分子探针是指针对某种特定目标生物分子或生物离子的开发的探测器，小分子探针能与特定的靶分子进行特异性相互作用，并能被特殊的检测技术所探知。与普通的检测技术相比，探针技术具有灵敏度高、专一性强、快速准确等优点，适用于分子影像和实时监测。

RNA(核糖核酸)在生物体的生长、发育及凋亡的整个过程中都有重要的调控作用；在许多疾病的发生过程中，RNA起着关键作用，如恶性肿瘤的发生与RNA的表达异常关系密切。但与DNA分析与检测技术相比，RNA的分析与检测技术的开发与应用发展缓慢。

RNA荧光探针具有在复杂的溶液体系中或者活细胞环境中高选择性、特异性地识别RNA的优点，在RNA分析与检测领域具有很好的应用前景。目前，已经商业化的RNA荧光探针只有invitrogen公司出品的RNASelect。该荧光探针在实际成像应用中存在一些缺陷，例如与RNA响应速度较慢、光致毒性大和光稳定性差等缺点，这些缺陷影响其应用价值。因此，开发性能优越的小分子荧光探针具有很强的市场价值。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种荧光探针。

本发明的另一个目的在于提供上述探针的制备方法。

本发明的再一个目的在于提供上述探针在检测水溶液中、凝胶中和细胞中RNA的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供了一种荧光探针，其结构式为：

式中X^-为阴离子，可以是碘离子、溴离子、对甲苯磺酸离子或三氟甲磺酸离子等。所述的X^-为N原子甲基化反应后的阴离子。

本发明同时提供了上述探针的制备方法，表示如下：

具体步骤为：先将4-氯-2-甲基喹啉与甲基化试剂反应，得到化合物

再将2-甲基苯并噻唑与甲基化试剂反应，得到

然后将

和

按摩尔比为1∶1-1∶1.3反应，反应温度为25-100℃，反应时间为2-5小时，反应溶剂为水、甲醇、乙醇中的一种或多种，反应在无机碱存在条件下进行，得到中间体

最后将

和4-甲巯基苯甲醛按摩尔比为1∶2-1∶3反应，反应温度为130-150℃，反应时间为2-5小时，反应溶剂为正丁醇，以4-甲基哌啶或者哌啶为催化剂，进行在缩合反应，得到最终探针化合物

本发明的另一个目的还提供了上述探针在检测水溶液中、凝胶中和细胞中RNA的应用。

本发明所述的荧光探针在标记或显示RNA和核仁在活细胞中分布的应用。

实验结果证实，利用本发明所述荧光探针标记后的荧光图像显示，在细胞质和核仁区有明显的绿光分布，明确提示所述探针能够在活细胞中专一性的成像胞质和核仁中的RNA，并且在与传统核仁荧光探针或与经RNA酶消化实验后的细胞进行对比试验后也得到进一步的证实。

本发明提供的荧光探针是一类新型的RNA选择性识别荧光探针分子，与其功能相近的荧光探针比，本发明所述探针具有低生物毒性、膜通透性好、显色强、复染兼容性好、光稳定性较强的特点，预示其作为RNA和核仁荧光探针具有广泛的应用，有望开发为RNA和核仁相关的生理和病理学研究用简捷、直观的生物检测试剂。

附图说明

图1为为探针6a与AT、DA21、LQ1、Oxy28、random、RNA六种核酸在1∶1浓度下的荧光谱。

图2为探针6a滴定四链DNA、双链DNA、RNA的荧光数据的拟合曲线。

图3为探针6a滴定RNA的荧光光谱

图4为探针6a滴定RNA的荧光光谱中C与(F-F₀)/F₀拟合的曲线..

图5为探针6a与DNA与RNA凝胶电泳图.

