CN114341187A - 抗突变型fgfr3抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供了能够区分野生型FGFR3和FGFR3 S249C突变体的抗体。使用这些抗体，构建了能够选择性地破坏表达FGFR3 S249C突变体的肿瘤细胞的抗原结合分子。

Description

抗突变型FGFR3抗体及其用途

技术领域

本公开涉及抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)S249C突变体抗体及其用途。本公开还涉及针对FGFR3S 249C突变体和CD3的双特异性抗体，以及此类抗体的用途，特别是此类抗体在治疗癌症中的用途。

背景技术

本节中的陈述仅提供有关本公开的背景信息，并不一定构成现有技术。

FGF和FGFR

成纤维细胞生长因子(FGF)家族及其受体控制许多生物活动，例如细胞增殖、细胞迁移和细胞分化。尽管已在人类中报道了22种类型的FGF成员，但这些配体中只有18种类型与受体结合(非专利文献1)。

在人类中，有四种类型的单跨膜受体酪氨酸激酶(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)。这些受体的结构由三个细胞外免疫球蛋白区、跨膜区和细胞内酪氨酸激酶区组成(非专利文献1)。

两个受体分子通过免疫球蛋白区域与两个配体分子和硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)结合以形成FGF-FGFR复合物。FGFR1、FGFR2和FGFR3的配体特异性由免疫球蛋白区域III(即FGF结合区域)的C端半部分的选择性剪接决定。这种选择性剪接产生含有外显子8的IIIb同工型和含有外显子9的IIIc同工型(isoform)。FGF3、7、10和22仅与IIIb同工型结合，而FGF1与IIIb和IIIc同工型二者结合。另一方面，其他13个FGF配体优先结合IIIc同工型。

当FGF配体与FGFR结合时，由于受体激活，细胞内结构域被磷酸化，并且细胞内酪氨酸激酶区被激活。FGFR信号传递到FGFR底物(FRS2)、生长因子受体结合2(Grb2)和Son OfSevenless 1(SOS)复合物以及MAPK通路(非专利文献2)。

FGFR3及其错义突变

FGFR3基因位于染色体4p16.3上。在膀胱尿路上皮癌(urothelial bladdercancer)中发现了FGFR3中的错义突变。目前发现的错义突变为R248C，S249C，G372C，S373C，Y375C，G382R/E，A393E，K562E/M/Q/T等。其中，S249C的突变率最高(非专利文献3)。S249C突变是细胞外区域中的突变。由S249C突变翻译的半胱氨酸残基在受体之间形成二硫键并促进配体非依赖性激活(非专利文献4)。

当FGFR3S 249C突变体蛋白在NIH3T3细胞或正常尿路上皮细胞中高表达时，FGFR3S 249C突变体蛋白被组成型磷酸化(非专利文献5)。

FGFR3 S249C突变体与疾病之间的关系

FGFR3 S249C突变体也发现于肺鳞状细胞癌中。503个中国肺鳞状细胞癌样品中有5个(1.2％)具有S249C突变(非专利文献6)。

FGFR3S 249C突变体也发现于HPV阳性的头颈部鳞状细胞癌中。在120个头颈部鳞状细胞癌样品(其中45％为HPV阳性)中，包括S249C的FGFR2突变和FGFR3突变占17.6％。另一方面，在HPV阴性样品中未观察到FGFR2和FGFR3突变(非专利文献7)。

FGFR3 S249C突变体也发现于***中。对几项研究的综合分析表明，在349个***样品中，有6个病例(1.7％)发现了FGFR3 S249C突变体(非专利文献8)。

FGFR3 S249C突变体也发现于***癌中。对几项研究的综合分析表明，在112个***癌样品中，有7个病例(63％)发现了FGFR3 S249C突变体(非专利文献9)。

抗FGFR3抗体

发明人已知的靶向FGFR3的治疗性抗体是R3Mab，它是特异性结合FGFR3的中和抗体(专利文献1和2)。R3Mab抑制FGF1诱导的FGFR3激活和下游分子FGFR底物2和MAPK的磷酸化。此外，R3Mab具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。R3MAb不仅对野生型FGFR3菌株如RT112显示出抗肿瘤活性，而且对具有FGFR3 S249C突变的Ba/F3-FGFR3 S249C和UM-UC-14肿瘤也显示出抗肿瘤活性(非专利文献10)。R3Mab的I期试验已经进行，但没有后续的开发报告(非专利文献11)。B-701是一种FGFR3单克隆IgG1抗体，其具有拮抗作用，并且不会与其他FGFR(FGFR1、FGFR2或FGFR4)交叉反应。对于多发性骨髓瘤的开发已停止，没有对于实体瘤I期研究的后续报告，并且正在开发作为局部晚期或转移性尿路上皮细胞癌的适应症(非专利文献12)。

选择性结合FGFR3 S249C突变体的抗体

同时，试图获得不与在正常组织中表达的野生型FGFR3反应并选择性结合肿瘤特异性FGFR3 S249C突变体的抗体(非专利文献13)，以及据称在初步ELISA筛选中获得了不与野生型FGFR3结合但对FGFR3 S249C突变体表现出选择性结合活性的杂交瘤。然而，描述了这些杂交瘤在单细胞克隆和扩增过程中不稳定并且失去了选择性结合FGFR3 S249C突变体的能力(非专利文献13)。到目前为止，没有关于分离针对FGFR3 S249C突变体的选择性抗体克隆的报道。

多特异性抗原结合分子和双特异性抗体

正在研究通过一种分子与两种或多种抗原结合的多特异性抗原结合分子。其中，双特异性抗体是通过修饰天然IgG型抗体而赋予针对两种不同抗原(第一抗原和第二抗原)的结合活性的抗体(非专利文献14)。双特异性抗体不仅用作通过一个分子中和两种抗原的抗体，而且它们还可以用作通过交联具有细胞毒活性的细胞和癌细胞来增强抗肿瘤活性的抗体。

T细胞重定向抗体

自1980年代以来，T细胞重定向抗体已作为双特异性抗体的示例而为人所知，其是一种抗体，其抗肿瘤作用基于其中T细胞被招募为效应细胞的细胞毒性(非专利文献15、16和17)。与抗肿瘤作用基于ADCC(其中NK细胞和巨噬细胞被招募为效应细胞)的抗体不同，T细胞重定向抗体是含有以下的双特异性抗体：针对T细胞上T细胞受体(TCR)复合物的任何组成亚基的抗体，尤其是与CD3ε链结合的抗体，以及与靶癌细胞上的抗原结合的抗体。当T细胞重定向抗体同时与CD3ε链和癌抗原结合时，T细胞和癌细胞交联，结果由于T细胞的细胞毒性作用，对癌细胞产生抗肿瘤作用。

在T细胞重定向抗体的肿瘤抗原中，重要的是选择仅在癌细胞中表达的抗原，因为如果肿瘤抗原在正常组织中表达，则正常组织会受到损伤，并会引起强烈的副作用。

[引文列表]

[专利文献]

[专利文献1]WO2010/111367

[专利文献2]WO2016/105503

[非专利文献]

[非专利文献1]Saichaemchan等人，Current molecular medicine 2016；16：40-62.

[非专利文献2]Kelleher等人，Carcinogenesis 2013；34：2198-2205.

[非专利文献3]Hart等人，Molecular biology of the cell 2001；12：931-942.

[非专利文献4]d′Avis等人，the molecular biology journal of the AmericanAssociation for Cancer Research 1998；9：71-78.

[非专利文献5]di Martino等人，2009 Oncogene.2009年12月3日28(48)：4306-4316

[非专利文献6]Wang等人，Oncotarget 2015；6：34300-34308.

[非专利文献7]Seiwert等人，an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research 2015；21：632-641.

[非专利文献8]Rosty等人，Molecular cancer 2005；4：15.

[非专利文献9]Hernandez等人，2009Mod Pathol.2009Jun；22(6)：848-56.doi：10.1038/modpathol.2009.46.Epub 2009年4月17日

[非专利文献10]Qing等人，The Journal of clinical investigation 2009；119：1216-1229.

[非专利文献11]Oncotarget 2017 8(9)16052-74.

[非专利文献12]ClinicalTrials.gov NCT02401542

[非专利文献13]Gorbenko，2009 Hybridoma(Larchmt).2009年8月28日(4)：295-300

[非专利文献14]Kontermann，mAbs 2012；4：182-197.

[非专利文献15]Mezzanzanica等人，International journal of cancer 1988；41：609-615.

[非专利文献16]Staerz和Bevan，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 1986；83：1453-1457.

[非专利文献17]Staerz等人，Nature 1985；314：628-631.

发明概述

技术问题

本公开的目的是提供选择性结合成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)S249C突变体的抗体。更具体地，本公开的目的是提供能够区分野生型FGFR3和FGFR3 S249C突变体的抗体。此外，基于选择性结合FGFR3 S249C突变体的抗体，构建能够选择性地破坏表达FGFR3S249C突变体的肿瘤细胞的抗原结合分子也是本公开的一个目的。

解决问题的方案

为了实现上述目的，本发明人试图制备一种单克隆抗体，该单克隆抗体选择性地结合存在于细胞膜表面的天然FGFR3 S249C突变体。此外，他们发现包含获得的与FGFR3S249C突变体结合的单克隆抗体的结构域和与T细胞受体(TCR)复合物结合的结构域的抗原结合分子对表达FGFR3 S249C突变体的癌细胞表现出选择性细胞毒活性，从而完成本公开。

具体地，本公开提供以下内容：

本公开提供了FGFR3 S249C突变体结合分子，其可用于治疗或预防与FGFR3 S249C突变体的表达和/或活性(例如增加的表达和/或活性，或不希望的表达和/或活性)相关的病理病况。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子用于***、癌症和/或细胞增殖性病症。

在另一个实施方案中，本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体可用作用于检测和/或分离FGFR3 S249C突变体的试剂，例如用于检测各种组织和细胞类型中的FGFR3 S249C突变体。

本公开进一步提供了用于产生和使用FGFR3 S249C突变体结合分子的方法，以及编码FGFR3 S249C突变体结合分子的多核苷酸。

[1]分离的抗原结合分子，其相比于野生型FGFR3，对FGFR3 S249C突变体具有选择性结合活性。

[2]根据[1]所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述选择性结合活性是这样的：当抗原结合分子以添加到表达FGFR3 S249C突变体的细胞系中至少10倍高的浓度添加到表达野生型FGFR3的细胞系中时，抗原结合分子与表达FGFR3 S249C突变体的细胞系的结合类似于或大于抗原结合分子与表达野生型FGFR3的细胞系的结合，其中表达细胞系是各自以相同程度表达野生型FGFR3或FGFR3 S249C突变体的细胞系。

[3]分离的抗原结合分子，其包含以下组的六个HVR的任意一个：

(a)

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；

(b)

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或

(c)

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列；

[4]根据[3]所述的抗原结合分子，其中所述重链可变区和所述轻链可变区包括小鼠、兔、人源化或人框架。

[5]根据[3](a)所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[6]根据[3](b)所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[7]根据[3](c)所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[8]根据[5]所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[9]根据[6]所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[10]根据[7]所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[11]根据[3]-[7]中任一项所述的抗原结合分子，其包含

(a)与SEQ ID NO：5、7和9的任一氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；

(b)与SEQ ID NO：6、8和10的任一氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或

(c)SEQ ID NO：5、7和9中任一项的VH序列和SEQ ID NO：6、8和10中任一项的VL序列。

[12]根据[1]-[10]所述的抗原结合分子，其中，与FGFR3 S249C突变体的结合与包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID No：10对的抗体竞争，或与包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID No：10对的抗体结合相同的表位。

[13]根据[3]-[12]中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包含抗体Fc区。

[14]根据[13]所述的抗原结合分子，其中，所述抗体Fc区包含在IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区中具有至少1个氨基酸突变的Fc区。

[15]根据[3]-[14]中任一项所述的抗原结合分子，其具有细胞毒活性。

[16]根据[15]所述的抗原结合分子，其具有ADCC或CDC的细胞毒活性。

[17]根据[3]至[12]中任一项所述的抗原结合分子，其为(a)单克隆抗体；(b)人源化或嵌合抗体；(c)人抗体；(d)IgG抗体；或(e)抗体片段。

[18]根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子，其与细胞毒性剂缀合。

[19]免疫缀合物，其包含根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子和细胞毒性剂。

[20]根据[18]所述的抗原结合分子，其具有内化活性。

[21]药物组合物，其包含[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子或[19]所述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。

[22]根据[21]所述的药物组合物，其用于癌症治疗或预防，或者治疗和预防。

[23]根据[22]所述的药物组合物，其用于治疗或预防或者治疗和预防膀胱癌、肺鳞状细胞癌、头颈癌或***。

[24]根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子或[19]所述的免疫缀合物在制备药物中的用途。

[25]根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子或[19]所述的免疫缀合物在制备用于癌症治疗或预防或者治疗和预防的药物中的用途。

[26]根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子的免疫缀合物或[19]所述的免疫缀合物在制备用于治疗或预防或者治疗和预防膀胱癌、肺鳞状细胞癌、头颈癌或***的药物中的用途。

[27]预防或治疗或预防和治疗方法，其包括向患有癌症的个体施用有效量的用于制备药物的根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子，或[19]所述的免疫缀合物的步骤。

[28]预防或治疗或预防和治疗的方法，其包括向患有膀胱癌、肺鳞状上皮癌、头颈癌或***的个体施用有效量的用于制备药物的根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子，或[19]所述的免疫缀合物。

[29]用于治疗或预防或者治疗和预防癌症的试剂盒，其至少包含根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子或[19]所述的免疫缀合物，以及使用说明。

[30]用于治疗或预防或预防和治疗膀胱癌、肺鳞状上皮癌、头颈癌或***的试剂盒，其至少包含根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子，或[19]所述的免疫缀合物，以及使用说明。

[31]从生物样品中检测FGFR3 S249C突变体的方法，其包括使所述生物样品与根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子接触。

[32][32]所述的检测方法，其包括，在允许根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子与FGFR3 S249C突变体结合的条件下，使所述生物样品与根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子接触，和检测在[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子与FGFR3 S249C突变体之间形成的复合物。

[33]用于诊断受试者是否患有癌症的方法，该方法包括将生物样品和根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子与来自所述受试者的生物样品接触。

[34][33]所述的诊断方法，其包括，在允许根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子与FGFR3 S249C突变体结合的条件下，使所述生物样品与根据[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子接触，和检测在[1]至[17]中任一项所述的抗原结合分子与FGFR3 S249C突变体之间形成的复合物。

[35]根据[31]至[34]中任一项所述的方法，其中，所述癌症为膀胱癌、肺鳞状细胞癌、头颈癌或***。

[36]一种核酸，其编码根据[3]至[17]中任一项所述的抗原结合分子。

[37]一种载体，其包含根据[36]所述的核酸。

[38]一种细胞，其包含根据[36]所述的核酸或根据[37]所述的载体。

[39]用于产生抗体的方法，其包括培养产生所述抗体的[38]所述的细胞。

[40][39]所述的方法，其包括从细胞培养物中回收所述抗体。

[41]多特异性抗原结合分子，其包含：对FGFR3 S249C突变体具有选择性结合活性的第一抗原结合结构域；和具有T细胞受体复合物结合活性的第二抗原结合结构域。

[42]根据上述[41]所述的多特异性抗原结合分子，其中，关于选择性结合活性，当所述抗原结合分子以添加到表达FGFR3 S249C突变体的细胞系中至少10倍高的浓度添加到表达野生型FGFR3的细胞系中时，所述抗原结合分子与表达FGFR3 S249C突变体的细胞系的结合亲和力类似于或大于所述抗原结合分子与表达野生型FGFR3的细胞系的结合亲和力，其中表达细胞系是以相同程度各自表达野生型FGFR3和FGFR3 S249C突变体的细胞系。

[43]多特异性抗原结合分子，其中所述多特异性抗原结合分子是包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的分离的抗原结合分子，其包含以下任一项：

(a)

以下各项的第一抗原结合结构域的重链可变区：

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，

和以下各项的第一抗原结合结构域的轻链可变区：

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；

(b)

以下各项的第一抗原结合结构域的重链可变区：

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，

和以下各项的第一抗原结合结构域的轻链可变区：

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或

(c)

以下各项的第一抗原结合结构域的重链可变区：

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列

和以下各项的第一抗原结合结构域的轻链可变区：

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列；

并且其包含：

以下各项的第二抗原结合结构域的重链可变区：

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，

和以下各项的第二抗原结合结构域的轻链可变区：

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列，和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。

[44][43]所述的多特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域之一或两者的重链可变区和轻链可变区包括小鼠、兔、人源化或人框架。

[45]根据[43](a)所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[46]根据[43](b)所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[47]根据[43](b)所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

[48]多特异性抗原结合分子，其为分离的抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域的重链和轻链可变区包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列，第二抗原结合域的重链可变区和轻链可变区包含SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的氨基酸序列。

[49][48]所述的多特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域包含

(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；以及第二抗原结合域，其包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，其中所述重链可变(VH)结构域包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)结构域包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

(b)如(a)中所示的VH结构域和VL结构域，以及包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的第二抗原结合结构域，其中所述重链可变(VH)结构域包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)结构域包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

(c)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；以及第二抗原结合域，其包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，其中所述重链可变(VH)结构域包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)结构域包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

(d)如(c)中所示的VH结构域和VL结构域，以及包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的第二抗原结合结构域，其中所述重链可变(VH)结构域包含与SEQ ID NO：13的的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)结构域包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，

(e)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；以及第二抗原结合结构域，其包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，其中所述重链可变(VH)结构域包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)结构域包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或

(f)如(e)中所示的VH结构域和VL结构域，以及包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的第二抗原结合结构域，其中所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)结构域包含与SEQ IDNO：15的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

[50]多特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含抗CD3臂和抗FGFR3S249C突变体臂，其中所述抗CD3臂包含(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VH结构域和(b)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VL结构域，所述抗FGFR3 S249C突变体臂包含(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VH结构域和(b)第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VL结构域。

[51]根据[41]至[50]中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子具有细胞毒活性。

[52]根据[51]所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述细胞毒活性为T细胞依赖性细胞毒活性(TDCC)。

[53]根据[51]所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述细胞毒活性是针对在表面上表达FGFR3 S249C突变体的细胞的细胞毒活性。

[54]根据[41]至[53]中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述T细胞受体复合物结合活性为与CD3ε链的结合活性。

[55]根据[41]至[54]中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述FGFR3S249C突变体结合活性是真核细胞表面与FGFR3 S249C突变体的结合活性。

[56]根据[41]至[55]中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述FGFR3S249C突变体结合活性是人FGFR3 S249C突变体结合活性。

[57]根据[41]至[56]中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域为抗体可变片段(Fv)，或所述第一抗原结合结构域和所述第二抗体结合结构域是抗体可变片段(Fv)。

[58]根据[41]至[57]中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域为抗体结合片段(Fab)，或所述第一抗原结合结构域和所述第二抗体结合结构域是抗体结合片段(Fab)。

[59]根据[41]至[58]中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其进一步包含与Fcγ受体的结合活性降低的Fc区。

[60]根据[59]所述的多特异性抗原结合分子，其另外包含由与具有IgGl、2、3或4抗体的Fc区的多肽(SEQ ID NO：66、67、68、69)对Fcγ受体的结合活性相比具有降低的结合活性的Fc区组成的结构域。

[61]根据[59]和[60]所述的多特异性抗原结合分子，其另外包含在EU编号***中的以下位置处具有至少1个氨基酸突变的Fc区，其中根据[59]和[60]所述的多特异性抗原结合分子具有一个或多个选自220，226，229，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，264，265，266，267，269，270，295，296，297，298，299，300，325，327，328，329，330，331和332的组的突变，并且其中突变体抗体通过含有上述突变的部分与细胞外结构域结合。

[62]根据[41]至[61]中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其是由具有FGFR3S249C突变体结合活性的第一抗体可变片段，具有CD3ε链结合活性的第二抗体可变片段，以及对FcγR的结合活性降低的Fc区组成的双特异性抗体。

[63]一种核酸，其编码根据[41]至[61]中任一项所述的多特异性抗原结合分子。

[64]载体，其中已引入根据[63]所述的核酸。

[65]细胞，其包含根据[63]所述的核酸或根据[64]所述的载体。

[66]通过培养[65]所述的细胞来生产[41]至[62]中任一项所述的多特异性抗原结合分子的方法。

[67]通过[66]所述的生产方法而生产的根据[41]至[62]中任一项所述的多特异性抗原结合分子。

[68]一种药物组合物，其包含根据[41]至[62]中任一项所述的多特异性抗原结合分子。

[69]用于诱导细胞毒活性的药物组合物，其包含根据[41]至[62]中任一项所述的多特异性抗原结合分子。

[70]用于治疗或预防或者治疗和预防癌症的药物组合物，其包含根据[41]至[62]中任一项所述的多特异性抗原结合分子。

[71]根据[70]所述的药物组合物，其中所述癌症是膀胱癌、肺鳞状细胞癌、头颈癌或***。

[72]预防或治疗或者预防和治疗癌症的方法，其中将根据[41]至[62]中任一项所述的多特异性抗原结合分子施用于有需要的患者。

[73]根据[72]所述的方法，其中根据[72]所述的癌症是膀胱癌、肺鳞状细胞癌、头颈癌或***。

发明效果

本公开提供了能够区分FGFR3 S249C突变体与野生型FGFR3的抗体。除了在癌细胞中特异性表达外，FGFR3 S249C突变体还参与癌细胞增殖。因此，可以预期在靶向FGFR3S249C突变体的癌症治疗策略中对癌症具有高选择性。事实上，已证实使用通过本公开获得的与FGFR3 S249C突变体结合的抗体构建的双特异性抗原结合分子对表达FGFR3 S249C突变体的细胞具有选择性细胞毒性。

附图简述

图1显示了在强制表达野生型人FGFR3的CHO细胞(hFGFR3/CHO DXB11s)和强制表达人FGFR3 S249C突变体的CHO细胞(hFGFR3 S249C/CHO DXB11s)中人FGFR3的表达水平的测量。证实了野生型人FGFR3和人FGFR3 S249C突变体在这些细胞中细胞表面上的表达水平相似。

图2a显示了在hFGFR3/CHO DXB11s和hFGFR3 S249C/CHO DXB11s细胞中(a)和(b)的结合活性的测量，其中(a)为单特异性人抗FGFR3 S249C突变体抗体(其中其两个抗原结合位点结合相同抗原的抗体；FGA0005二价Ab和FGA0007二价Ab)，(b)为双特异性人抗FGFR3S249C突变体和CD3抗体(其中左右抗原结合位点与不同抗原结合的抗体；FGA0005/CD3TRAB和FGA0007/CD3 TRAB，其中一种与人FGFR3 S249C突变体结合，另一种与CD3结合)。与hFGFR3/CHO DXB11相比，单特异性和双特异性FGA0005和FGA0007抗体均显示出对hFGFR3S249C/CHO DXB11的高结合活性。

图2b显示了图2a的继续。

图3显示在人肺癌细胞PC10细胞系(PC10)、强制表达野生型人FGFR3的PC10细胞(PC10/FGFR3WT)和强制表达人FGFR3 S249C突变体的PC10细胞(PC10/FGFR3 S249C)中人FGFR3在细胞表面上的表达水平的测量。证实了人FGFR3在PC10、PC10/FGFR3 WT和PC10/FGFR3 S249C中的表达水平相似。

图4显示了其中一个臂与人FGFR3 S249C突变体结合而另一臂与CD3结合的双特异性抗体(FGA0002/CD3-TRAB)和其中一个臂不与人FGFR3 S249C突变体结合而另一臂与CD3结合的双特异性抗体(KLH/CD3-TRAB)在PC10、PC10/FGFR3 WT和PC10/FGFR3 S249C中的结合活性的测量。FGA0002/CD3-TRAB和KLH/CD3-TRAB在PC10和PC10/FGFR3 WT中显示出相似的结合活性。另一方面，在PC10/FGFR3 S249C中，与KLH/CD3-TRAB相比，FGA0002/CD3-TRAB显示出更高的结合活性。

图5显示使用人外周血单核细胞作为效应细胞在PC10、PC10/FGFR3 WT和PC10/FGFR3 S249C中FGA0002/CD3-TRAB和KLH/CD3-TRAB的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)活性的测量。KLH/CD3-TRAB在任何细胞中均未显示出TDCC活性，而FGA0002/CD3-TRAB仅在PC10/FGFR3 S249C中显示出TDCC活性。

[实施发明的方式]

I.定义

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology第二版，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)，和March，AdvancedOrganic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第四版，John Wiley&Sons(New York，NY 1992)将为本领域的普通技术人员提供本文中使用的许多术语的一般指导。本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入本文。

以下定义适用于解释本说明书的目的，并且只要适用，以单数形式使用的术语也包括复数形式，反之亦然。应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制。如果以下任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，则以以下定义为准。

“氨基酸”

在本说明书中，氨基酸以单字母表示法、三字母表示法或两者表示。即，Ala/A用于丙氨酸，Leu/L用于亮氨酸，Arg/R用于精氨酸，Lys/K用于赖氨酸，Asn/N用于天冬氨酸，Met/M用于蛋氨酸，Asp/D用于天冬酰胺，和Phe/F用于苯丙氨酸，Cys/C用于半胱氨酸，Pro/P用于脯氨酸，Gln/Q用于谷氨酸，Ser/S用于丝氨酸，Glu/E用于谷氨酰胺，Thr/T用于丝氨酸，Gly/G用于甘氨酸，Trp/W用于色氨酸，His/H用于组氨酸，Tyr/Y用于酪氨酸，Ile/I用于异亮氨酸，和Val/V用于缬氨酸。

“成纤维细胞生长因子受体3”和“FGFR3”

除非另有说明，本文使用的“成纤维细胞生长因子受体3”和“FGFR3”表示来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然FGFR3多肽(例如FGFR3-IIIb同工型(SEQ ID NO：1)或FGFR3-IIIc同工型(SEQ IDNO：65))。

“天然序列”

如本文所用，“天然序列”尤其包括天然存在的截短形式(例如，细胞外结构域序列或跨膜亚基序列)、天然存在的变体(例如，选择性剪接形式)和天然存在的等位基因变体。

“野生型FGFR3”

“野生型”蛋白质或其部分是动植物种群中最常见的标准形式，并且是天然存在的蛋白质的一种形式。野生型处于正常状态，并且具有其原始功能。在野生型蛋白质中发现的氨基酸序列，例如在正常组织中，是天然存在的蛋白质的氨基酸序列。

本说明书中的“野生型FGFR3”一般是指含有天然存在的FGFR3蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型FGFR3序列”通常指在天然存在的FGFR3中发现的氨基酸序列，并且包括全长、未处理的FGFR3，以及由细胞内加工产生的任何形式的FGFR3。该术语还包括天然存在的FGFR3变体，例如剪接变体或等位基因变体。人FGFR3多肽的示例性野生型FGFR3序列包含来自UniProt数据库的P22607-1(SEQ ID NO：65)或P22607-2(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。

“FGFR3配体”

如本文所用，除非另有具体说明或上下文说明，“FGFR3配体”(可互换地称为“FGF”)是指任何天然或突变体(即使其天然或合成)FGFR3配体(例如，FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17、FGF18、FGF23)多肽。术语“天然序列”具体指天然存在的截短形式(例如，细胞外结构域序列或跨膜亚基序列)、天然存在的变体(例如，选择性剪接形式)和天然存在的等位基因变体。术语“野生型FGFR3配体”通常是指包含天然存在的FGFR3配体蛋白的氨基酸序列的多肽。术语“野生型FGFR3配体序列”通常是指在天然存在的FGFR3配体中发现的氨基酸序列。

“FGFR3激活”

本说明书中的“FGFR3激活”是指FGFR3受体的活化或磷酸化。通常，FGFR3激活导致信号转导(例如，由磷酸化FGFR3受体或底物多肽的酪氨酸残基的FGFR3受体的胞内激酶结构域引起的)。FGFR3激活可以通过FGFR配体与目的FGFR3受体的结合来介导。FGFR3配体(例如，FGF1或FGF9)与FGFR3的结合激活FGFR3的激酶结构域，其磷酸化FGFR3的酪氨酸残基和/或另一种底物多肽(一个或几个)的酪氨酸残基。

“组成型”

在本文中，“组成型”当用于例如受体激酶活性时，是指受体的组成型信号转导活性，其不依赖于配体或其他活化分子的存在。取决于受体的性质，所有活性可以是组成型的，或者受体的活性可以通过与另一分子(例如，配体)的结合而被进一步激活。引起受体激活的细胞现象是本领域技术人员所熟知的。例如，激活包括多聚化成更高级的受体复合物，例如二聚化、三聚化等。复合物可包含单一蛋白质，即同聚(homomeric)复合物。或者，复合物可以包含至少两种不同的蛋白质种类，即异聚复合物。例如，复合物形成可能是由细胞表面上正常或突变受体的过表达引起的。复合物形成也可能由受体内的特定突变或多个突变引起的。

“配体非依赖性”

在本文中，“配体非依赖性”当用于例如受体信号转导活性时，是指不依赖于配体存在的信号活性。具有配体非依赖性激酶活性的受体不一定会阻止配体与其受体结合以产生进一步激活激酶活性。

在本文中，“配体依赖性”当用于例如受体信号转导活性时，是指依赖于配体存在的信号转导活性。

“FGFR3拮抗剂”和“FGFR3抑制剂”

如本文所用，“FGFR3拮抗剂”和“FGFR3抑制剂”是指本领域目前已知或将在未来被鉴定的任何FGFR3拮抗剂，并且包括通过另一种方法导致生物活性抑制的任何化学物质，其中生物学活性与患者体内FGFR3的激活有关，包括由于其天然配体在施用于患者后与FGFR3结合而产生的任何下游生物学效应。此类FGFR3拮抗剂包括能够阻断FGFR3激活或与患者的癌症治疗相关的FGFR3激活的下游生物学效应的任何药剂。这种拮抗剂可以通过直接结合受体的细胞内结构域并抑制其激酶活性而起作用。或者，此类拮抗剂可通过占据FGFR3受体或其部分的配体结合位点而起作用，从而使受体对其天然配体不可及，从而阻止或降低其正常生物活性。或者，此类拮抗剂可通过使FGFR3多肽二聚化或通过调节FGFR3多肽与其他蛋白质的相互作用而起作用，或可增强FGFR3的泛素化和内吞降解。FGFR3拮抗剂包括但不限于小分子抑制剂、抗体或抗体片段、反义构建体、小抑制性RNA(即，dsRNA的RNA干扰；RNAi)和核酶。在优选的实施方案中，FGFR3拮抗剂是与人FGFR3特异性结合的小分子或抗体。示例性的FGFR3拮抗剂抗体描述于例如美国专利号8,410,250中，其全部内容通过引用并入本文。例如，美国专利号8,410,250描述了FGFR3拮抗剂抗体克隆184.6、184.6.1和184.6.1N54S(这些克隆也称为“R3Mab”)。

“突变”

术语“突变”是指一个或几个到多个氨基酸的置换、缺失、添加或修饰，或其任何组合。可以进行含有突变的抗体的生产，目的是获得任何所需的特性，例如减少或增强与Fc受体的结合等，改善抗体的药代动力学，减少异质性，改善商业生产力，或被本公开的抗原结合分子识别。此外，变体还包括通过保守置换改变的分子，尤其是那些通常已知的分子，只要它们保留与原始序列基本相同的功能即可。氨基酸序列的缺失和***包括在氨基末端和/或羧基末端的氨基酸缺失和***。特定氨基酸的自发突变是如本文所用的“突变”。突变还包括用非天然氨基酸或20种标准氨基酸的天然氨基酸衍生物置换。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法包括定点诱变、PCR、基因合成等。在除基因工程之外的方法中，化学修饰如化学修饰也可能是有用的。突变的数量可以是本公开中指定的区域中的至少一个，并且可以包括在其他区域中多达50、40、30、20、10和5个氨基酸的缺失和/或保守置换。此外，在本公开中，“突变”包括有意引入突变的“改变”，而不管是否获得特性。

“FGFR3 S249C突变体”

本说明书中的“FGFR3 S249C突变体”是指具有不同于野生型FGFR3的氨基酸序列的突变FGFR3，其中UNIPROT注册号P22607所示的野生型人FGFR3前体(包括806个残基内1-22的分泌信号)(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：65)中位置249处的丝氨酸突变为半胱氨酸。例如，SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列是构成“FGFR3 S249C突变体”的前体的806个氨基酸残基的示例。在本公开中，除了S249C之外，“FGFR3 S249C突变体”可以包含与野生型人FGFR3前体的氨基酸序列不同的氨基酸序列。

“抗FGFR3 S249C突变体抗体”

本说明书中的“抗FGFR3 S249C突变体抗体”或“与FGFR3 S249C突变体结合的抗体”是指能够以充分的亲和性与FGFR3 S249C突变体结合的抗体，并且作为结果，其是指当靶向FGFR3 S249C突变体时可用作诊断和/或治疗剂的抗体。在特定的实施方案中，抗-FGFR3 S249C突变体抗体可以是与在不同物种的FGFR3 S249C突变体之间保守的FGFR3S249C突变体的表位结合的抗体。

结合活性

抗体与特定抗原的结合活性也可以表示为抗体的kd。抗体的kd是指抗体对特定抗原的解离速率常数，并且以秒的倒数为单位(即秒-1)表示。kd值越大，抗体与抗原的结合越弱。

野生型FGFR3也在正常组织中表达，但FGFR3 S249C突变体在癌症中特异性表达。如果可以获得与突变位点序列附近结合的抗体或选择性结合由于S249C突变而形成二硫键而导致的FGFR3蛋白的改变结构的抗体，它是构建T细胞重定向抗体的理想抗体臂。

KD值和kd值

本说明书的KD和Kd值可以使用基于表面等离子体共振的生物传感器来确定，以表征抗体-抗原相互作用。KD和kd值可以在25℃或37℃下确定。

“选择性的”

如本文所用，“选择性”或“选择性的”是指对野生型和突变体蛋白的不同结合能力。在一个实施方案中，对于抗FGFR3 S249C突变抗体与FGFR3S249C突变体蛋白和野生型FGFR3蛋白的结合程度，该术语是指抗体的这些结合活性与当将抗体以相差至少10倍、100倍或更多的浓度添加到表达相同水平的突变体和野生型FGFR3的细胞系中时的结合活性相当或更高。例如，当表示以0.1μg/mL添加到突变细胞系的抗体的结合活性的值等于或大于表示以至少1μg/mL或100μg/mL添加到野生型细胞系的抗体的结合活性的值时，这意味着抗体“显示出相对于野生型的对突变体的选择性”。

物种保守的抗FGFR3 S249C突变体抗体

在某个实施方案中，本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体结合来自多个物种的FGFR3 S249C突变体。在进一步的实施方案中，抗FGFR3 S249C突变体抗体与源自真核细胞的FGFR3 S249C突变体结合。“真核细胞”是被核膜包围的具有清晰细胞核的细胞，并且可以说除了细菌和蓝细菌(它们是原核细胞)，所有生物的细胞都属于这种细胞。在进一步的实施方案中，抗FGFR3 S249C突变体抗体与来自人和非人动物的FGFR3 S249C突变体结合。在进一步的实施方案中，抗FGFR3 S249C突变体抗体与源自人、小鼠和猴(例如食蟹猴、恒河猴、狨猴、黑猩猩或狒狒)的FGFR3 S249C突变体结合。

在特定的实施方案中，本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体对源自多个物种的野生型FGFR3具有低结合活性。在进一步的实施方案中，抗FGFR3 S249C突变体抗体对源自人和非人动物的野生型FGFR3具有低结合活性。在进一步的实施方案中，抗FGFR3 S249C突变体抗体对源自人、小鼠和猴的野生型FGFR3具有低结合活性。

在特定实施方案中，本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体与FGFR3 S249C突变体形成免疫复合物(即，抗原-抗体复合物)。

表位

本说明书中的“表位”是指抗原上与本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域结合的位点。因此，例如，表位可以由其结构来定义。表位也可以通过与该表位结合的抗原结合分子中与抗原的结合活性来定义。当抗原是肽或多肽时，也可以通过构成表位的氨基酸残基来鉴定表位。当表位是糖链时，也可以通过特定的糖链结构来指定表位。

线性表位是包含与氨基酸一级序列结合的表位的表位。线性表位通常在独特序列中包含至少3个，最通常至少5个，例如约8至约10、6至20个氨基酸。

与线性表位相反，“构象表位”是这样的表位，其中包含该表位的一级氨基酸序列不是结合表位的唯一决定因素(例如，构象表位的一级氨基酸序列不一定与表位定义的抗体结合)。与线性表位相比，构象表位可以包含更多数量的氨基酸。关于与构象表位的结合，抗体与肽或蛋白质的三维结构结合。例如，当蛋白质分子折叠并形成三维结构时，形成构象表位的氨基酸和/或多肽主链对齐，并使抗体与表位结合成为可能。用于确定表位构象的方法包括，例如，X射线晶体学、二维核磁共振光谱、位点特异性自旋标记和电子顺磁共振光谱，但不限于此。参见，例如，Methods in Molecular Biology(1996)，第66卷，Morris(编辑)中的表位作图方案(Epitope Mapping Protocols)。

竞争

抗体是否与本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体结合相同的表位或竞争结合，可以通过使用本领域已知的常规方法容易地确定。例如，本公开的抗体在饱和条件下与FGFR3S249C突变体蛋白或肽结合。接下来，评估测试抗体与FGFR3 S249C突变体结合的能力。如果在与本发明的抗FGFR3 S249C突变体抗体饱和结合后，测试抗体能够与FGFR3 S249C突变体结合，则可以断定测试抗体结合不同于本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体的表位。另一方面，如果在与本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体饱和结合后，测试抗体不能与FGFR3S249C突变体结合，则测试抗体可能结合与本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体所结合的表位相同的表位。因此，进行进一步的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以查看是否由于实际结合与本公开的抗体相同的表位或由于空间位阻(或其他现象)而未观察到测试抗体结合。

这种类型的实验可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域可用的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行。根据本公开的特定实施方案，当以1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量存在的一种抗体以至少50％，但优选75％、90％或甚至99％抑制另一种抗体结合时(如通过竞争性结合测定所测量的)，则两种抗体结合相同(或重叠)表位(例如，Junghans等人，Cancer Res.1990：50：参见1495-1502)。或者，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合相同表位。如果仅减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变子集减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。

上述结合方法可以用两种策略之一实施以确定抗体结合是否与本公开的抗FGFR3S249C突变体抗体竞争。在第一种策略中，本公开的抗体在饱和条件下与FGFR3 S249C突变体结合，然后评估测试抗体与FGFR3 S249C突变体的结合。第二种策略是在饱和条件下将测试抗体与FGFR3 S249C突变体结合后评估本公开的抗体与FGFR3 S249C突变体的结合。如果任一策略仅允许第一(饱和)抗体与FGFR3 S249C突变体结合，则得出测试抗体和本公开的抗体竞争结合FGFR3 S249C突变体的结论。与本公开的抗体竞争结合的抗体不一定必须与本公开的抗体结合相同的表位，但通过结合重叠或侧翼的表位，它可能会在空间上干扰本公开抗体的结合。

“抗原结合分子”

本说明书中的“抗原结合分子”没有特别限定，只要是含有本公开的抗原结合结构域的分子即可，并且甚至可以进一步包含具有约5个氨基酸或更多长度的肽或蛋白质。它们不限于来源于生物体的肽或蛋白质，并且例如可以是由人工设计的序列组成的多肽。此外，它们可以是任何天然多肽、合成多肽、重组多肽等。

尽管不限于这些，“抗原结合分子”是指抗体、抗体片段或由抗体片段形成的分子，如双特异性抗体或双抗体所示例的，或嵌合抗原受体(也称为“CAR”)，并且也可以包括多特异性结合分子(双特异性双抗体、双特异性抗体)。

“多特异性”