图6为探针6a与染料DAPI复染PC3细胞的细胞成像图

图7为探针6a与E36与RNA染料在DNase与Rnase处理之后染PC3细胞

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。通过荧光光谱实验证明，本发明涉及的化合物6a由于具有较大的电子共轭体系和平面，与RNA发生特异性的堆积作用后，荧光光谱发生明显变化，荧光强度增加百倍，甚至只需普通紫外灯照射下，肉眼观察，同时与其他的核酸作用较弱，没有明显的荧光信号响应，使该类探针具有很好的特异性识别作用。所以，我们将该探针与不同的核酸混合时，当该核酸为RNA时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当核酸为DNA(G-四链体，双链，单链)时，则不会产生明显的信号变化。以其中化合物6a为例来说明本发明的荧光探针在荧光法(包括荧光显微镜和荧光凝胶成像仪)检测水溶液中、凝胶中和细胞中RNA的应用

实施例一：化合物2的合成

往25ml圆底烧瓶里称取4-氯-喹哪啶0.2g(1.1236mmol)，加入6倍摩尔量的碘甲烷约0.96g，环丁砜1.5ml，将混合物加热到50℃，反应18个小时后，冷却，加入无水***后震荡，抽滤，固体用无水***洗涤，真空干燥后称重，得到0.345g化合物2，产率为95.8％：¹HNMR(400MHz，DMSO)δ8.56(d，J＝8.4Hz，1H)，8.46(d，J＝8.3Hz，1H)，8.22(t，J＝8.1Hz，1H)，8.01(t，J＝7.9Hz，1H)，7.55(s，J＝7.4Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.74(s，1H)，2.68(s，3H)。

实施例二：化合物4的合成

往25ml的圆底烧瓶里称取2-甲基-苯并噻唑0.25g(1.68mmol)，加入6倍摩尔量的碘甲烷约1g、无水乙醇5ml，80℃下反应15个小时后，将反应后的溶液冷却至室温，然后加入无水乙醇和三氯甲烷各5ml，振荡后抽滤，并用少量乙醇和三氯甲烷洗涤沉淀，真空干燥后得到化合物4为白色粉末状固体0.448g，收率为91.7％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.44(d，J＝8.1Hz，1H)，8.30(d，J＝8.4Hz，1H)，7.90(t，J＝7.8Hz，1H)，7.81(t，J＝7.7Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.54(s，1H)，3.17(s，3H)。

实施例三：化合物5的合成

称取化合物2和4各0.50g，加入到装有10ml甲醇的圆底烧瓶中，室温条件下搅拌6分钟后加入2ml 0.5mol/L碳酸氢钠水溶液，室温搅拌约1小时。向反应后的溶液中加入4ml饱和KI溶液，搅拌约15分钟后抽滤，再用10ml水洗，4ml丙酮洗涤，最终得到砖红色固体，干燥后得到0.98g化合物5，产率为81.7％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.77(d，J＝8.3Hz，1H)，8.18(d，J＝8.7Hz，1H)，8.02-7.96(m，2H)，7.74(d，J＝8.2Hz，2H)，7.59(t，J＝7.7Hz，1H)，7.39(t，J＝7.5Hz，1H)，7.34(s，1H)，6.85(s，1H)，4.07(s，3H)，3.98(s，3H)，2.87(s，3H)。

实施例四：化合物6a的合成

称取0.0715g(0.160mmol)的5于25ml的圆底烧瓶中，加入2倍摩尔量的4-甲硫基苯甲醛0.049g、正丁醇1.5ml、4-甲基哌啶5滴，在130～135℃下反应3个小时，冷却后抽滤，用正丁醇洗涤固体，干燥称重后得66mg，产率71％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.73(d，J＝7.8Hz，1H)，8.14(d，J＝8.4Hz，1H)，8.06-8.02(m，1H)，8.00-7.95(m，1H)，7.87(d，J＝8.5Hz，2H)，7.76-7.68(m，3H)，7.64(s，1H)，7.61-7.55(m，2H)，7.42-7.35(m，3H)，6.87(s，1H)，4.13(s，3H)，3.97(d，J＝3.7Hz，3H)，2.56(s，3H)。

实施例五：荧光探针6a对不同核酸选择性的荧光光谱实验

将5mM的化合物储备液稀释成5uM的浓度，再加入不同种类的核酸用荧光分光光度计(狭缝宽度10nm，扫描速度200nm/min，激发波长475nm)测出其各自的荧光强度，发现荧光探针6a与RNA的结合之后荧光强度最强。