如本文所用，术语“(抗原)特异性”是指免疫实体与其结合配偶体(例如，抗原)的结合特异性，并且是指与特异性结合配偶体结合但不与其他结合配偶体结合或以低亲和力与其他配偶体结合的性质。

本文所述的多特异性抗原结合分子包括可特异性结合至少两种不同抗原的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点。

将本说明书中的“抗原结合分子”施用至人时，可以适当采用以降低对人的异源抗原性为目的而人工改变的基因重组抗体衍生结构域等作为抗原结合分子中的抗原结合结构域。基因重组抗体包括例如人源化抗体等。使用已知方法适当地产生这些改变的抗体。

“抗原结合结构域”

本说明书中的术语“抗原结合结构域”是指当抗原结合分子与抗原结合时仅与抗原的一部分(表位)结合的抗原结合分子的一部分。

与表位结合的抗原结合结构域的结构称为互补位。表位与互补位通过作用于表位与互补位之间的氢键、静电力、范德华力、疏水键等稳定结合。表位和互补位之间的结合力称为亲和力。多个抗原与多个抗原结合分子互相结合时的结合力的总和称为亲合力。当含有多个抗原结合结构域(即多价)的抗体等与多个表位结合时，由于结合力(亲和力)协同作用，所以亲合力高于亲和力。

“抗体片段”

本说明书中的“抗体片段”是指完全抗体以外的分子，其包含与完全抗体所结合的抗原结合的完全抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv(也称为“抗体可变片段”)、Fab(也称为“抗原结合片段”)、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、和单链抗体分子(例如，scFv)。

“抗体”

术语“抗体”在本文中以最广义使用，只要它显示出所需的抗原结合活性即可，并且包括但不限于各种抗体结构，例如单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段。

“分离的”抗体

如本文所用，术语“分离的”抗体是从其原始环境组分中分离出来的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)测量抗体，并纯化至高于95％或99％的纯度。例如，参见Flatman等人，J.Chromatogr.参见B 848：79-87(2007)作为评估抗体纯度方法的综述。

“单克隆抗体”

本说明书中的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体。也就是说，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的突变体抗体之外(例如，含有天然存在的突变的突变体抗体，或在单克隆抗体制剂生产过程中出现的突变体抗体)。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过各种方法制备，例如杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和使用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，但是不限于此。本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。

“人抗体”

如本文所用，术语“人抗体”是指由人或人细胞产生的抗体，或具有与使用人抗体库或另一个人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义明确排除了含有非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”是指这样的框架，即在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择组中，其表示最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是上述Kabat等人的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是上述Kabat等人的亚组III。

“人源化”抗体

本说明书中的术语“人源化”抗体是指含有来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某个实施方案中，人源化抗体包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中全部或基本上全部HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以任选地包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。

“嵌合”抗体

如本文所用，“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。

“全长抗体”、“完全抗体”和“全抗体”

如本文所用，术语“全长抗体”、“完全抗体”和“全抗体”可互换使用，并且是指具有与天然抗体的结构基本相似的结构的抗体或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。

“可变区”或“VR”

如本文所用，术语“可变区”、“可变结构域”或“VR”是指参与抗体与抗原结合的抗体的重链或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)在结构上相似，每个结构域通常包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt等人，Kuby Immunology，第六版，W.H.Freeman and Co.，91页，(2007))。一个VH或VL结构域将足以赋予抗原结合特异性。此外，可以通过使用来自与该抗原结合的抗体的VH或VL结构域筛选VL或VH结构域的互补文库来分离与特定抗原结合的抗体。例如，参见Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。

“高变区”或“HVR”

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指具有选自由以下组成的组中的至少一个特征的抗体可变结构域的每个区域：序列高变(“互补决定区”或“CDR”)，形成一个结构定义的环(“高变环”)，和包括抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含6个HVR：3个用于VH(H1、H2、H3)，和3个用于VL(L1、L2、L3)。本说明书的说明性HVR包括：

(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处出现的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；

(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处出现的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)；

(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处出现的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和

(d)与选自由(a)、(b)和(c)组成的组中的至少一种的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另有说明，可变结构域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中根据上述Kabat等人进行编号。

“框架”或“FR”

“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。相应地，HVR和FR的序列通常从N末端侧以以下次序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4，

“百分比(％)氨基酸序列同一性”

如本文所用，相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对并在必要时引入空位(gap)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可以通过使用本领域技术范围内的各种方法例如BLAST、BLAST-2、ALIGN和公开可用的计算机软件例如Megalign(DNASTAR)软件来实现用于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对。本领域技术人员可以确定用于序列比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生百分比氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序是Genetec的作品，其源代码已连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，华盛顿，20559)，并在美国版权注册号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.(南旧金山，加利福尼亚)公开获得，或者可从源代码编译。ALIGN-2程序被编译以便在UNIX操作***上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不会波动。

在使用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B的百分比氨基酸序列同一性(也可以被表述为对、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含特定百分比氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下：100乘以分数X/Y。其中X是在该程序的A和B比对中由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A相对于B的百分比氨基酸序列同一性不等于B相对于A的百分比氨基酸序列同一性。除非另有说明，本文所用的所有百分比氨基酸序列同一性值均使用如前段所述的ALIGN-2计算机程序获得。

“Fc区”

本说明书中的术语“Fc区”用于定义包含恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和突变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***(也称为EU索引)描述的，如在Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD 1991中所述。

“突变体Fc区”

本说明书中的术语“突变体Fc区”包括通过至少一个氨基酸修饰(改变)、优选一个或多个氨基酸置换而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽Fc区相比，突变体Fc区在天然序列Fc区的Fc区或亲本肽的Fc区中具有至少一个氨基酸置换。例如，它具有约1至约10个氨基酸置换，优选约1至约5个氨基酸置换。本文中的突变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，最优选与它们具有至少约90％同源性，更优选与它们具有至少约95％同源性。

本文所述的抗原结合分子的“突变体Fc区”包括构成IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的氨基酸中的Fc区，其中Fcγ受体结合活性降低。

存在五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些可以进一步分为亚类(同种型)。抗体同种型由恒定区的结构决定。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型的恒定区分别称为Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4。构成人Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4的Fc区的多肽的氨基酸序列示例于SEQ ID NO：66、67、68和69中。

Fc区是不包括F(ab’)2的区域，包含两条轻链和两条重链，两条重链含有CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，从而在两条重链之间形成链间二硫键。构成本说明书中公开的抗原结合分子的Fc区优选可以通过用诸如胃蛋白酶的蛋白水解酶部分消化IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等，然后将吸附在蛋白A柱上的级分再洗脱来获得。蛋白水解酶没有特别限制，只要它可以通过适当设定酶的反应条件例如pH来消化全长抗体以便以限制性方式产生F(ab’)2即可，并且示例为胃蛋白酶，无花果酶等。

“Fcγ受体”

Fcγ受体是指能够与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，并且指由Fcγ受体基因编码的蛋白质家族的基本上任何成员。在人类中，该家族包括含有同工型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；含有同工型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；含有同工型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同工型或同种异型，但不限于此。FcγR可以是任何生物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同工型或同种异型，但不限于此。

这种Fcγ受体的优选实例包括人FcγI(CD64)、FcγIIA(CD32)、FcγIIB(CD32)、FcγIIIA(CD16)和/或FcγIIIB(CD16)。FcγI的氨基酸序列如RefSeq注册号NP_000557.1所示，FcγIIA的氨基酸序列如RefSeq注册号AAH20823.1所示，FcγIIB的氨基酸序列如RefSeq注册号AAI46679.1所示，FcγIIIA的氨基酸序列如RefSeq注册号AAH33678.1所示，以及FcγIIIB的氨基酸序列如RefSeq注册号AAI28563.1所示。Fcγ受体在IgG1、IgG2、IgG3和IgG4单克隆抗体的Fc区中是否具有结合活性可以通过例如上述FACS和ELISA形式以及通过ALPHA筛选(放大发光邻近均相测定)以及利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE方法来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)。

此外，术语“Fc配体”或“效应配体”是指源自任何生物体的分子，优选多肽，其与抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物。Fc配体与Fc的结合优选诱导一种或多种效应子功能。Fc配体包括Fc受体、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G和病毒FcγR，但不限于此。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)(Davis等人，(2002)Immunological Reviews 190，123-136)，它们是与FcγR同源的Fc受体家族。Fc配体还可以包括未发现的与Fc结合的分子。

与Fcγ受体的结合活性

Fc区与FcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA和/或FcγIIIB中任一种的Fcγ受体的结合活性是否降低可以通过例如上述FACS和ELISA形式以及通过ALPHA筛选(放大发光邻近均相测定)以及利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE方法来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)。

ALPHA筛选通过ALPHA技术基于下述原理使用两种珠进行：供体珠和受体珠。仅当与供体珠结合的分子与与受体珠结合的分子生物学相互作用并且两个珠紧密接近时，才可检测到发光信号。受激光激发的供体珠中的光敏剂将周围的氧转化为激发的单线态氧。单线态氧在供体珠周围扩散，并且当它到达邻近的受体珠时，会在珠内部引起化学发光反应，最终发光。当与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子不相互作用时，化学发光反应不会发生，这是因为供体珠产生的单线态氧没有到达受体珠。

当一种用于观察相互作用的物质(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，并从传感器芯片的背面照射光线使其在金薄膜和玻璃之间的界面处发生全反射时，在反射光的一部分中形成反射强度(SPR信号)降低的部分。当用于观察相互作用的其他物质(分析物)注入传感器芯片表面上并且配体与分析物结合时，固定的配体分子的质量增加并且传感器芯片表面上溶剂的折射率发生变化。折射率的这种变化导致SPR信号的位置偏移(相反，解离将信号移回原始位置)。Biacore***将上述偏移量即传感器芯片表面上的质量变化作为纵轴，并且将质量随时间的变化展示为测量数据(传感图)。动力学：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由传感图曲线获得，并且亲和力(KD)由这些常数的比率获得。抑制测定也优选用于BIACORE方法中。抑制测定的实例描述于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010中。

在本文中，“Fc受体结合活性降低”是指，例如，基于上述分析方法，相比于对照多肽复合物的竞争活性，测试多肽复合物的竞争活性为50％或更小，优选45％或更小，40％或更小、35％或更小、30％或更小、20％或更小、或15％或更小，并且特别优选10％或更小、9％或更小、8％或更小、7％或更小、6％或更小、5％或更小、4％或更小、3％或更小、2％或更小、或1％或更小。

包含单克隆IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc区的抗原结合分子可以适当地用作对照抗原结合分子。Fc区结构显示于SEQ ID NO：66(A添加到RefSeq登录号AAC82527.1的N末端)、SEQ ID NO：67(A添加到RefSeq登录号AAB59393.1的N末端)、SEQ ID NO：68(A添加到RefSeq登录号CAA27268.1的N末端)和SEQ ID NO：69(A添加到RefSeq登录号AAB59394.1的N末端)。此外，当包含特定同种型抗体的Fc区突变体的抗原结合分子用作测试物质时，使用包含相同特定同种型的Fc区的抗原结合分子作为对照，评估突变体的突变对Fc受体结合活性的影响。如上所述，适当地制备包含已确认Fc受体结合活性降低的Fc区突变体的抗原结合分子。

已知根据EU编号具有氨基酸231A-238S缺失的突变体(WO2009/011941)，以及突变体诸如C226S、C229S、P238S、(C220S)(J.Rheumatol(2007)34，11)；C226S和C229S(Hum.Antibod.Hybridomas(1990)1(1)，47-54)；和C226S，C229S，E233P，L234V，和L235A(Blood(2007)109，1185-1192)是此类突变体的示例。

即，优选的实例是具有Fc区的抗原结合分子，其中在构成特定同种型抗体的Fc区的氨基酸中，根据EU编号在以下任一位置处的氨基酸被置换：220，226，229，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，264，265，266，267，269，270，295，296，297，298，299，300，325，327，328，329，330，331或332。Fc区所来源的抗体的同种型没有特别限制，并且可以适当使用源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区，优选源自IgG1抗体的Fc区。

本文描述的抗原结合分子的突变体Fc区可以具有调节由例如两种类型的重链可变区(第一重链和第二重链)和两种类型的轻链可变区(第一轻链和第二轻链)组成的双特异性抗体的关联的突变。

为了有效产生双特异性抗体，可以包括突变，该突变通过置换IgG H链的CH3区中的氨基酸，优先分泌不同的IgG组合用于H链。具体而言，这是通过以下而进行的方法：将存在于H链之一的CH3区中的氨基酸侧链替换为较大的侧链(杵(knob)；凸起)，并且将存在于其他H链的CH3区中的氨基酸侧链替换为较小的侧链(臼(hole)；空隙)，从而促进异源H链的形成，并通过允许将杵放置在臼中来抑制同源H链的形成。

此外，在本文所述的抗原结合分子的突变体Fc结构域中，可以在界面处引入氨基酸残基的突变，以使形成界面的两个或更多个氨基酸残基具有相同的电荷，从而使得原始多肽之间的关联被抑制。

例如，在含有2个或多个重链CH3区的抗原结合分子中，根据EU编号选自以下(1)至(3)中所示的氨基酸残基组的第一重链CH3区的1至3组氨基酸残基可能具有同种电荷。

(i)356和439

(ii)357和370

(iii)399和409

关于双特异性抗体，上述“第一重链”是形成抗体的两条H链之一的H链，并且第二H链是指不同于第一H链的另一条H链。即，两个H链中的一个可以任意指定为第一H链，并且另一个可以指定为第二H链。

“分离的”抗体是从其原始环境组分中分离出来的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)测定抗体，并纯化至大于95％或99％的纯度。例如，参见Flatman等人，J.Chromatogr。对于用于评估抗体纯度方法的综述，参见B 848：79-87(2007)。

“分离的”核酸是指从其原始环境组分中分离出来的核酸分子。分离的核酸包含包含在细胞内的核酸分子，其中该细胞通常含有核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外，或存在于染色体上与染色体上的原始位置不同的位置处。

“编码抗FGFR3 S249C突变体抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，并且包括一个载体或不同载体上的核酸分子，以及存在于宿主细胞的一个或多个位置处的核酸分子。

本说明书中的术语“单克隆抗体”是指从基本上一致的抗体群体中获得的抗体。也就是说，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的突变体抗体之外(例如，含有天然存在的突变的突变体抗体，或在单克隆抗体制剂生产过程中出现的突变体抗体。此类突变体通常以少量存在)。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过各种方法制备，例如杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法、使用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，但是不限于此。本文描述了用于产生单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。

“裸抗体”是指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

“天然抗体”是指具有各种天然存在结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键结合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N末端到C末端，每条重链都具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。同样，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。

“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”

在本文中，“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指导入了外源核酸的细胞(包括这些细胞的后代)。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和源自这些细胞的后代，而不考虑传代的次数。后代不必与亲本细胞的核酸含量完全相同，并且可以具有突变。具有用于筛选或选择原始转化细胞的相同功能或生物活性的突变后代也包括在本文中。

“载体”

本说明书中的术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入到已引入载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体可以导致与其可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中也称为“表达载体”。可以通过使用病毒的方法或电穿孔方法将表达载体引入宿主细胞，但表达载体的引入不限于体外引入，也可以直接引入活体内。

“嵌合抗原受体(CAR)”

本说明书中的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指设计成以不依赖于人白细胞抗原的方式结合细胞表面抗原的抗原受体。通过表达嵌合抗原受体(CAR)来基因改变T细胞以靶向肿瘤细胞上表达的抗原是治疗具有恶性肿瘤的患者的一种方法。例如，参见Brentjens等人，2010，Molecular Therapy，18：4，666-668；Morgan等人，2010，Molecular Therapy，2010年2月23日在线公开，1-9页；和Till等人，2008，Blood，112：2261-2271。最常见的是，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。CAR的细胞外结合结构域源自鼠单克隆抗体或人源化单克隆抗体。例如，参见专利号5840837和专利号6293194。

“共刺激配体”

本说明书的“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其可以特异性结合T细胞上的同源(cognate)共刺激分子，并且可以从而提供介导T细胞反应的信号，其中所述信号除了例如由负载肽的MHC分子与TCR/CD3复合物结合产生的初级信号之外，包括但不限于生长、激活、分化和此类信号。共刺激配体包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞内粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、磷酸毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、与Toll配体受体结合的激动剂或抗体，和特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体还包括但不限于特异性结合T细胞上存在的共刺激分子的抗体，例如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体。

“共刺激分子”

“共刺激分子”是T细胞上的同源结合配偶体，其特异性结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。

“共刺激信号”

如本文所用，“共刺激信号”是与诸如TCR/CD3连接的初级信号组合的诱导T细胞增殖和/或关键分子上调或下调的分子。

与药物有关的定义

“药物制剂”

药物/药剂(例如，药物制剂)是指制剂，其形式使得其中所含活性成分的生物活性可以发挥其作用，并且其不包括对施用制剂的受试者具有不可接受毒性的附加成分。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物是但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗、马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物例如猴)、兔以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“药学上可接受的载体”

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指除药物制剂中的活性成分外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

“治疗(treatment)”(及其语法派生词，例如“治疗(treating)”、“治疗(totreat)”等)

如本文所用，术语“治疗”(及其语法派生词，例如“治疗(treating)”、“治疗(totreat)”等)是旨在改变被治疗个体的自然过程的临床干预，并且可以用于预防，也可以在临床状况的过程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发作或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学影响、预防转移、降低进展速度、恢复或减轻疾病状态，和改进或改善预后。在一些实施方案中，本公开的抗体用于延迟疾病的发作或减缓疾病的进展。

“治疗有效量”

本说明书中的“治疗有效量”是指用于治疗或预防哺乳动物的疾病或病症的治疗剂的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物减少癌细胞的数量；减小原发肿瘤的大小；抑制癌细胞浸润到周围器官中(即导致一些延迟，优选暂停)；抑制肿瘤转移(即导致一些延迟，优选暂停)；导致肿瘤生长的一些抑制；或导致一种或多种疾病相关症状的缓解，或两者兼而有之。在某种程度上，药物可以防止增殖或杀死现有的癌细胞，或两者兼而有之，并且是有丝***的(mitotic)或细胞毒性的，或两者兼而有之。在癌症治疗中，体内功效通过评估选自由例如存活时间、进展时间(TTP)、反应率(RR)、反应期和生活质量组成的组的至少一个指标来测量。

“癌症”和“癌性的”

如本文所用，“癌症”和“癌性的”是指或描述通常以不受控制的细胞增殖为特征的哺乳动物生理状况。该定义包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”是指非侵袭性或转移性或被归类为0、I或II期癌症的癌症。癌症的示例包括癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜炎、腺癌、黑色素瘤和白血病或淋巴细胞恶性肿瘤，但不限于此。这种癌症的更具体的示例包括鳞状细胞癌(例如，肺鳞状细胞癌或HPV(人***瘤病毒)阳性的头颈部鳞状细胞癌)、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、包括肺腺癌和肺鳞状细胞癌的肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃(gastric)癌/胃(stomach)癌、包括消化***癌的胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾(kidney)癌或肾(renal)癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤、头颈癌和多发性骨髓瘤。

术语“包装插页”用于指治疗产品的使用说明，其通常包含在治疗产品的商业包装中，并且包括有关适应症、剂型、剂量、施用方法、伴随治疗、禁忌症和/或警告的信息。

II.组合物和方法

本公开内容涵盖包含药物组合物的组合物，其包含抗FGFR3 S249C突变体抗体和包含编码抗FGFR3 S249C突变体抗体的序列的多核苷酸中的一种或两种。如本文所用的组合物包括一种或若干种与FGFR3 S249C突变体结合的抗体和/或一种或若干种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码一种或若干种与FGFR3 S249C突变体结合的抗体的序列。这些组合物还可以包括合适的载体，例如药学上可接受的赋形剂，例如缓冲剂。这些在本领域中是众所周知的。

本公开还涵盖分离的抗体和多核苷酸的实施方案。还涵盖基本上纯的抗体和多核苷酸的实施方案。

本公开内容还涵盖使用抗FGFR3 S249C突变体抗体(如本文所述或本领域已知)治疗疾病的方法。

组合物

本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体优选是单克隆的。本公开范围内还包括本文提供的抗FGFR3 S249C突变体抗体的Fab、Fab′、Fab′-SH和F(ab′)2片段。这些抗体片段可以通过常规方法例如酶消化或通过重组技术制备。这种抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段可用于如下所述的诊断和治疗目的。