选择性实验中所使用的核酸

实施例六：荧光探针6a对不同核酸的荧光滴定实验

将5mM的化合物储备液稀释成5μM的浓度，放置于荧光分光光度计中，逐渐增加溶液中不同核酸的浓度，并进行荧光强度测定。测定条件为：狭缝宽度10nm，扫描速度200nm/min，激发波长475nm。

荧光滴定实验中所使用的核酸

实施例七：荧光探针6a对RNA检测限的测定

将5mM的化合物储备液稀释成5μM的浓度，再在荧光分光光度计(狭缝宽度10nm，扫描速度200nm/min，激发波长475nm)扫描，再往其中慢慢加入RNA做到使其饱和.检测限的计算公式

LOD＝K×S_b/m

LOD(化合物的结合常数)，m是浓度C与(F-F0)/F0的所做直线的斜率，S_b为用仪器空白多次测量的标准偏差，K值按照国际纯粹和应用化学联合会建议通常取为3，6a测得的LOD为6μg/L。

实施例八：噻唑橙苯乙烯类化合物的细胞成像实验

先将细胞接种于6孔板中，使细胞的密度约为2×10³个/mL，然后在37℃、5％CO₂环境中培养24h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用预冷的1×PBS洗3次，然后再加入预冷的纯甲醇1.5mL常温避光放置1min，最后弃去纯甲醇并再用预冷的1×PBS洗3次，加入1mL的5μM的化合物然后放置15min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入1μM的DAPI溶液1mL并37℃放置2min，然后再用预冷的1×PBS洗6次，每次浸泡5min。在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况.

实施例九：噻唑橙苯乙烯类化合物的Rnase与DNase细胞成像实验

先将细胞接种于6孔板中，使细胞的密度约为2×10³个/mL，然后在37℃、5％CO₂环境中培养24h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用预冷的1×PBS洗3次，然后再加入预冷的纯甲醇1.5mL常温避光放置1min，最后弃去纯甲醇并再用预冷的1×PBS洗3次，加入1mL的5uM的化合物然后放置15min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×PBS洗3次，在六孔板中分别加入1mL DNase，DNase-Free RNase的溶液并37℃，5％CO₂培养3h.弃去6孔板中的酶溶液，再用预冷的1×PBS洗3次，每次浸泡5min。在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况.

实施例十：核酸凝胶电泳实验

先将5×TBE电泳缓冲液、过硫酸铵10％m/V、6X载样缓冲液、亚甲双丙酰胺(29∶1)(％，m/V)配好，接着安装电泳装置和配置凝胶溶液，灌制凝胶，待凝胶冷却之后取出梳子和隔板，放入电泳槽中，缓冲液淹没过胶1-2mm为止，DNA样品配成5μM(混合液中上样缓冲液为1X)，RNA配成5mg/L，分别取10uL加入凝胶点样孔中，将整个电泳仪接通，45V电压跑1h，接着100V电压跑3h，取出凝胶块，再将凝胶块放入染色剂和化合物中泡染，染过之后吹干，将其置于凝胶电泳仪上观察。

Claims (6)

1.一种噻唑橙苯乙烯类RNA荧光探针，其特征在于化学结构式如I所示：

式中X^—为碘离子、溴离子、氯离子、对甲苯磺酸离子或三氟甲磺酸离子。

2.一种如权利要求1所述RNA荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

将4-氯-2-甲基喹啉与甲基化试剂反应，得到化合物

将2-甲基苯并噻唑与甲基化试剂反应，得到

然后将

反应，得到

最后将

和4-甲巯基苯甲醛反应，得到最终探针化合物

3.如权利要求1所述的荧光探针在制备检测水溶液中核酸RNA产品的应用。

4.如权利要求1所述的荧光探针在制备检测琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中RNA产品的应用。

5.如权利要求1所述的荧光探针在制备检测细胞中RNA产品的应用。

6.如权利要求1所述的荧光探针在制备真核细胞中RNA颗粒染色以及核仁成像产品的应用。

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