单克隆抗体是指从基本上相同类型的抗体的群体中获得的抗体，即构成群体的个体抗体是相同的，除了可能存在的少量天然存在的突变体。因此，修饰语“单克隆”暗示抗体的特征，而不是单独抗体的混合物。

本公开的抗-FGFR3 S249C突变体单克隆抗体可以使用由Kohler等人，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法或重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备。

抗体生产方法

杂交瘤方法

免疫

在杂交瘤方法中，对小鼠或其他合适的宿主动物(如仓鼠)进行免疫，以诱导产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通常，通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射FGFR3 S249C突变体和佐剂在动物体内产生针对FGFR3 S249C突变体的抗体。可以使用本领域已知的方法制备FGFR3 S249C突变体。一些方法在本文中进一步描述。例如，人和小鼠FGFR3 S249C突变体的重组生产如下所述。在一个实施方案中，用融合到免疫球蛋白重链的Fc位点的FGFR3 S249C突变体对动物进行免疫。在优选的实施方案中，用FGFR3 S249C突变体-IgG1融合蛋白免疫动物。通常，使用单磷酸化脂质A(MPL)/海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dicrynomycolate)(TDM)(Ribi Immunochem.Research，Inc.，Hamilton，MT)对动物进行针对FGFR3 S249C突变体或衍生物的免疫原性缀合物的免疫，并将溶液皮下注射在多个部位。两周后，将动物加强免疫。7-14天后，从动物身上采集血液并检测血清的抗体滴度。动物被进一步加强免疫直到抗体滴度达到平台期。

备选方法可以是体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，pp.59-103(Academic Press，1986))。或者，用编码FGFR3突变体的cDNA(其中表达控制区被可操作地连接)免疫动物的DNA免疫方法也是已知的。DNA免疫不需要纯化免疫原。

杂交瘤

将由此制备的杂交瘤接种并在合适的培养基中生长，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基通常会含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质会阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞

优选的骨髓瘤细胞是有效融合，支持所选的抗体产生细胞稳定、高水平产生抗体，并且对培养基如HAT培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤谱系细胞，例如，可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的Salk Institute Cell Distribution Center获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，以及可从美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的源自SP-2或X63-Ag8-653细胞的那些。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已公开用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987))。

或者，编码抗体可变区的cDNA可以直接从免疫动物的抗体产生细胞中获得。例如，对来自免疫兔的B细胞进行有限稀释并将它们与支持细胞一起培养的方法是已知的。可以预先比较培养基中产生的抗体的特异性，并通过诸如PCR的方法从产生靶标抗体的细胞中回收编码抗体可变区的cDNA。通过将回收的cDNA掺入到适当的表达***中，可以在不经过杂交瘤的情况下获得单克隆抗体。

测定产生的单克隆抗体

测定杂交瘤生长的培养基中针对FGFR3 S249C突变体的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外结合测定如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。

测量单克隆抗体结合亲和力的方法

单克隆抗体的结合亲和力通过例如Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析方法来确定。

杂交瘤增殖

一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤，可以通过有限稀释将克隆亚克隆并通过标准方法增殖(Goding，Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。适用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤可以在动物体内作为腹水肿瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法(例如蛋白A-SEPHAROSE、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)从培养基、腹水或血清中适当分离。

筛选抗FGFR3 S249C突变体抗体克隆

本公开的抗FGFR3 S249C突变体抗体可以使用组合文库来鉴定以筛选具有所需活性的合成抗体克隆。原则上，合成抗体克隆是通过筛选具有展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择的。此类噬菌体文库通过亲和层析针对所需抗原进行分选。表达能够与所需抗原结合的Fv片段的克隆被吸附到抗原上，从而将它们与文库的非结合克隆分离。然后可以从抗原中洗脱结合的克隆，并通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本公开的任何抗FGFR3 S249C突变体抗体可以通过以下获得：设计合适的抗原筛选程序用于选择目的噬菌体克隆，然后使用来自目的噬菌体克隆的Fv序列和描述于Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的适当的恒定区(Fc)序列构建全长抗FGFR3 S249C突变体抗体克隆。

Fv克隆

抗体的抗原结合结构域由约110个氨基酸的两个可变(V)区(轻链(VL)和重链(VH))形成。这两者都具有三个高变环或互补链决定区(CDR)。如Winter等人，Ann.Rev.Inmunol.，12：433-455(1994)中所述，可变区可以作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短且柔性的肽共价连接)或作为Fab片段(其中它们各自融合到恒定结构域并以非共价方式相互作用)在噬菌体上功能性地展示。如本文所用，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。

噬菌体文库中VH和VL基因的随机重组

VH和VL基因库可以通过聚合酶链式反应(PCR)分离和克隆，在噬菌体文库中随机重组，并筛选抗原结合克隆，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)等中所述。来自免疫源的文库不需要杂交瘤构建并提供针对免疫原的高亲和力抗体。或者，原始(naive)库可被克隆，以在无任何免疫的情况下提供针对广泛非自身抗原和自身抗原的人抗体单一来源，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)等中所述。最后，还可以通过以下来合成制备原始文库：从干细胞克隆未重排的V基因区段，利用具有随机序列的PCR引物编码高变的CDR3区，并在体外完成重排，如Hoogenboom和Winter，J.等人Mol.Biol.227：381-388(1992)中所述。

丝状噬菌体

丝状噬菌体通过与次要外壳蛋白pIII融合来展示抗体片段。这些抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH和VL结构域通过柔性多肽间隔区(spacer)连接在相同的多肽链上，例如如Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中所述，或展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合并且另一条链分泌到细菌宿主细胞的周质中，其中Fab外壳蛋白结构的组装通过置换一些野生型外壳蛋白在噬菌体表面上展示，如Hoogenboom等人，Nucl.Acids.Res.，19：4133-4137(1991)中所述。

编码抗体基因片段的核酸

通常，编码抗体基因片段的核酸获自从人或动物收集的免疫细胞。如果需要偏向于抗FGFR3 S249C突变体克隆的文库，则用FGFR3 S249C突变体免疫个体以产生抗体反应，并收集脾细胞和/或循环B细胞(它们是其他外周血淋巴细胞(PBL))用于文库构建。抗FGFR3S249C突变体抗体

进一步富集抗FGFR3 S249C突变体反应性细胞群

可以通过使用适当的筛选技术以分离表达FGFR3 S249C突变体特异性膜结合抗体的B细胞来实现进一步富集抗FGFR3 S249C突变体反应性细胞群，例如通过使用FGFR3S249C突变体亲和层析的细胞分离或通过荧光染料标记，将细胞吸附到FGFR3 S249C突变体上，以及随后荧光激活细胞分选仪(FACS)。

使用任意动物(人或非人)物种构建抗体文库

或者，利用来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其他PBL提供了可能的抗体库的更好指示，并能够使用其中FGFR3 S249C突变体不是免疫原的任何动物(人或非人)物种构建抗体文库。对于包含体外抗体基因构建体的文库，从个体收集干细胞以提供编码非重排抗体基因区段的核酸。目的免疫细胞可以获自各种动物物种例如人、小鼠、大鼠、兔类动物、狼、犬科动物、猫科动物、猪、牛、马、鸟类等。

编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸的扩增

从目的细胞中回收并扩增编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸。在重排VH和VL基因文库的情况下，如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)中所述，所需的DNA可以通过以下获得：从淋巴细胞中分离基因组DNA或mRNA，并用与重排的VH和VL基因的5’和3’末端相匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，从而制备多样化的V基因库用于表达。这些V基因可以通过编码成熟V结构域的外显子5’端的反向引物和基于J区段的正向引物从cDNA和基因组DNA中扩增，如Orlandi等人，(1989)和Ward等人，Nature，341：544-546(1979)中所述。然而，对于从cDNA扩增，反向引物可以基于Jones等人，Biotechnol.，9：88-89(1991)中所述的前导外显子，并且正向引物可以基于Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86：5728-5732(1989)中所述的恒定区。可以将简并物(degenerate)掺入引物中以最大化互补性，如Orlandi等人(1989)或Sastry等人(1989)所述。优选地，为了扩增存在于免疫细胞核酸样品中的所有可用VH和VL序列，通过使用靶向每个V基因家族的PCR引物使文库的多样性最大化，如例如Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)的方法或Orum等人，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)的方法中所述。为了将扩增的DNA克隆到表达载体中，通过使用标记引物进行进一步PCR扩增，可以将稀有限制性位点作为标记引入PCR引物的一端，如Orlandi等人(1989)中所述或如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)中所述。

合成重排V基因库的体内诱导

可以从V基因区段在体内诱导合成重排的V基因库。大多数人类VH基因区段已被克隆、测序(由Tomlinson等人，J.Mol.Biol.227：776-798(1992)报道)，并定位(map)(Matsuda等人，Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构象)用于通过编码不同序列和长度的H3环的PCR引物生成多样化的VH基因库，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381-388(1992)中所述。还可以制备VH环，其中所有的序列多样性都集中在单个长H3环上，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461(1992)中所述。人Vκ和Vλ区段已被克隆和测序(Williams和Winter，Eur.J.Immunol.，23：1456-1461(1993))并可用于产生合成的轻链库。基于VH和VL折叠范围以及L3和H3长度的合成V基因库编码具有相当大的结构多样性的抗体。在扩增编码DNA的V基因后，可以根据Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381-388(1992)的方法在体外重排种系V基因区段。

抗体片段库的构建

可以通过以若干种方式将VH和VL基因库组合在一起来构建抗体片段库。每个库用不同的载体制备，并且载体可以在体外制备，例如如Hogrefe等人，Gene，128：119-126(1993)中所述，或在体内通过组合感染制备，例如通过Waterhouse，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中描述的loxP***等。这种体内重组技术利用双链Fab片段来克服大肠杆菌转化效率所带来的文库大小限制。原始VH和VL库被单独克隆，一个克隆到噬菌粒中，另一个克隆到噬菌体载体中。然后通过含噬菌粒的细菌的噬菌体感染来组合这两个文库，使得每个细胞具有不同的组合，并且文库的大小仅受存在的细胞数量(约1012个克隆)的限制。两种载体都具有体内重组信号，使得VH和VL基因重组为单个复制子并一起包装成噬菌体病毒体。这些庞大的文库提供了许多具有良好亲和力(Kd-1约为10-8M)的不同抗体。

抗体片段库-2的构建

或者，可以将库按顺序克隆到相同的载体中，例如如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991)中所述，或通过PCR组装并然后克隆，例如如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)中所述。PCR组装还可用于将编码柔性肽间隔区的DNA与VH和VL DNA连接以形成单链Fv(scFv)库。在又另一种技术中，“细胞内PCR组装”用于通过PCR组合淋巴细胞中的VH和VL基因，然后克隆连接的基因的库，如Embleton等人，Nucl.Acids Res.，20：3831-3837(1992)等中所述。

原始文库

由原始文库(天然或合成)产生的抗体可能具有中等亲和力(Kd^-1约为10⁶至10⁷M^-1)，但通过构建并从第二文库中分离，也可以如上Winter等人(1994)中所述在体外模拟亲和力成熟。例如，在Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)的方法中，或在Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：3576-3580(1992)的方法中，突变可以通过利用易错聚合酶在体外随机引入(Leung等人，Technique，1：11-15(1989)中所报道的)。此外，通过随机突变一个或多个CDR，例如，在所选的单个Fv克隆中，亲和力成熟可以通过使用具有延伸至目的CDR的随机序列的引物的PCR并筛选具有更高亲和力的克隆来实现。WO 9607754(1996年3月14日公开)描述了如何在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导突变以产生轻链基因的文库。另一种有效的技术包括将通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域与从未免疫供体获得的天然存在的V结构域变体库重组，以及通过多链改组(shuffling)筛选更高的亲和力，如Marks等人，Biotechnol.10：779-783(1992)中所述。该技术允许产生亲和力在10-9M范围内的抗体和抗体片段。

FGFR3 S249C突变体的核酸和氨基酸序列

FGFR3 S249C突变体的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。可以使用FGFR3 S249C突变体的所需区域的氨基酸序列来设计编码FGFR3 S249C突变体的核酸序列。众所周知，FGFR3有两种主要的剪接同工型，即FGFR3 IIIb和FGFR3 IIIc。FGFR3序列是本领域公知的并且可以包括UniProKB/Swiss-Prot登录号P22607(FGFR3 IIIc)或P22607_2(FGFR3 IIIb)的序列。FGFR3突变已被鉴定并且在本领域中是众所周知的，并且包括以下突变(关于UniProKB/Swiss-Prot登录号P22607(FGFR3 IIIc)或P22607_2(FGFR3 IIIb)中所示的序列)：

编码FGFR3 S249C突变体的核酸

编码FGFR3 S249C突变体的核酸可以通过本领域已知的各种方法制备。这些方法包括在Engels等人，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28：716-734(1989)中描述的任何方法，包括但不限于使用例如三酯、亚磷酸酯、亚磷酰胺和H-膦酸酯方法的化学合成方法。在一个实施方案中，表达宿主细胞的优选密码子用于设计FGFR3 S249C突变体编码DNA。或者，可以从基因组或cDNA文库中分离编码FGFR3 S249C突变体的DNA。

与表达载体(例如编码FGFR3 S249C突变体的DNA分子的质粒)的表达控制序列连接

在构建编码FGFR3 S249C突变体的DNA分子之后，该DNA分子与表达载体如质粒的表达控制序列可操作地连接，并且该控制序列与用载体转化的宿主细胞结合。通常，质粒载体具有从与宿主细胞相容的物种诱导的复制和控制序列。该载体通常具有复制位点以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。适用于在原核和真核宿主细胞中表达的载体是本领域已知的，其中一些在本文中描述。可以使用来源于原核生物如酵母或多细胞生物如哺乳动物的细胞。

在一些情况下，编码FGFR3 S249C突变体的DNA被宿主细胞可操作地连接到分泌前导序列，该分泌前导序列导致表达产物分泌到培养基中。分泌前导序列的示例包括stII、ecotin、lamB、疱疹GD、lpp、碱性磷酸酶、转化酶和α因子。也适用于此处的是蛋白A的36个氨基酸前导序列(Abrahmsen等人，EMBO J.，4：3901(1985))。

宿主细胞

用本发明的上述表达或克隆载体转染宿主细胞，并优选在经过修饰以适合于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的一般培养溶液中进行转化和培养。

转染

转染是指宿主细胞摄取表达载体，其中对于该宿主细胞是否实际表达任意编码序列是未知的。普通技术人员已知许多转染方法，例如CaPO₄沉降和电穿孔。通常，当宿主细胞内出现载体作用的迹象时，则成功的转染是必然的。

转化

转化意味着将DNA引入生物体中，使其可以作为染色体外成分或染色体整合体进行复制。根据所使用的宿主细胞，使用适合细胞的基本技术进行转化。转化方法是本领域已知的，其中一些在本文中进一步描述。

用于产生FGFR3 S249C突变体的原核宿主细胞

用于产生FGFR3 S249C突变体的原核宿主细胞通常可以如上述Sambrook等中所述进行培养。

用于产生FGFR3 S249C突变体的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。培养基在本领域中是众所周知的并且它们中的一些在本文中进行了描述。

本公开中提及的宿主细胞不仅包括宿主动物中的细胞，还包括体外培养物中的细胞。

FGFR3 S249C突变体的纯化

FGFR3 S249C突变体的纯化使用本领域限定的方法进行。其中一些在本文中进行了描述。

噬菌体展示克隆的亲和层析分离

为了用于噬菌体展示克隆的亲和层析分离，纯化的FGFR3 S249C突变体可以附接到合适的基质上，例如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、羟基甲基丙烯酸凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物，尼龙，以及中性和离子载体。FGFR3 S249C突变体蛋白与底物的附接可以通过Methods in Enzymology，Vol.44(1976)中描述的方法完成。广泛使用的将蛋白质配体附接到多糖基质(如琼脂糖、葡聚糖或纤维素)的技术包括通过卤化氰(halogenated cyan)激活载体，然后用脂肪族伯胺或芳香族伯胺将肽配体与激活底物偶联。

或者，FGFR3 S249C突变体可用于包被吸收板的孔，在附接于吸收板的宿主细胞上表达或用于细胞分选，或与生物素缀合以被链霉亲和素包被的珠捕获，或用于任何其他用于淘选噬菌体展示文库的现有技术方法。

噬菌体文库样品在适合于将至少一部分噬菌体颗粒与吸附剂结合的条件下与固定的FGFR3 S249C突变体接触。通常，选择包括pH、离子强度、温度等在内的条件来模拟生理条件。洗涤与固相结合的噬菌体，然后用例如如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)中所述的酸，或用例如如Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中所述的碱，或通过类似于例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争方法的技术的S249C突变体FGFR3抗原竞争来洗脱。噬菌体可以在第一次选择中浓缩20到1000倍。此外，浓缩的噬菌体可以在细菌培养物中生长用于进一步选择。

噬菌体选择

选择的效率取决于许多因素，包括洗涤过程中的解离动力学以及单个噬菌体上的多个抗体片段是否可以同时与抗原关联。通过使用短时间洗涤、多价噬菌体展示和固相抗原的高包被密度，可以保留具有初级解离常数(和弱结合亲和力)的抗体。高密度不仅通过多价相互作用稳定噬菌体，而且有利于解离噬菌体的重新结合。具有慢解离动力学(和良好结合亲和力)的抗体的选择可以通过长时间洗涤和使用如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690中所述的单价噬菌体展示和通过如Marks等人，Biotechnol.，10：779-783(1992)中所述的低抗原包被密度来增强。

即使亲和力略有差异，也可以从对FGFR3 S249C突变体具有不同亲和力的噬菌体抗体中进行选择。然而，随机突变(例如，如在上述一些亲和力成熟技术中进行的)使所选抗体易于发生许多突变，并且大多数突变体与抗原结合，并且其中只有少数具有更高的亲和力。限制FGFR3 S249C突变体可以竞争性消除稀有的高亲和力噬菌体。为了保留所有更高亲和力的突变，噬菌体可以与过量的生物素化FGFR3 S249C突变体一起孵育，但以低于FGFR3S249C突变体的目标摩尔亲和力常数的摩尔浓度与生物素化FGFR3 S249C突变体一起孵育。然后可以通过涂有链霉亲和素的顺磁珠捕获高亲和力结合噬菌体。这种“平衡捕获”能够选择具有灵敏度的抗体，该灵敏度允许基于结合亲和力从具有低亲和力的过量噬菌体中分离出亲和力略高两倍的突变体克隆。也可以控制用于洗涤与固相结合的噬菌体的条件，以基于解离常数进行鉴定。

在重组宿主细胞中合成单克隆抗体/Fv克隆

使用常规方法(例如，通过使用配置为特异性扩增重链和轻链或噬菌体DNA模板的寡核苷酸引物，其中这些模板编码杂交瘤中的目的区域)立即分离编码本公开的源自杂交瘤的单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA，并测序。分离后，将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，这些细胞除了在这种情况下不会产生抗体蛋白)中，以便在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于细菌中抗体编码DNA重组表达的综述文章包括Skerra等人，Curr.Opinionin Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。

Fv克隆的合成

编码本公开的Fv克隆的DNA可以与编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如，合适的DNA序列可以从上述Kabat等获得)组合，以形成编码全长或部分重链和/或轻链的克隆。应当理解，任何同种型的恒定区，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，都可以用于此。这种恒定区可以从任何人或动物物种中获得。获自一种动物物种(例如人)的可变结构域DNA并且然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂交”全长重链和/或轻链编码序列的Fv克隆包括在本文使用的“嵌合”和“杂交”抗体的定义中。在优选的实施方案中，将获自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成所有人、全长或部分重链和/或轻链的编码序列。

“嵌合”或“杂交”抗体的合成

此外，编码源自本发明杂交瘤的抗FGFR3 S249C突变体抗体的DNA可以通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列置换源自杂交瘤克隆的同源小鼠序列来修饰(通过例如Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81：6851(1984)的方法)。编码源自杂交瘤或Fv克隆的抗体或抗体片段的DNA可以通过将全部或部分非免疫球蛋白多肽编码序列共价结合到免疫球蛋白编码序列来进一步修饰。因此，“嵌合”或“杂合”抗体被制备以便对源自本公开的Fv克隆或杂交瘤克隆的抗体具有结合特异性。

在优选的实施方案中，本发明的源自杂交瘤的抗FGFR3 S249C突变体抗体中可变区的氨基酸序列可以是例如以下重链(VH)和轻链(VL)的组合。

每个VH和VL的氨基酸序列是构成兔抗体可变结构域的氨基酸序列。因此，当人抗体恒定结构域缀合时，可以构建兔-人嵌合抗体。作为人医学实践中球蛋白的恒定结构域，例如人重链恒定区(F760 mnN17；SEQ ID NO：11)和人轻链恒定区(k0MTC；SEQ ID NO：12)是已知的。

抗体片段

本公开内容包括抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段比使用全抗体更有优势。较小尺寸的片段可以提供更快的清除并改善对实体瘤的可及。

抗体片段的生产

已经开发了多种技术来产生抗体片段。传统上，这些片段是通过全抗体的蛋白水解消化来诱导的(例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24：107-117(1992)和Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。例如，Fab、Fv和ScFv抗体片段都在大肠杆菌中表达和分泌，有利于这些片段的大规模生产。抗体片段可以从上述抗体噬菌体文库中分离。或者，可以直接从大肠杆菌中回收Fab’-SH片段，并且可以通过化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。

另一种方法允许直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。具有增加的体内半衰期的含有拯救受体结合表位残基的Fab和F(ab’)2片段描述于美国专利号5,869,046。其他用于产生抗体片段的方法对本领域技术人员来说应该是显而易见的。在另一个实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。Fv和sFv是唯一具有完整结合位点但缺少恒定区的物种；因此，它们适用于减少在体内使用过程中的非特异性结合。sFv融合蛋白可以在sFv的氨基端或羧基端构建，以获得效应蛋白的融合。参见上述Antibody Engineering，Borrebaeck编辑。抗体片段也可以是，例如，如美国专利号5,641,870中所述的“线性抗体”。这样的线性片段可以是单特异性的或双特异性的。

通过非人抗体的人源化生产人源化抗体

本公开内容包括人源化抗体。用于人源化非人抗体的各种方法通常是众所周知的。例如，人源化抗体具有被引入其中的一个或多个非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，通常获自“输入”可变结构域。人源化基本上可以使用Winter和Collaborators的方法通过置换人抗体的相关高变区序列来进行(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)，Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)，Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代(美国专利号4,816,567)。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基，并且在某些情况下，一些FR残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基取代。

例如，在一些实施方案中，本公开的源自杂交瘤的抗FGFR3 S249C突变体抗体中可变区的氨基酸序列可以是例如以下重链(VH)和轻链(VL)的组合：

此外，以下氨基酸序列被鉴定为每个VH和VL的高变区(HVR)。

因此，可以通过选择上述HVR 1-3中的一个或多个并将它们转移到人FR中来构建人源化抗体。在优选实施例中，待转移的HVR是VH和VL的HVR 1-3中的所有。用于获得人源化抗体的人FR的氨基酸序列可以适当地选自已知的氨基酸序列。或者，可以从任何人抗体文库中获得新的FR。在一个实施方案中，当将上述HVR氨基酸序列中的每一个作为CDR移植到人FR中以构建人源化抗体时，可以举例说明与以下FR氨基酸序列的组合：

抗原性降低的人源化抗体

为了降低抗原性，选择用于生产人源化抗体的轻链和重链人可变结构域两者非常重要。“最佳拟合方法”针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。接下来，最接近啮齿动物的人序列被接受为人源化抗体的人框架区(Sims等人，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol..，196：901(1987))。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组中所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于若干种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.，151：2623(1993))。

具有高亲和力和其他有利生物学特性的人源化抗体

此外，重要的是使抗体人源化，同时保持高抗原亲和力和其他有利的生物学特性。为实现这一目的，通过分析亲本序列和各种概念性人源化产物的步骤，使用亲本和人源化序列的三维模型的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员所熟知的。说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的假定三维构象结构的计算机程序可供购买。这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方式，可以从受体和输入序列中选择FR残基并进行组合，从而实现所需的抗体特性，例如对靶抗原的增加的亲和力。一般而言，高变区残基直接且最显著地影响抗原结合活性。

人抗体的产生

本公开的人抗FGFR3 S249C突变体抗体可以通过将选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列与如上所述的已知人恒定结构域序列结合来构建。或者，本公开的人单克隆抗FGFR3 S249C突变体抗体可以通过杂交瘤方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异质骨髓瘤细胞系描述于例如Kozbor，J.，Immunol.133，3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991)中。

转基因动物(例如小鼠)的产生

现在有可能产生通过免疫能够产生完整人抗体库而不产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因序列转移到这种种系突变小鼠中会在抗原攻击时产生人抗体。例如，参见Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 90，2551-255(1993)；Jakobovits等人，Nature 362，255-258(1993)。

基因改组

如果人抗体与起始非人(例如啮齿动物)抗体具有相似的亲和力和特性，则基因改组也可用于从非人(例如啮齿动物)抗体中获得人抗体。通过这种方法，也称为“表位印记”，将通过上述噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链可变区基因或轻链可变区基因替换为人V结构域基因库，以创建非人/人链scFv或Fab嵌合体群体。通过用抗原选择，非人链/人链嵌合scFv或Fab被分离，其中人链恢复了通过去除初级噬菌体展示克隆中相应的非人链而破坏的抗原结合位点，即，表位控制(印记)人链配偶体的选择。重复此步骤以替换剩余的非人链产生人抗体(参见1993年4月1日公开的PCT专利申请WO 93/06213)。与通过传统CDR移植的非人抗体人源化不同，该技术提供了没有非人来源的FR或CDR残基的完全人抗体。

双特异性抗体

双特异性抗体是单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体，其对至少两个不同表位具有结合特异性。在这种情况下，一种结合特异性针对FGFR3 S249C突变体，并且另一种针对任何其他抗原。示例性双特异性抗体可以结合FGFR3 S249C突变体的两个不同表位。双特异性抗体还可用于定位表达FGFR3 S249C突变体的细胞中的细胞毒活性。这些抗体具有FGFR3 S249C突变体结合臂和与CD3结合以发挥T细胞依赖性细胞毒活性的臂。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。

在本公开的一些实施方案中，以下氨基酸序列可以作为用于构建FGFR3 S249C突变体结合臂的可变区结构域的CDR示例：

具有T细胞受体复合物结合活性的抗原结合结构域

如本文所用，表述“具有T细胞受体复合物结合活性的抗原结合结构域”是指T细胞受体复合物抗体的一部分，其包含与部分或整个T细胞受体复合物特异性结合并互补的区域。T细胞受体复合物可以是T细胞受体本身，也可以是与T细胞受体一起构成T细胞受体复合物的衔接子体分子。合适的衔接子是CD3。

具有T细胞受体结合活性的抗原结合结构域

如本文所用，表述“具有T细胞受体结合活性的抗原结合结构域”是指T细胞受体抗体的一部分，其包含与部分或整个T细胞受体特异性结合并互补的区域。

本公开的结构域所结合的T细胞受体部分可以是可变区或恒定区，但优选是存在于恒定区中的表位。恒定区的序列包括例如RefSeq注册号CAA26636.1的T细胞受体α链、RefSeq注册号C25777的T细胞受体β链、RefSeq注册号A26659的T细胞受体γ1链、RefSeq注册号AAB63312.1的T细胞受体γ2链和RefSeq注册号AAA61033.1的T细胞受体δ链。

具有CD3结合活性的抗原结合结构域

如本文所用，表述“具有CD3结合活性的抗原结合结构域”是指CD3抗体的一部分，其包含与CD3的一部分或全部特异性结合并互补的区域。优选地，该结构域包含抗CD3抗体的轻链可变区(VL)和抗CD3抗体的重链可变区(VH)。这种结构域的优选实例是“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv2)”、“Fab”或“F(ab’))2”等。

根据本公开的具有CD3结合活性的抗原结合结构域可以结合存在于构成人CD3的γ-链、δ-链或ε-链序列中的任何表位。在本公开中，优选使用包含抗CD3抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的结构域，其与存在于人CD3复合物的ε链的细胞外区中存在的表位结合。作为这样的结构域，除了实施例中描述的抗CD3抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)之外，还优选使用包含OKT3抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(1980)77，4914-4917)或各种已知CD3抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的CD3结合域。此外，可以适当地使用源自通过上述方法用构成人CD3的γ链、δ链或ε链对所需动物进行免疫而获得的具有所需特性的抗CD3抗体的抗原结合结构域。适当的人源化抗体或人抗体可以适当地用作抗CD3抗体，该抗CD3抗体是具有CD3结合活性的抗原结合结构域来源的。关于构成CD3的γ链、δ链或ε链的结构，多核苷酸序列描述于RefSeq注册号NM_000073.2、RefSeq注册号NM_000732.4和RefSeq注册号NM_000733.3中，以及多核苷酸序列描述于RefSeq注册号NP_000064.1、RefSeq注册号NP_000723.1和RefSeq注册号NP_000724.1中。

本公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以结合相同的表位。这里，相同的表位可以存在于由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质中。或者，本公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以结合不同的表位。这里，不同的表位可以存在于由SEQ IDNO：3中所示的氨基酸序列组成的蛋白质中。

在本公开的一个实施方案中，以下氨基酸序列可以作为用于构建具有CD3结合活性的抗原结合结构域的CDR氨基酸示例：

产生双特异性抗体的方法

产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。双特异性抗体的传统重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein等人，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四价体杂交瘤)产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(其通常通过亲和层析步骤进行)相当麻烦且产物收率低。类似的方法公开于1993年5月13日公开的WO 93/08829，Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3459(1991)中。

另一种更优选的方法

另一种更优选的方法是将具有所需结合特异性(抗原-抗体结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。上述融合物(fusion)优选是与包含至少一部分铰链以及CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域的融合物。期望的是，含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要的话)免疫球蛋白轻链的DNA***单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在通过构建体中使用的三个多肽链的不相等比例提供最佳产量的实施方案中，这在调整三个多肽片段的相互比例方面提供了很大的灵活性。然而，当以相等比例表达至少两条多肽链导致高产量时，或者当比例不特别重要时，可以将两条或全部三条多肽链的编码序列***到一个表达载体中。

在该方法的优选实施方案中，双特异性抗体由具有第一结合特异性的一个臂的杂合免疫球蛋白重链和另一臂的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。事实证明，这种不对称结构更容易从不需要的免疫球蛋白链组合中分离出所需的双特异性化合物，因为当双特异性分子只有一半具有免疫球蛋白轻链时提供了一种简单的分离方法。这种方法公开于WO94/04690中。有关产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh等人，Methods in Enzymology，121：210(1986)。

其他方法

根据其他方法，可以操纵抗体分子对之间的界面以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比。合适的界面包括抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面处产生与大侧链相同或相似大小的互补“空腔”。这提供了一种机制，用于提高异二聚体相对于其他不需要的终产物例如同源二聚体的产量。

交联抗体或“异源缀合抗体”及其制造方法

双特异性抗体包括交联抗体和“异源缀合抗体”。例如，异源缀合物的一种抗体可以结合抗生物素蛋白，而另一种抗体可以结合生物素。已提出此类抗体用于例如将免疫***细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4676980)和治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373和欧洲专利号03089)。可以通过合适的交联方法产生异源缀合抗体。合适的交联剂在本领域中是众所周知的并且描述于美国专利号4676980等中，以及多种交联方法。

从抗体片段生产嵌合抗原受体的技术

嵌合抗原受体

本公开的CAR可以被工程化以包括具有与T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的细胞内信号传导结构域融合的抗原结合结构域的细胞外结构域。当在T细胞中表达时，本公开的CAR可以基于抗原结合特异性重新诱导抗原结合。本公开的抗原是FGFR3 S249C突变体，并且本公开的CAR包括任何抗原结合结构域，其中，在本公开的CAR与FGFR3 S249C突变体结合后，所述抗原结合结构域影响肿瘤细胞使其不能生长，促使它们死亡，或以使患者的总肿瘤负荷逐渐减少或消失的其他方式影响。抗原结合结构域优选与来自一个或多个共刺激分子和ζ链的细胞内结构域融合。抗原结合结构域优选与选自由CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域及其任意组合组成的组的一个或多个细胞内结构域融合。

跨膜结构域

关于跨膜结构域，CAR可以设计成包括与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用天然附接至CAR中的结构域之一的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而将与受体复合物的其他成员的相互作用最小化，或者也可以为此目的通过氨基酸置换来选择或改变。

跨膜结构域可以源白天然或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。在本公开中特别有用的跨膜区可以源自T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154(即，至少包括它们的跨膜区)。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，据信它主要含有疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将出现在合成跨膜结构域的每一端。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度为2-10个氨基酸)可以在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成链。甘氨酸-丝氨酸双联体是特别合适的接头。

细胞质结构域

本公开的CAR的细胞质结构域，或换言之细胞内信号传导结构域，负责激活引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性，或包括细胞因子分泌的辅助活性。因此，术语“细胞内信号转导结构域”是指传递效应子功能信号并引导细胞执行其特化功能的蛋白质的部分。通常，可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这些缩短的部分可以用来代替完整的链，只要它们传递效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域应包括足以传递效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何缩短部分。

用于本公开的CAR的细胞内信号传导结构域的优选实例包括T细胞受体(TCR)和协同作用以在抗原与受体接合后引发信号传导的共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。

众所周知，仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞激活是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR引发抗原依赖性初级激活的那些序列(初级细胞质信号传导序列)，以及以抗原非依赖性方式起作用以产生次级或共刺激信号的那些序列(次级细胞质信号传导序列)。

T细胞来源

在本公开的T细胞生长和遗传改变之前，从受试者获得T细胞来源。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域可用的任何种类的T细胞系。在本公开的某些实施方案中，T细胞是使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种例如Ficoll^TM分离法从由受试者收集的血液单位获得的。在一个优选的实施方案中，从个体提取的血液中的细胞是通过单采(apheresis)获得的。单采产品通常包括T细胞、单核细胞、粒细胞、淋巴细胞(包括B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采收集的细胞以去除血浆级分，然后将其置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在本公开的一个实施方案中，这些细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一个备选实施方案中，洗涤溶液不含钙和镁，或不含不是全部而是许多二价阳离子。同样，令人惊讶的是，在没有钙的情况下的初始激活步骤导致增强的激活。如本领域技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过使用本领域已知的方法来实现，例如，根据制造商的说明通过使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，BaxterCytoMate，或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬在各种生物相容性缓冲液中，例如不含Ca²⁺、不含Mg²⁺的PBS、PlasmaLyte A或其他具有或不具有缓冲液的盐水溶液中。或者，在去除单采样品的不需要的成分后，可以将细胞直接重悬于培养基中。

T细胞的激活和增殖

在基因改变T细胞以表达所需CAR之前或之后，T细胞通常可以使用例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005中所述的方法被激活和增殖。

通常，本公开的T细胞通过与刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂接触和通过与与刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体结合的表面接触而倍增。具体而言，如本文所述，可通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与具有钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触来刺激T细胞群。与T细胞表面上的辅助分子结合的配体用于辅助分子的共刺激。例如，T细胞群体可以在适合刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3和抗CD28抗体接触。抗CD3抗体和抗CD28抗体可刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖。抗CD28抗体的实例包括9.3，B-T3，XR-CD28(Diaclone，贝桑松，法国)，它们可以以与本领域通常已知的其他方法(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977，1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328，1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63，1999)相同的方式使用。

治疗应用

本公开在其范围内包括由慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)。例如，LV编码CAR，其中特异性抗体的抗原结合结构域与CD3-ζ、CD28、4-1BB或其任何组合的细胞内结构域组合。因此，在某些情况下，转导的T细胞可以引发CAR介导的T细胞反应。

本公开提供了使用CAR来重新诱导原代T细胞对肿瘤抗原的特异性。因此，本公开提供了一种在哺乳动物中刺激针对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫反应的方法，包括向哺乳动物施用表达CAR的T细胞的步骤，其中所述CAR具有与给定靶标特异性相互作用的结合部分，例如，包含人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号转导区。

在一个实施方案中，本公开内容包括细胞疗法类型，其中T细胞被遗传改变以表达CAR，并且将CAR T细胞注入到有需要的接受者中。注入的细胞可以杀死接受者体内的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR T细胞可以在体内复制以提供长期持久性，该持久性可导致持续的肿瘤控制。

从抗体片段产生双特异性抗体的技术

文献中还描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，化学键可用于制备双特异性抗体。Brennan等人，Science，229：81(1985)描述了蛋白水解切割完全抗体以产生F(ab’)2片段的程序。这些片段在二硫醇复合物形成剂砷酸钠的存在下被还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab’-TNB衍生物重新转化为Fab’-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作用于酶的选择性固定化的药物。

直接从大肠杆菌中回收Fab’-SH片段

最近的进展使得直接从大肠杆菌中回收Fab’-SH片段变得更加容易，由此通过化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.M.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的生产。每个Fab’片段都从大肠杆菌中单独分泌，并在体外化学偶联以形成双特异性抗体。因此，形成的双特异性抗体不仅能够与过表达HER2的细胞和正常人T细胞结合，而且还能够诱导人细胞毒性淋巴细胞对人胸部肿瘤靶标的裂解活性。

产生和分离双特异性抗体片段的方法

还描述了直接从重组细胞培养物中产生和分离双特异性抗体片段的各种方法。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体(Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽基因融合到两种不同抗体的Fab′部分。抗体同源二聚体在铰链区被还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异源二聚体。该方法也可用于生产抗体同源二聚体。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“双抗体(diabody)”技术提供了产生双特异性抗体片段的另一种机制。这些片段是通过用接头将重链可变结构域(VH)与轻链可变结构域(VL)结合而形成的，其中所述接头足够短以允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补VL和VH结构域强制配对以形成两个抗原结合位点。还报道了使用单链Fv(sFv)二聚体的其他双特异性抗体片段生产策略。参见Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994)。

多于二价的抗体也是可以想象的。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991))。

多价抗体

多价抗体可以比二价抗体更快地被表达与抗体结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)。本公开的抗体可以是具有三个或更多个结合位点的多价抗体(除了IgM类别的那些之外)(例如，四价抗体)，并且可以通过重组表达编码抗体多肽链的核酸容易地产生。多价抗体具有二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由它们组成)。在这种情况下，抗体将具有Fc区和三个或更多位于Fc区氨基末端的抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含三至八个优选四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体具有至少一条多肽链(优选两条多肽链)，并且多肽链具有两个或更多个可变结构域。

例如，多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，并且VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的多肽链之一，X1和X2代表氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，多肽链可以包括：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少两个(优选四个)轻链可变域多肽。本文的多价抗体具有例如约2至约8个轻链可变结构域多肽。本文讨论的轻链可变结构域多肽具有轻链可变结构域，并且在一些情况下具有额外的CL结构域。

抗体变体

在一些实施方案中，考虑了本文公开的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要提高抗体的结合亲和力和/或生物学特性。抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸变化引入抗体的核酸或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、***或置换。可以以任何方式组合缺失、***或置换，只要最终组合物具有所需的特征即可。当产生序列时，可以将氨基酸变化引入受试者的抗体氨基酸序列中。

“丙氨酸扫描诱变”

用于鉴定作为诱变优选位置的抗体的特定残基或区域的有用方法是“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells的Science，244：1081-1085(1989)中所公开的。在此，靶标残基或残基组被鉴定(例如，带电荷的残基，例如arg、asp、his、lys和glu)并被中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)置换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在置换位点处或对于置换位点引入另外的或其他变体来纯化那些对置换表现出功能敏感性的氨基酸位置。如上所述，引入氨基酸序列变体的位点是预先确定的，但不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析任何位点处的突变性能，在靶标密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并筛选表达的免疫球蛋白以获得所需的活性。

氨基酸序列***包括从一个残基到具有100个或更多残基的多肽的长度范围内的氨基末端融合和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体，或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他***变体包括增加抗体血清半衰期的多肽的融合，或(例如，对于ADEPT)酶与抗体的N-末端或C-末端的融合。

多肽的糖基化

多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的结合。天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)的三肽序列是糖链部分与天冬酰胺侧链的酶促结合的结合序列。因此，多肽中任何这些三肽序列的存在都会产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)结合。

向抗体添加糖基化位点

向抗体添加糖基化位点可方便地通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列来完成(对于N-连接的糖基化位点)。也可以通过向原始抗体序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。

如果抗体含有Fc区，则可以改变与其附接的碳水化合物。例如，在美国专利申请号2003/0157108(Presta，L.)中描述了具有缺乏岩藻糖且附接到抗体Fc区的成熟碳水化合物结构的抗体。另见美国专利申请号2004/093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.)。WO 03/011878，Jean-Mairet等人，和美国专利号6,602,684，Umana等人中提到了在与抗体的Fc区附接的碳水化合物内具有二等分N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的抗体。Patel等人的WO 97/30087中报道了在寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体，其中该半乳糖与抗体的Fc区附接。对于具有附接到抗体Fc区的改变的碳水化合物的抗体，还参见WO 98/58964(Raju，S.)和WO 99/22764(Raju，S.)。对于具有修饰的糖基化的抗原结合分子，参见美国专利申请号2005/0123546(Umana等人)。

本说明书中优选的糖基化变体含有Fc区，并且与Fc区附接的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。这些变体具有改善的ADCC功能。在一些情况下，Fc区还包含一个或多个进一步改善ADCC的氨基酸置换，例如在Fc区的位置298、333和/或334处(残基的Eu编号)的置换。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷”抗体相关的文献实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；Okazaki等人Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；和Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108，Presta，L；和WO 2004/056312，Adams等人，尤其是在实施例11)，以及敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004))等。

氨基酸置换变体

其他类型的变体是氨基酸置换变体。这些变体在抗体分子中具有被不同的残基替换的至少一个氨基酸(至少两个、至少三个、至少4个或更多个)残基。置换诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑FR交替。保守置换如表1所示。如果这些置换导致改变的生物活性，则可以引入进一步的实质性修饰，并且可以筛选产物。

[表1]

保守置换

酸性残基	Asp(D)和Glu(E)
		碱性残基	Lys(K)，Arg(R)，和His(H)
亲水性不带电荷残基	Ser(S)，Thr(T)，Asn(N)，和Gln(Q)
		脂肪族不带电荷残基	Gly(G)，Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，和Ile(I)
非极性不带电荷残基	Cys(C)，Met(M)，和Pro(P)
		芳香族残基	Phe(F)，Tyr(Y)，和Trp(W)

抗体生物学特性的实质性修饰

抗体生物学特性的实质性修饰是通过选择其在以下效果中有实质性不同的置换来实现的：维持(a)置换区域中多肽骨架的结构(例如，作为片状或螺旋构象)，(b)在靶标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的尺寸(bulk)。天然存在的残基可以根据共同的侧链特性进行分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性和亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；

(3)酸性：asp、glu；

(4)碱性：his，lys，arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；和

(6)芳香族：trp、tyr、phe。

非保守置换将需要将这些类别之一的一个成员替换为另一类别。

亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基的置换

某些类型的置换变体涉及亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基的置换。通常，选择用于进一步开发的所得变体与制备它们的亲本抗体相比具有改进的生物学特性。用于制备此类置换变体的方便方法包括使用噬菌体展示的亲和力突变。简而言之，将若干个高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。由此产生的多价抗体从丝状噬菌体颗粒中展示为与包装在每个颗粒中的M13基因III产物的融合物。然后如本文公开的针对其生物活性(例如，结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定显著有助于抗原结合的高变区残基。或者或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有利的。这种接触残基和侧翼残基是根据本文描述的技术用于置换的候选物。一旦生成此类变体，如本文所述筛选变体组，并选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步开发。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子

通过本领域已知的各种方法制备编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或通过寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和早期制备的抗体变体或非变体版本的盒式诱变来制备。

Fc区变体

期望将一个或多个氨基酸修饰引入本公开的免疫球蛋白多肽的Fc区以产生Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置具有氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，包括铰链半胱氨酸修饰。

根据本领域的描述和教导，在某些实施方案中，认为使用本公开的方法制备的抗体与相应的野生型相比例如在Fc区具有一个或多个突变。然而，与其野生型对应物相比，该抗体基本上保留了治疗实用性所需的相同特征。例如，如WO 99/51642等所述，可以想象在Fc区引起特异性突变，从而改变(即改善或减少)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。另见Duncan&Winter Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351用于Fc区变体的其他实例。WO 00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)公开了与FcR的结合提高或降低的抗体变体。这些专利文献的内容特别通过引用并入本文。另见Shields等人J.Biol.Chem.9(2)：见6591-6604(2001)。US 2005/0014934A1(Hinton等人)中公开具有增加的半衰期及改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。这些抗体包含具有一个或多个置换的Fc区，所述置换增强Fc区与FcRn的结合。其中Fc区氨基酸序列已被改变以增加或减少C1q结合能力的多肽变体公开于美国专利号6,194,551 B1和WO 99/51642中。这些专利文献的内容特别通过引用并入本文。另见Idusogie等人.J.Immunol.164：参见4178-4184(2000)。

抗体衍生物

本公开的抗体可以进一步修饰以包括本领域已知的容易获得的额外的非蛋白质部分。优选地，适合抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环(dioxolan)、聚-1，3，6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性而具有生产优势。聚合物可以具有任何分子量，且可以是有分支的或无分支的。与抗体附接的聚合物的数目可以变化，且如果附接多于一个聚合物，则其可以是相同的或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于包括但不限于以下的考虑因素来确定：待改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法等。

筛选具有所需特性的抗体

本公开的抗体可以通过本领域已知的各种测定(其中一些在本文中公开)来表征它们的物理/化学特性和生物学功能。在一些实施方案中，抗体具有以下一种或若干种特征：减少或阻断FGF(例如，FGF1和/或FGF9)结合，减少或阻断FGFR3活化，减少或阻断FGFR3下游分子的信号传导，破坏或阻断FGFR3与配体(例如，FGF1、FGF9)结合，减少或阻断FGFR3二聚化，促进单体FGFR3的形成，结合单体FGFR3，预防和/或***、细胞增殖性病症或癌症；和/或预防或治疗与FGFR3表达和/或FGFR3活性相关的疾病(例如，增加的FGFR3表达和/或活性)。在一些实施方案中，针对增加的FGFR3活化、增加的FGFR3下游分子信号传导、凋亡活性、FGFR3下调和效应子功能(例如ADCC活性)筛选抗体。

抗体生产和结构分析

纯化的抗体可以通过一系列测定进一步表征，其中所述测定包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性尺寸排阻高压液相色谱(HPLC)、质谱、离子交换色谱和木瓜蛋白酶消化。

抗体的生物活性分析

在本公开的某些实施方案中，分析本文产生的抗体的生物活性。在某些实施方案中，测试本公开的抗体的抗原结合活性。本领域已知和本文使用的抗原结合测定包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、和蛋白质A免疫测定的任何直接或竞争性结合测定。抗原结合和其他测定描述于下文实施例部分。

抗体细胞生长抑制活性的测量

如果需要抑制细胞生长的抗FGFR3 S249C突变体抗体，则可在测量细胞生长抑制的体外和/或体内测定中测试候选抗体。如果需要促进或不促进细胞凋亡的抗FGFR3 S249C突变体抗体，则可在测量细胞凋亡的测定中测试候选抗体。用于检查癌细胞的生长和/或增殖或用于确定癌细胞的凋亡的方法在本领域中是众所周知的，并且在本文中描述和举例说明了一些方法。用于确定细胞生长和/或增殖或凋亡的示例性方法包括，例如，BrdU摄取测定、MTT、[3H]-胸苷摄取(例如，TopCount测定(PerkinElmer))、细胞活力测定(例如，CellTiter-Glo(Promega))、DNA片段化测定、半胱天冬酶活化测定、台盼蓝排除、染色质形态测定等。

具有效应子功能的抗体的Fc活性

“效应子功能”是指由抗体的Fc区引起的生物活性，其根据抗体的同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。在一个实施方案中，本公开旨在用于具有效应子功能的抗体。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性。可以进行体内和/或体外细胞毒性测定以确认减少/消耗的CDC和/或ADCC活性。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确认抗体缺乏FcγR结合(即几乎缺乏ADCC活性)但保持FcRn结合能力。NK细胞是最早参与ADCC的细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞中的FcR表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页的表3中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的实例描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中。本文还举例说明了用于检测ADCC活性的测定法。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在动物模型中进行体内评估，如例如Clynes等人PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能与C1q结合，即它缺乏CDC活性。为了评估补体活化，可以进行CDC测定，如在例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。此外，可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测量。

载体、宿主细胞和重组方法

对于本公开的抗体的重组生产，分离编码核酸并将其***可复制载体中用于进一步克隆(DNA扩增)或用于表达。编码抗体的DNA很容易通过常规方法(例如，使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。许多载体可供使用。在一定程度上取决于所使用的宿主细胞来选择载体。通常，合适的宿主细胞是来自原核生物或真核生物(通常是哺乳动物)的细胞。任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且应当理解，此类恒定区可获自人或动物物种。

a.使用原核宿主细胞生产抗体

i.载体构建

可以使用标准重组技术获得编码本公开的抗体的多肽组分的多核苷酸序列。可以从产生抗体的细胞如杂交瘤中分离和测序所需的多核苷酸序列。或者，可以使用核苷酸合成仪或PCR方法合成多核苷酸。一旦获得，将编码多肽的序列***到能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可用和已知的许多载体可用于本公开的目的。合适载体的选择主要取决于***载体中的核酸的大小和用该载体转化的特定宿主。每个载体包含多种组分，取决于其功能(异源多核苷酸的扩增和/或表达)以及与其所属的特定宿主细胞的相容性。通常但不限于，载体组分包括复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸***物和转录终止序列。

通常，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主相关使用。该载体通常具有复制起点以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常用pBR322转化，pBR322是一种源自大肠杆菌物种的质粒。由于pBR322含有氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性编码基因，因此可以轻松鉴定转化的细胞。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也包括或被修饰以包括可通过微生物用于表达外源蛋白质的启动子。用于表达某些抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等人的美国专利号5,648,237中。

此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主相关的转化载体。例如，λGEM.TM-11和此类噬菌体可用于制备可用于转化易感宿主细胞如大肠杆菌LE392的重组载体。

本公开的表达载体可以包含编码每个多肽组分的两个或更多个启动子-顺反子(翻译单元)对。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5’)的非翻译序列。通常，有两类原核启动子，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的变化，例如营养物的存在或不存在或温度变化，在其控制下诱导顺反子转录水平增加的启动子。

启动子

由各种潜在宿主细胞结合的各种启动子是已知的。选择的启动子可以通过限制酶消化从源DNA中除去启动子并将分离的启动子***本公开的载体中而与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作地连接。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于引起靶基因的扩增和/或表达。在某些实施方案中，异源启动子是有用的，因为与天然靶多肽启动子相比，它们转录更普遍表达的靶基因并提高效率。

适用于原核宿主的启动子

适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半内酰胺酶(galactamase)和乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***和杂交启动子例如tac或trc启动子。然而，在细菌中起作用的其他启动子(例如，其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。这些核苷酸序列已经公开，并且本领域普通技术人员可以使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接子将它们可操作地连接到编码靶标轻链和重链的顺反子。(Siebenlist等人(1980)Cell 20：269)。

重组载体中的顺反子

在本发明的一个实施方案中，重组载体中的每个顺反子都包含诱导跨膜表达的多肽转录的分泌信号序列组分。通常，信号序列可以是载体的组分或***载体中的靶多肽DNA的一部分。为本发明目的选择的信号序列必须是由宿主细胞结合和加工的(即，被信号肽酶切割的)。对于不结合和处理对异源多肽天然的信号序列的原核宿主细胞，信号序列可以被例如选自由由以下组成的组的原核信号序列替换：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定性肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在一个实施方案中，在表达***的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。

在另一个实施方案中，不需要在每个顺反子中存在分泌信号序列，因为根据本公开的免疫球蛋白是在宿主细胞的细胞质中产生的。在这方面，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质中表达、折叠和组装以形成功能性免疫球蛋白。有一些宿主***表现出对二硫键形成的有利的细胞质条件并使表达的蛋白质亚基能够正确折叠和组装(例如，大肠杆菌trxB***)。Proba和Pluckthun Gene，159：203(1995)。

原核宿主细胞

适合表达本公开的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)、肠杆菌属、假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(粘质沙雷氏菌)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属、根瘤菌属、透明颤菌属或副球菌属。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细菌。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞用作本公开的宿主。作为大肠杆菌菌株的实例，W3110菌株(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，vol.2(Washington，D.C.American Society for Microbiology，1987)，pp.1190-1219；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型为W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR(美国专利号5,639,635)的33D3菌株，是优选的。此外，其他菌株及其衍生物例如大肠杆菌e、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC31,608)也是合适的。这些仅仅是示例并且不应该是限制性的。构建具有限定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法是本领域技术人员已知的并且描述于例如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)中。通常，需要考虑到复制子在细菌细胞中的复制能力来选择合适的细菌。当使用众所周知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410提供复制子时，例如，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌物种可以优选地用作宿主。通常，宿主细胞必须分泌最少量的蛋白水解酶，并且优选地，可以将额外的蛋白酶抑制剂引入细胞培养物中。

ii抗体生产

宿主细胞用上述表达载体转化或转染，并在常规营养培养基中生长，其中该培养基经过修饰以适合于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。

转化是指将DNA引入原核宿主，以使DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体进行复制。根据所使用的宿主细胞，使用适用于此类细胞的标准技术进行转化。用氯化钙进行的钙处理通常用于具有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法使用聚乙二醇/DMSO。再另一种方法是电穿孔。

用于产生本公开的多肽的原核细胞

用于产生本公开的多肽的原核细胞是本领域已知的并且在适合培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的示例包括Luria肉汤(LB)和必需的营养补充剂。在某些实施方案中，培养基还包含基于表达载体的组成而选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加到表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的生长培养基中。

除了碳、氮和无机磷酸盐源之外，可以包含任何所需的补充物，其可以以适当的浓度单独引入或作为与其他补充物或培养基例如复合氮源的混合物。在一些情况下，培养基可以含有选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺(cystamine)、巯基乙酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇组成的组的一种或多种还原剂。

原核宿主细胞的培养温度

在适当的温度下培养原核宿主细胞。例如，对于大肠杆菌的生长，优选的温度在约20℃至约39℃的范围内，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。培养基的pH可以是约5至约9范围内的任何pH，主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌，pH优选为约6.8至约7.4，更优选约7.0。

启动子

当在本公开的表达载体中使用诱导型启动子时，蛋白质表达在适合启动子激活的条件下被诱导。在本发明的一个实施方案中，PhoA启动子用于多肽的转录调控。因此，转化的宿主细胞在磷酸盐限制培养基中培养用于诱导。优选地，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等人，J.Immunol Methods(2002)，263：133-147)。取决于所使用的载体构建体，可以使用本领域技术人员已知的各种其他诱导因子。

蛋白质回收和序列鉴定

在一个实施方案中，本公开的表达的多肽被分泌到宿主细胞的周质中并且从宿主细胞的周质中回收。蛋白质回收通常涉及通过诸如渗透休克、超声或裂解的手段破坏微生物。一旦细胞被破坏，可以通过离心或过滤去除细胞碎片或整个细胞。蛋白质可以进一步纯化，例如，通过亲和树脂层析。或者，可以将蛋白质转运到其可以分离的培养基中。可以从培养物中除去细胞，过滤培养物上清液并浓缩以进一步纯化所产生的蛋白质。表达的多肽可以使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹测定的公知方法进一步分离和鉴定。

用于生产重组蛋白的大规模补料分批发酵过程

在本公开的一个方面，抗体生产通过发酵过程大量进行。各种大规模补料分批发酵过程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升，优选约1000至100,000升的体积。发酵罐使用分散氧气和营养物质尤其是葡萄糖(优选的碳/能源)的搅拌叶片。小规模发酵通常是指在约100升或更少(其范围可以从约1升到约100升)的体积的发酵罐中发酵。

发酵过程

在发酵中，蛋白质表达的诱导通常在细胞在适当条件下生长至所需密度时开始，例如，约180-220 OD550，在细胞处于早期稳定期的阶段。如本领域已知和上文所述，可以根据所使用的载体构建体使用各种诱导剂。细胞可以在诱导前短时间生长。细胞通常被诱导约12-50小时，但这可能更长或更短。

发酵条件

可以修改各种发酵条件以改善本发明公开的多肽的产量和质量。例如，为了改善分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，过表达伴侣蛋白例如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的肽基丙基顺式/反式异构酶)的进一步的载体可用于共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白有助于在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的正确折叠和溶解度。参见Chen等人(1999)J Bio Chem 274：19601-1605；Georgiou等人，美国专利号6083715；Georgiou等人，美国专利号6027888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.等人Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.等人Biol.Chem.275：17106-17113；Arie等人(2001)Mol.Microbiol.39：199-210。

宿主菌株

某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株可用于本公开中，以使表达的异源蛋白(尤其是那些易受蛋白水解影响的)的蛋白水解最小化。例如，可以改变原核宿主细胞系以引起编码已知细菌蛋白酶例如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因突变。有几种大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株是可用的，例如，参见Joly等人(1998)；Georgio等人，美国专利号5264365；Georgiou等人，美国专利号5508192；Hara等人，(1996)，Microbial Drug Resistance 2：63-72。

在一个实施方案中，将缺乏蛋白水解酶并用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株用作本公开的表达***的宿主细胞。

iii.抗体纯化

可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下方法是合适纯化程序的示例：使用免疫亲和或离子交换柱的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、使用正交换树脂如硅胶或DEAE的层析、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀法和使用例如SephadexG-75的凝胶过滤方法。

使用蛋白A的本公开的全长抗体产物的免疫亲和纯化方法

在一个实施方案中，将固定在固相上的蛋白A用于本公开的全长抗体产物的免疫亲和纯化方法中。蛋白A是分离自金黄色葡萄球菌的41kD细胞壁蛋白，它以高亲和力结合抗体的Fc区(Lindmark等人(1983)J.Immunol.，Meth.62：1-13)。在其上固定蛋白A的固相优选为含有玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选为可控孔玻璃柱或硅酸柱。在一些方法中，柱子涂有诸如甘油的试剂以防止污染物的非特异性粘附。

在纯化的第一步中，将细胞培养制剂应用于上述固定有蛋白A的固相，并且靶标抗体与蛋白A特异性结合。然后洗涤固相以去除非特异性结合到固相的污染物。最后，通过洗脱从固相中回收目的抗体。

b.使用真核宿主细胞生产抗体

通常，载体包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

(i)信号序列组分

用于真核宿主细胞的载体可以包含信号序列或在成熟蛋白质或靶多肽的N末端具有特异性切割位点的另一多肽。优选选择的异源信号序列是由宿主细胞结合和加工的(即，被信号肽酶切割的)。对于在哺乳动物细胞中的表达，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列例如单纯疱疹gD信号是可用的。

这种前体区域的DNA在阅读框内与编码多价抗体的DNA连接。

(ii)复制起点

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分。例如，通常使用SV40起点只是因为它具有早期启动子。

(iii)可选择的标记

表达和克隆载体包含选择基因，也称为可选择的标记。典型的选择基因编码蛋白质，该蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素(如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)必要时补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供复合培养基不可得的重要营养物质。

在选择方法的一个示例中，使用抑制宿主细胞生长的药物。用异源基因成功转化的细胞会产生赋予药物抗性的蛋白质，从而在选择过程中存活下来。这种优势选择的示例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

选择标记

适用于哺乳动物细胞的可选择的标记的其他示例是允许识别能够捕获抗体核酸的细胞组分的标记的那些，例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(一种DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。

或者，用编码抗体、野生DHFR蛋白和其他可选择的标记如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞可以通过在细胞生长在培养基中来选择，其中所述培养基含有用于可选择的标记的选择剂例如卡那霉素、新霉素或氨基糖苷类抗生素(例如G418)。参见美国专利号4,965,199。

(iv)启动子组分

表达和克隆载体通常含有启动子，该启动子与宿主生物结合并与抗体多肽核酸可操作地连接。真核启动子序列是已知的。几乎所有真核基因在转录起始位点上游约25至30个碱基处都有富含AT的区域。在许多基因转录起始位点上游70到80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区域，其中N是任何核苷酸。大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，这是用于在编码序列的3’端添加polyA尾的信号。所有这些序列都适合***真核表达载体。

在哺乳动物宿主细胞中从载体转录抗体多肽受例如从病毒基因组获得的启动子调节，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；和热休克启动子，只要这些启动子与宿主细胞***相容即可。

SV40病毒的早期和晚期启动子可以作为进一步包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段方便地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为Hind III E限制性片段方便地获得。使用牛***状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的***公开于美国专利号4,419,446中。该***的变体公开于美国专利号4,660,1978中。或者，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。

(v)增强子元件组分

高等真核生物对编码本发明抗体多肽的DNA的转录通常通过将增强子序列***载体而得到增强。许多增强子序列现在已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，典型地，将使用源自真核细胞病毒的增强子。示例包括复制起点后侧的SV40增强子(100-270个碱基对)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv，Nature，297：17-18(1982)用于增强用于激活真核启动子的元件。增强子可以在抗体多肽编码序列的5’或3’位置处剪接到载体中，但优选位于启动子的5’位置。

(vi)转录终止组分

此外，真核宿主细胞中使用的表达载体通常包含转录终止和mRNA稳定所需的序列。此类序列通常可获自真核或病毒DNA或cDNA的5’和有时3’非翻译区。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO 94/11026和其中公开的表达载体。

(vii)宿主细胞选择和转化

用于克隆或表达本文所述的载体中DNA的合适宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的增殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主建立的细胞系的示例是SV40转化的猴肾CV1株(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚胎肾系(293或293细胞亚克隆以在悬浮培养中生长，Graham等人，J.GenVirol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77：4216(1980))；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA、ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL34)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138、ATCC CCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT0605622，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383：44-68)1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。此外，宿主细胞的示例不限于动物细胞系。当然，也可以使用从活体中提取的各种细胞例如效应细胞和间充质干细胞(MSC)作为宿主细胞。

将宿主细胞用上述表达或克隆载体转化以产生抗体，并在经适当修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。

(viii)宿主细胞培养

用于产生本公开的抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。适用于宿主细胞培养的市售可得培养基的实例是Ham’s F10(Sigma)、最小必需培养((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco’s Modified Eagle’s medium((DMEM)，(Sigma)。此外，Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利号4767704；4657866；4927762；4560655；或5122469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国再颁专利号30985描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。所有这些培养基都可以补充激素和/或其他生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如，氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺苷和胸苷)、抗生素(例如，GENTAMYCIN^TM药物)，微量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或所需的等效能源。任何其他需要的补充剂还可以以本领域技术人员已知的合适浓度包含。培养条件，例如温度、pH等，是过去用于选择用于表达的宿主细胞的那些条件，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。

(ix)抗体纯化

当使用重组技术时，抗体在细胞内产生或直接分泌到培养基中。当抗体在细胞内产生时，第一步是通过例如离心或超滤去除颗粒碎片，无论是宿主细胞还是裂解的片段。如果抗体被分泌到培养基中，来自这种表达***的上清液通常首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器进行浓缩，例如Amicon或Pellicon超滤装置。蛋白酶抑制剂如PMSF可包括在上述任何步骤中以抑制蛋白水解，或者可包括抗生素以防止外源污染物的生长。

从细胞制备的抗体组合物可以通过使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析进行纯化，亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的免疫球蛋白Fc区的物种和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol Meth.62：1-13(1983))。建议将蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，EMBO J.5：165715575(1986))。亲和配体所附接的基质最常见的是琼脂糖，但也可以使用其他材料。与琼脂糖相比，可控孔玻璃和聚(苯乙烯二乙烯基)苯等机械稳定基质可实现更快的流速和更短的处理时间。如果抗体含有CH3结构域，还可以根据回收的多价抗体使用Bakerbond ABx^TM树脂(J.T.Baker，菲利普斯堡，NJ)(聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀方法。

在初步纯化步骤之后，使用具有约2.5-4.5的pH的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)对含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析。

免疫缀合物

“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(异源分子包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。本公开提供了含有本文所述的任何抗FGFR3抗体的免疫缀合物，其中所述抗体与细胞毒性剂(例如化疗剂、细胞损伤剂、生长抑制剂等药剂)(包括“抗体-药物缀合物”或“ADC”)、毒素(例如，细菌、丝状真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即，放射性缀合物))缀合。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻碍细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞损伤剂是但不限于放射性同位素(例如，²¹¹At，¹³¹I，¹²⁵I，⁹⁰Y，¹⁸⁶Re，¹⁸⁸Re，¹⁵³Sm，²¹²Bi，³²P，²¹²Pb和Lu放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶例如核酸降解酶及其片段；抗生素；毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素(包括其片段和/或变体)；以及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

抗体-药物缀合物用于局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂，即在癌症治疗中用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Syrigos和Epenethos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；美国专利号4,975,278)，能够将药物成分靶向转运至肿瘤并在其中进行细胞内累积，而全身施用具有药物作用的非缀合剂会导致对正常细胞以及寻求去除的肿瘤细胞产生不可接受的毒性水平(Baldwin等人，(1986)Lancet pp.(1986年3月15日)：603-05；Thorpe，(1985)“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in MonoclonalAntibodies‘84：Biological And Clinical Applications，A.Pinchera等人(编辑)，pp.475-506)。因此，需要具有最小毒性的最大功效。已报道多克隆和单克隆抗体可用于该策略中(Rowland等人(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21：183-87)。该方法中使用的药物包括道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人，(1986)，同上)。用于抗体-药物缀合物的毒素包括细菌毒素如白喉毒素，植物毒素如蓖麻毒素，小分子毒素如格尔德霉素(Mandler等人(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人(2000).Bioorganic&Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)，美登素类化合物(maytansinoid)(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)和加利车霉素(calicheamicin)(Lode等人，(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人，(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制影响细胞毒性和细胞抑制作用。当与大抗体或蛋白质受体配体缀合时，某些细胞毒性剂往往会失活或活性降低。

(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)是抗体-放射性同位素缀合物，其中针对正常和恶性B淋巴细胞细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与具有硫脲接头-螯合剂的111In或90Y放射性同位素结合(Wiseman等人，(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman等人，(2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)。Zevalin对B细胞非霍奇金淋巴细胞(NHL)有活性，但施用会导致在大多数患者中出现严重和长期的血液不足(hematopenia)。

(吉妥单抗(gemtuzumabozogamicin)；Wyeth Pharmaceuticals)是抗体-药物缀合物，其由与加利车霉素连接的huCD33抗体组成，于2000年被批准作为注射剂用于治疗急性髓性白血病(Drugs of theFuture(2000)25(7)：686；美国专利号4,970,198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。美坎珠单抗(Cantuzumab mertansine)(Immunogen，Inc.)是抗体-药物缀合物，其由通过二硫化物接头SPP与美登素类化合物药物分子DM1连接的huC242抗体组成，目前正在进行II期试验，用于治疗表达CanAg的癌症，例如大肠癌、胰腺癌和胃癌。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)是由与美登素类化合物药物分子DM1连接的抗***特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体组成的抗体-药物缀合物，其正处于用于***癌的潜在治疗的开发阶段中。多拉司他汀的合成类似物、奥瑞他汀肽、奥瑞他汀E(AE)和单甲基奥瑞他汀(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌细胞上的Louis Y特异性)和cAC10(对血液恶性肿瘤的CD30特异性)缀合(Doronina等人，(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784)，并处于治疗开发阶段。

可用于形成免疫复合物(免疫缀合物)的化疗剂在本文中描述(例如，上文)。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐蛋白、花青素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、皂草抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素。例如，参见1993年10月28日公开的WO93/21232。多种放射性核苷酸可用于生产放射性缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。使用各种双功能蛋白偶联剂制备抗体和细胞毒性药物的缀合物，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)和亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(己二酸二甲酯HCL等)、活性酯类(辛二酸二琥珀酰亚胺酯等)、醛类(戊二醛等)、双叠氮化合物(双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺等)、双重氮衍生物(双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺等)、二异氰酸酯(三烯2，6-二异氰酸酯等)、双活性氟化合物(1，5-二氟-2，4-二硝基苯等)。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的螯合剂的示例。参见WO94/11026。

本文讨论了抗体缀合物和一种或多种小分子毒素，例如加利车霉素、美登素类化合物、多拉司他汀、奥瑞他汀、trichothenes和CC1065，以及它们具有毒性活性的衍生物。

i.美登素和美登素类化合物

在一些实施方案中，免疫缀合物包含与一种或多种美登素类化合物分子结合的本公开的抗体(全长或片段)。美登素类化合物是有丝***抑制剂，可抑制微管蛋白聚合。美登素首先是从东非灌木Maytenu sserrata中分离出来的(美国专利号3,896111)。随后发现某些微生物产生类美登素类化合物，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物描述于例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331，598；4,361,650；4,364,866，4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中。

美登素类化合物药物成分是抗体-药物缀合物的有吸引力的药物成分，因为它们(i)相对可用于通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生化制备，(ii)符合适用于通过非二硫化物接头与抗体缀合的官能团的衍生化，(iii)在血浆中稳定，并且(iv)对各种肿瘤细胞系有效。

含有美登素类化合物的免疫缀合物、它们的制备方法和它们的治疗用途公开于例如美国专利号5208020和5416064，以及欧洲专利号0425235B1中，其公开内容通过指定来源并入本文。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 93：8618-8623(1996)描述了含有名为DM1的美登素类化合物的免疫缀合物，该类化合物与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242相连。已发现该缀合物对培养的结肠癌细胞具有高度细胞毒性，并在体内肿瘤生长测定中表现出抗肿瘤活性。Chari等人，Cancer Research，52：127-131(1992)描述了一种免疫缀合物，其中美登素类化合物通过二硫键与结合人结肠癌谱系细胞抗原的鼠抗体A7或与另一种与HER-2/neu癌基因结合的鼠单克隆抗体TA.1缀合。TA.1-美登素类化合物缀合物的细胞毒性在人乳腺癌细胞系SK-BR-3中进行了体外测试，每个细胞表达3×10⁵个HER-2表面抗原。药物缀合物达到了与游离美登素类化合物药剂相似的细胞毒性程度，其通过增加每个抗体分子的美登素类化合物分子的数目而增加。A7-美登素类化合物缀合物在小鼠中显示出低全身细胞毒性。

抗体-美登素类化合物缀合物通过将抗体与美登素类化合物分子化学连接而制备，抗体或美登素类化合物分子的生物活性几乎没有降低。参见，例如，美国专利号5,208,020(通过指定来源特别并入本文)。与使用裸抗体相比，预计一分子毒素/抗体会增加细胞毒性，但每个抗体分子平均结合3-4个美登素类化合物分子的那些具有对靶细胞的提高的细胞毒性而不会对抗体功能或溶解度产生不利影响的效果。美登素类化合物在本领域中是众所周知的并且可以通过已知技术合成或从天然来源中分离。合适的美登素类化合物例如公开于美国专利号5,208,020和其他专利，以及上述非专利出版物中。优选的美登素类化合物是美登醇和美登醇类似物，例如各种美登醇酯，其中美登醇分子的芳环或其他位置被修饰。

本领域已知有许多用于制备抗体-美登素类化合物缀合物的连接基团，包括在例如公开于以下的那些：美国专利号5208020或欧洲专利号0425235B1，Chari等人，CancerResearch，52：127-131(1992)，和2004年10月8日提交的美国专利申请号10/960602(这些公开内容通过指定来源特别并入本文)。可以如2004年10月8日提交的美国专利申请号10/960602中所公开的那样制备包含接头组分SMCC的抗体-美登素类化合物缀合物。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，如上述专利中所公开的，但优选二硫化物和硫醚基团。进一步的连接基团在本文中描述和举例说明。

可以使用各种双功能蛋白偶联剂形成抗体和细胞毒性药物缀合物，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫醇(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(例如，己二酸二甲酯HCL)、活性酯(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如，戊二醛)、双叠氮化合物(例如，双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(例如，双-(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如，甲苯-2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如，1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人Biochem.J.173：723-737)[1978])提供二硫键。

取决于连接的类型，接头可以在不同位置与美登素类化合物分子连接。例如，酯键可以通过使用常规偶联技术与羟基反应而形成。反应发生在具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和用羟基修饰的C-20位置。在优选的实施方案中，连接在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成。

ii奥瑞他汀和多拉司他汀

在一些实施方案中，免疫缀合物包含与多拉司他汀或多拉司他汀肽基类似物和衍生物或奥瑞他汀缀合的本公开的抗体(美国专利号5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀和奥瑞他汀已显示干扰微管动力学、GTP水解以及细胞核和细胞***(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)，并显示具有抗癌活性(美国专利号5663149)和抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或奥瑞他汀药物成分可以通过肽基药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端与抗体连接(WO02/088772)。

示例性奥瑞他汀实施方案包含N-末端连接的单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF，并且公开于2004年11月5日提交的美国继续专利No.10/983340，“MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands”。本公开的全部内容通过指定来源特别并入本文。

通常，基于肽的药物成分可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。例如，可以根据肽化学领域中众所周知的液相合成方法制备这种肽键(参见E.Schroder和K.Lubke，“The Peptides”，第1卷，第76-136页，1965，Academic Press)。奥瑞他汀/多拉司他汀药物成分可以根据以下各项中描述的方法制备：美国专利号5635843；5780588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit，G.R.，等人Synthesis，1996，719-725；和Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863。另见Doronina(2003)Nat Biotechnol21(7)：778-784；“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，2004年11月5日提交的美国继续专利申请10/983340。通过指定来源将它们整体并入本文(例如，它们公开了如何制备接头和单甲基缬氨酸化合物，例如与接头缀合的MMAE和MMAF)。

iii.加利车霉素

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的本公开的抗体。抗生素的加利车霉素家族可在亚皮摩尔浓度下导致双链DNA断裂。关于加利车霉素家族缀合物的制备，参见美国专利号5712374，5714586，5739116，5767285，5770701，5770710，5773001和5877296(均为美国Cyanamid公司)。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等人，CancerResearch，53：3336-3342(1993)，Lode等人，Cancer Research，58：2925-2928(1998)和上述美国Cyanamid公司的美国专利)。抗体可以与之缀合的另一种抗肿瘤剂是抗叶酸素QFA。加利车霉素和QFA都具有细胞内作用位点，并且不易穿过质膜。因此，通过抗体介导的内化将这些药物摄取到细胞中大大提高了它们的细胞毒性作用。

iv.其他细胞毒性剂

可以与本公开的抗体缀合的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链脲菌素、长春新碱和5-氟尿嘧啶，这些试剂家族统称为LL-E33288复合物并描述于美国专利号5053394、5770710中，以及针棘霉素(esperamicine)(美国专利号5877296)。

可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐蛋白、花青素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、皂草抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素。例如，参见1993年10月28日公开的WO93/21232。

本公开进一步讨论了在抗体和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，例如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间形成的免疫缀合物。

抗体可能含有高放射性原子以选择性地破坏肿瘤。各种放射性同位素用于产生放射性缀合的抗体。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。当缀合物用于检测时，它可能含有用于闪烁法研究的放射性原子，例如锝99m或碘123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记例如，碘123、碘131、铟111、氟19、碳13、氮15、氧17、钆、锰或铁。

通过已知方法将放射性标记或另一种标记引入缀合物中。例如，肽是生物合成的，或者是通过化学氨基酸合成使用含有氟-19而不是氢的合适氨基酸前体而合成的。诸如锝99m或碘123、铼186、铼188和铟111的标记可以通过肽的半胱氨酸残基连接。钇90可以通过赖氨酸残基结合。IODOGEN方法((Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可用于掺入碘123。其他方法的详细信息描述于“Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy”’(Chatal，CRC Press 1989)中。

使用各种双功能蛋白偶联剂可以制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(己二酸二甲酯HCL等)、活性酯类(辛二酸二琥珀酰亚胺酯等)、醛类(戊二醛等)、双叠氮化合物(双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺等)、双重氮衍生物(双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺等)、二异氰酸酯(三烯-2，6-二异氰酸酯等)、双活性氟化合物(1，5-二氟-2，4-二硝基苯等)。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的螯合剂的实例。参见WO94/11026。接头可以是“可切割接头”以促进细胞毒性剂在细胞中的释放。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶不稳定接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Research，52：127-131(1992)；美国专利号5208020)。

本公开的特别可想到的化合物是但不限于用以下交联剂制备的ADC：BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，Sulfo-EMCS，Sulfo-GMBS，Sulfo-KMUS，Sulfo-MBS，Sulfo-SIAB，Sulfo-SMCC，和Sulfo-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是可商购的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，罗克福德，IL.，USA)。请参阅2003-2004应用手册和目录(2003-2004 Applications Handbookand Catalog)的第467-498页。

v.抗体-药物缀合物的制备

在本公开的抗体-药物缀合物(ADC)中，抗体(Ab)通过接头(L)缀合至一个或多个药物部分(D)，例如每个抗体约1至约20个药物部分。式I的ADC可以使用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂使用若干种方法制备，包括：(1)抗体的亲核基团与二价接头试剂反应以通过共价键形成Ab-L，然后与药物部分D反应；(2)药物部分的亲核基团与二价接头试剂反应以通过共价键形成D-L，然后与抗体的亲核基团反应。本文描述了制备ADC的其他方法。

Ab-(L-D)p I

接头可以由一种或多种接头组分组成。示例性接头组分是6-马来酰亚胺己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)-戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。其他接头组分在本领域中是已知的，其中一些在本文中描述。另见2004年11月5日提交的美国申请号10/983340的“MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands”。其内容通过指定来源并入本文。

在一些实施方案中，接头可以含有氨基酸残基。示例性氨基酸接头组分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及少量(minor)氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸。可以设计氨基酸接头组分并且可以针对酶例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶的酶促切割的选择性进行特别优化。

抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N-末端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)抗体被糖基化的糖羟基或氨基。胺、硫醇和羟基是亲核的，能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键，包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和卤酸；(ii)卤代烷基和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸交联。通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理，抗体可以与接头试剂缀合。因此，理论上每个半胱氨酸交联形成两个反应性硫醇亲核基团。通过赖氨酸与将胺转化为硫醇的2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-iminothiolane)(Traut试剂)反应，可以将额外的亲核基团引入抗体。可通过引入1、2、3、4或更多个半胱氨酸残基将反应性硫醇基团引入抗体中(例如，以制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)。

此外，本公开的抗体-药物缀合物可以通过修饰抗体以引入亲电子部分(其可以与接头试剂或药物上的亲核取代基反应)来产生。糖基化的抗体糖可以例如用高碘酸盐氧化剂氧化以形成与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛基或酮基。所得亚胺席夫碱可以形成稳定的连接，或者可以例如用硼氢化物试剂还原以形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或过碘酸钠的反应可产生可与药物上的合适基团反应的蛋白质羰基(醛和酮)基团(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，含有N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质与过碘酸钠反应生成醛而不是第一氨基酸(Geoghegan&Stroh，(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；美国专利号5362852)。这样的醛可以与药物部分或接头亲核基团反应。

类似地，药物部分上的亲核基团包括但不限于以下：胺、硫醇、羟基、酰肼(hydrazides)、肟、肼(hydrazines)、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳基肼基团，它们可以与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应并共价结合，包括：(i)活性酯(例如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和卤酰)；(ii)卤代烷基和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。

或者，例如通过重组技术或肽合成来产生含有抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。DNA的长度包括编码缀合物的两个部分的每个区域，它们或者彼此相邻，或者被编码不破坏缀合物所需特性的接头肽的区域分开。

在另一个实施方案中，抗体与“受体”(例如链霉亲和素)缀合以用于肿瘤预靶向，其中将抗体-受体缀合物施用于个体，然后使用清除剂去除来自循环的未结合的缀合物，并施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。

使用抗FGFR3 S249C突变体抗体的方法

本公开的特征在于使用抗FGFR3 S249C突变体抗体作为旨在提供来自治疗剂活性的有益效果的特定治疗方案的一部分。本公开在治疗不同阶段的不同类型癌症中特别有用。

肿瘤可以是实体瘤、非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病(例如，慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、成人急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、成熟B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、前淋巴细胞白血病或毛细胞白血病)，或淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤或霍奇金病)。实体瘤包括除血液、骨髓或淋巴***之外的任何身体组织癌症。实体瘤进一步分为源自上皮细胞的肿瘤和源自非上皮细胞的肿瘤。上皮细胞实体瘤的实例包括胃肠道、大肠、乳腺、***、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、***、胆囊、大***、鼻咽、皮肤、子宫、***官、***、泌尿道、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮来源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤和骨瘤。定义部分描述了肿瘤的其他实例。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法，其包括施用本公开的多特异性抗原结合分子的步骤。在本发明的治疗方法中，期望的是，在施用多特异性抗原结合分子之前预先确认待治疗的癌症表达FGFR3 S249C突变体。即，本公开涉及一种治疗癌症的方法，其包括选择(或鉴定)患有表达FGFR3 S249C突变体的癌症的受试者，并将本公开的多特异性抗原结合分子施用于所选择的受试者(或鉴定的受试者)的步骤。此外，在另一个实施方案中，本公开内容涉及用于向患有表达FGFR3 S249C突变体的癌症的受试者施用的本公开的多特异性抗原结合分子。

或者，本公开涉及本公开的多特异性抗原结合分子在治疗表达FGFR3 S249C突变体的癌症中的用途。此外，本公开涉及本公开的多特异性抗原结合分子在制备用于表达FGFR3 S249C突变体的癌症的治疗性药物组合物中的用途。本发明还涉及制备用于表达FGFR3 S249C突变体的癌症的治疗性药物组合物的方法，该方法包括将本公开的多特异性抗原结合分子与药学上可接受的载体一起配制的步骤。

在本发明的一个实施方案中，以下氨基酸序列可以作为构成FGFR3 S249C突变体结合臂(其构成多特异性抗原结合分子)的可变区结构域的CDR的示例：

另一方面，在本发明的一个实施方案中，作为构成CD3结合臂(其构成多特异性抗原结合分子)的抗原结合结构域的CDR氨基酸，可以例示以下氨基酸序列：

治疗前和/或治疗期间和治疗后的诊断测试

在一些实施方案中，对本公开的患者进行诊断测试，例如，在治疗之前和/或期间和之后。即，可以在选自治疗前、治疗期间和治疗后的任何时间或其组合进行本公开的受试者的诊断测试。通常，当进行诊断测试时，可以从需要治疗的患者采集样品。如果受试者患有癌症，则用于诊断它的样品通常可以是肿瘤样品或其他生物样品。具体而言，例如是包含但不限于血液、尿液、唾液、腹水或诸如血清和血浆的衍生物的生物流体。

在本说明书中，生物样品是固定样品，例如***固定、石蜡包埋(FFPE)样品或冷冻样品。

用于确定mRNA或蛋白质表达的各种方法包括但不限于通过基因表达谱分析的基因表达分析，聚合酶链式反应(PCR)包括定量实时PCR(qRT-PC)，微阵列分析，SAGE方法，MassARRAY，大规模平行特征测序(MPSS)，和蛋白质组学和免疫组织化学(IHC)等。优选地，mRNA被定量。此类mRNA分析优选使用聚合酶链式反应(PCR)技术或通过微阵列分析进行。当使用PCR时，优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。在一个实施方案中，例如，与相同肿瘤类型的其他样品相比，如果一个或多个基因的表达大于或等于中值，则认为它是阳性表达。中值表达水平基本上可以与基因表达的测量同时确定或可以预先确定。

使用固定石蜡包埋组织作为RNA源进行基因表达谱的典型方案的步骤包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增，并在各种出版物的文章中进行了描述(例如，Godfrey等人J.Molec.Diagnostics 2：84-91(2000)；Specht等人，Am.J.Pathol.158：419-29(2001))。简而言之，典型的过程从切割石蜡包埋的肿瘤组织样品开始，其厚度为约10微克。然后提取RNA，去除蛋白质和DNA。在分析RNA浓度后，如有必要，可以包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异性启动子逆转录RNA，然后进行PCR。最后，根据测试的肿瘤样品中鉴定的特征基因表达，分析数据以鉴定患者可用的最佳治疗选项。

可以直接或间接进行基因或蛋白质表达的检测。

可以(直接或间接)确定癌症中FGFR3 S249C突变体的表达或易位或扩增。各种诊断/预后测定可用于此目的。在一个实施方案中，可以通过IHC分析FGFR3 S249C突变体过表达。可以对来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定，以满足以下FGFR3 S249C突变体蛋白染色强度标准：

评分0：未观察到染色，或在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。

评分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱/几乎无法察觉的膜染色。只有部分细胞膜被染色。

评分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到弱到中度的完全膜染色。

评分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中度至强的完全膜染色。

在一些实施方案中，对于FGFR3 S249C突变体的过表达表现出0或1+评分的肿瘤可以表征为未过表达FGFR3 S249C突变体，而表现出2+或3+评分的肿瘤可以表征为过表达FGFR3 S249C突变体.

在一些实施方案中，过表达FGFR3 S249C突变体的肿瘤可以通过对应于每个细胞表达的FGFR3 S249C突变体分子的拷贝数的免疫组织化学评分来评估，其可以被生化定量。即：

0＝0-90拷贝/细胞

1+＝至少约100拷贝/细胞

2+＝至少约1,000拷贝/细胞

3+＝至少约10,000拷贝/细胞

备选地或此外，可以对***固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定，以确定(如果有的话)肿瘤中FGFR3 S249C突变体扩增或易位的存在和/或程度。

FGFR3 S249C突变体活性

FGFR3 S249C突变体活性可以直接(例如，通过磷酸化ELISA测试，或其他定量磷酸化受体的方法)或间接(例如，检测激活的下游信号传导通路成分、受体二聚体(例如，同二聚体、异二聚体)、基因表达谱等)定量。

类似地，组成型FGFR3 S249C突变体激活和/或配体非依赖性或配体依赖性FGFR3S249C突变体可以直接或间接定量(例如，通过检测与组成型活性相关的受体突变，或通过检测与组成型活性相关的受体扩增)。

检测核酸突变的方法是本领域已知的。通常，但不是必须，样品中的靶核酸被扩增以获得所需量的材料，用于确定是否存在突变。扩增技术是众所周知的。例如，扩增产物可以包括或不包括编码目的蛋白质的所有核酸序列，只要它包含预测突变的特定氨基酸序列位置/核酸序列位置即可。

在一个实例中，突变的存在可以通过使来自样品的核酸与能够与编码突变核酸的核酸特异性杂交的核酸探针接触并检测杂交来确定。在一个实施方案中，探针用例如放射性同位素(3H、32P、33P等)、荧光剂(罗丹明、荧光素等)或显色剂可检测地标记。在一些实施方案中，探针是反义寡聚体，例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯、LNA或2’-烷氧基烷氧基(alkoxyalkoxy)。探针可以是约8个核苷酸至约100个核苷酸，或约10至约75个，或约15至约50个，或约20至约30个。在另一个实施方案中，本公开的核酸探针是作为用于鉴定样品中FGFR3突变的试剂盒提供的，并且该试剂盒包含与编码FGFR3的核酸中的突变位点特异性杂交或与其相邻的寡核苷酸。该试剂盒还可包括基于使用该试剂盒的杂交测试结果用FGFR3拮抗剂治疗患有含有FGFR3突变的肿瘤的患者的说明。

也可以通过比较编码野生型FGFR3的相应核酸的电泳迁移率与扩增的核酸的电泳迁移率来检测突变。迁移率的差异表明扩增的核酸序列中存在突变。电泳迁移率可以通过任何合适的分子分离技术来测量，例如在聚丙烯酰胺凝胶上。

此外，可以使用酶突变检测方法(EMD)(Del Tito等人，Clinical Chemistry 44：731-739，1998)分析核酸用于突变检测。EMD使用噬菌体解离酶T4核酸内切酶VII，它沿着双链DNA扫描，直到它检测并切割由核酸突变(如点突变、***和缺失)引起的碱基对错配引起的结构扭曲。例如，通过凝胶电泳检测到由解离酶切割形成的两个短片段表明存在突变。EMD方法的优点是它是一个单一的方案，可直接从扩增反应中鉴定所测定的点突变、缺失和***，无需纯化样品，减少杂交时间，并提高信噪比。可以测定含有多至20倍过量正常核酸和多至4kb大小的片段的混合样品。然而，EMD扫描不能鉴定突变阳性样品中发生的特定碱基变化，并且在必要时需要额外的测序程序来鉴定特定突变。CELI酶可以与解离酶T4核酸内切酶VII以相同的方式使用，如美国专利号5869245中所示。

另一种检测突变的便捷试剂盒是类似于Hemochromatosis StripAssay^TM(ViennaLabs http://www.bamburgmarrsh.com/pdf/4220.pdf)的反向杂交试纸条，用于检测引起血色素沉着症的HFE、TFR2和FPN1基因中的多个突变。此类测定基于通过PCR扩增后的序列特异性杂交。对于单突变测定，可以应用基于微量培养板的检测***，而对于多突变测定，带可以用作“宏阵列”。该试剂盒可能包括用于样品制备、扩增和突变检测的即用型试剂。多重扩增方案提供了便利，并允许在非常有限的体积内测试样品。使用直接的StripAssay实施方案，可以在不到5小时内完成对20个或更多突变的测试，而无需使用昂贵的设备。从样品中分离DNA，并在体外扩增靶核酸(例如PCR)，通常在单个(“多重”)扩增反应中进行生物素标记。扩增产物选择性地与固定在固体支持物上的寡核苷酸探针(野生型和变体特异性)杂交，例如将探针固定为平行线或条带的带。使用链霉亲和素-碱性磷酸酶和彩色底物检测结合的生物素标记的扩增子。这样的测定可以检测本公开中公开的所有或任何突变子集。

对于特定的突变体探针条带，三种信号传导模式之一是可能的：(i)仅用于显示正常核酸序列的野生型探针的条带，(ii)用于显示杂合基因型的野生型和突变体探针的条带，(iii)仅显示纯合突变体基因型的突变体探针的条带。

因此，在某个实施方案中，本公开提供了检测本公开突变的方法，其通过从样品中分离和/或扩增靶FGFR3核酸序列使得扩增产物含有配体，使扩增产物与含有配体(该配体可与本发明的突变体特异性杂交)的可检测结合配偶体的探针接触，然后检测探针与扩增产物的杂交。在一个实施方案中，配体是生物素并且结合配偶体包括抗生物素蛋白或链霉亲和素。在一个实施方案中，结合配偶体是链霉亲和素-碱性，可用彩色底物检测。在一个实施方案中，探针被锚定在例如带上，其中与不同突变互补的探针彼此分开。或者，扩增的核酸用放射性同位素标记，在这种情况下，探针不需要包含可检测的标记。

野生型基因的改变包括所有形式的突变，例如***、倒位、缺失和/或点突变。在一个实施方案中，突变是体细胞的。体细胞突变仅发生在特定组织中，例如肿瘤组织，并且不会由种系遗传。种系突变存在于所有身体组织中。

可以通过本领域熟知的适用于肿瘤的特定类型和位置的方法获得含有靶核酸的样品。组织活检通常用于获得肿瘤组织的代表性部分。另一方面，肿瘤细胞可以以已知或可能含有目的肿瘤细胞的组织/流体的形式间接获得。例如，肺癌病灶的样品可以通过切除、支气管镜检查、细针抽吸、支气管刷洗或从痰液、胸水或血液中获得。突变基因或基因产物可以在肿瘤或其他身体样品(如尿液、痰液或血清)中检测到。上述用于检测肿瘤样品中突变靶基因或基因产物的相同技术可以应用于其他身体样品。癌细胞从肿瘤中分离出来并出现在这些身体样品中。通过筛选这样的身体样品，可以轻松快速地诊断出癌症等疾病。此外，通过测试这些身体样品的突变靶基因或基因产物，可以更容易地监测治疗过程。

用于浓缩肿瘤细胞的组织制品的手段是已知的。例如，组织可以从石蜡或低温恒温器切片中分离。此外，可以通过流式细胞术或激光捕获显微切割将癌细胞与正常细胞分离。这些以及其他用于从正常细胞中分离肿瘤的技术是已知的。当肿瘤组织与正常细胞高度混合时，突变更难以检测，但已知技术可以最大限度地减少污染和/或假阳性/阴性结果。其中一些描述如下。例如，可以评估样品中是否存在已知与目的肿瘤细胞结合但不与相应的正常细胞结合的生物标志物(包括突变)，反之亦然。

靶核酸中点突变的检测可以通过靶核酸的分子克隆和使用本领域熟知的技术对核酸测序来实现。或者，聚合酶链式反应(PCR)可用于直接从来自肿瘤组织的基因组DNA制备物中扩增靶核酸序列。然后可以确定扩增序列的核酸序列并从中鉴定突变。扩增技术在本领域中是众所周知的并且描述于Saiki等人，Science 239：487，1988；美国专利号4683203；和美国专利号4683195中。

注意，合适引物的设计和选择已经在现有技术中确立。

此外，本领域已知的连接酶链式反应可用于扩增靶核酸序列。例如，参见Wu等人，Genomics，第4卷，参见560-569页(1989)。此外，可以使用称为等位基因特异性PCR的技术。例如，参见Ruano和Kidd，Nucleic Acids Research，第17卷，参见8392页，1989。根据该技术，使用在其3’末端与特定靶核酸突变杂交的引物。在没有特定突变的情况下，没有观察到扩增产物。也可以使用扩增受阻突变***(Amplification Refractory Mutation System)(ARMS)，其公开于欧洲专利申请公开号0332435和Newton等人，Nucleic Acids Research，第17卷，第7页，1989。基因***和缺失也可以通过克隆、测序和扩增来检测。此外，基因或周围标记基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针可用于对多态性片段中的等位基因改变或***进行评分。单链DNA构象多态性(SSCP)分析也可用于检测等位基因的碱基变化变体。例如，参见Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA第86卷，pp.2766-2770，1989，以及Genomics，第5卷，参见874-879页，1989。或者，可以使用本领域已知的检测***和缺失的其他方法。

野生型基因的改变也可以基于野生型基因表达产物的改变来检测。这样的表达产物包括mRNA和蛋白质产物。点突变可以通过对由mRNA制成的cDNA进行分子克隆或通过对mRNA进行扩增和测序来检测。可以使用本领域熟知的DNA测序方法确定克隆的cDNA的序列。也可以通过聚合酶链式反应(PCR)对cDNA进行测序。

错配是并非100％互补的杂交核酸双链。缺乏完全互补性可能是由于缺失、***、倒位、替换或移码突变。错配检测可用于检测靶核酸中的点突变。尽管这些技术不如测序敏感，但它们可以更方便地在大量肿瘤样品上进行。错配切割技术的实例是核糖核酸酶保护方法，其详细描述于Winter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，第82卷，第7575页，1985和Meyers等人，Science，Vol.230，p.1242和1985中。例如，本公开的方法可以涉及使用与人野生型靶核酸互补的标记核糖核酸探针。来自肿瘤样品的核糖核酸探针和靶核酸一起退火(杂交)，随后用核糖核酸酶A消化，这可以检测双链RNA结构中的一些错配。如果通过核糖核酸酶A检测到错配，则会在错配位点将其切割。因此，当退火的RNA制备物在电泳凝胶基质上分离时，当错配被核糖核酸酶A检测和切割时，可以看到小于核糖核酸探针和mRNA或DNA的全长双链RNA的RNA产物。核糖核酸探针不必是靶核酸mRNA或基因的全长，而是靶核酸的一部分并且包含疑似突变的位点。如果核糖核酸探针仅包含靶核酸mRNA或基因的区段，则希望使用这些探针中的许多来筛选整个靶核酸序列的错配。

以类似的方式，DNA探针可用于通过酶促或化学切割来检测错配。例如，参见Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，第85卷，4397，1988；和Shenk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，第72卷，第989页，1975。或者，错配可以通过错配双链体相对于匹配双链体的电泳迁移率的变化来检测。例如，参见Cariello，Human Genetics，第42卷，第726页，1988。使用核糖核酸探针或DNA探针，可以在杂交前扩增可能含有突变的靶核酸mRNA或DNA。也可以使用Southern杂交检测靶核酸中的DNA变化，特别是如果这些变化是整体重排(gross rearrangement)，例如缺失和***。

也可以使用等位基因特异性探针筛选靶核酸的扩增DNA序列。这些探针是核酸寡聚体，每一个都包含具有已知突变的靶核酸基因区域。例如，一种寡聚体的长度可以约为30个核苷酸，对应于靶基因序列的一部分。使用这样一系列等位基因特异性探针可以筛选靶核酸扩增产物并鉴定靶基因中先前鉴定的突变的存在。等位基因特异性探针与扩增的靶核酸序列的杂交可以例如用尼龙过滤器进行。特异性探针在严格杂交条件下的杂交表明在肿瘤组织中存在等位基因特异性探针中的相同突变。

野生型靶基因的改变也可以通过筛选相应的野生型蛋白质的改变来检测。例如，可以使用与靶基因产物免疫反应的单克隆抗体来筛选组织，所述单克隆抗体例如为已知与基因产物(蛋白质)中特定突变位置结合的抗体。例如，使用的抗体可以是结合缺失外显子的抗体或结合包含靶蛋白缺失位点的构象表位的抗体。缺乏同族抗原将表明突变。此外，突变等位基因产物的特异性抗体可用于检测突变基因产物。可以从噬菌体展示文库中鉴定抗体。可以以本领域已知的任何方便的形式进行此类免疫测定。这些包括蛋白质印迹、免疫组织化学测定和ELISA测定。任何检测改变的蛋白质的方法都可以用来检测野生型靶基因的改变。

引物对可用于使用核酸扩增技术如聚合酶链式反应确定靶核酸的核苷酸序列。单链DNA引物对可以与靶核酸序列或在其周围退火，以引发靶序列的扩增。也可以使用等位基因特异性引物。此类引物仅与特定突变靶序列退火，因此仅在突变靶序列作为模板存在的情况下扩增产物。为了便于随后克隆扩增的序列，引物可以具有在其末端附接的限制酶位点序列。这样的酶和位点在本领域中是众所周知的。可以使用本领域熟知的技术合成引物本身。通常，可以使用市售的寡核苷酸合成仪制备引物。特定引物的设计完全在本领域普通技术人员的技能范围内。

核酸探针可用于许多目的。它们可在与基因组DNA的Southern杂交中以及用于检测上文已讨论的点突变的核糖核酸酶保护方法中使用。探针可用于检测靶核酸扩增产物。它们还可用于使用其他技术检测与野生型基因或mRNA的错配。错配可以使用酶(例如S1核酸酶)、化学品(例如羟胺或四氧化锇和哌啶)或与完美匹配的杂合体相比时错配杂合体的电泳迁移率变化来检测。这些技术在本领域中是已知的。参见Novack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，第83卷，第586页，1986。一般来说，探针与激酶结构域外的序列互补。核酸探针系列可用于构建用于检测靶核酸中突变的试剂盒。该试剂盒允许目的靶序列与大区域杂交。探针可以相互重叠或相互邻近。

当使用核糖核酸探针检测与mRNA的错配时，它与靶基因的mRNA互补。因此，核糖核酸探针是一种反义探针，因为它与有义链互补，所以它不编码相应的基因产物。核糖核酸探针通常用放射性、比色或荧光物质标记，这可以通过本领域已知的任何方式实现。当核糖核酸探针用于检测与DNA的错配时，它可以是极性的、有义的或反义的。同样，DNA探针也可用于检测错配。

化疗剂

本公开的联合疗法还可包括一种或多种化疗剂。伴随施用包括使用单独的或单一的药物制剂同时或共同施用，以及以任何顺序连续施用，所述顺序提供一段时间，在此期间优选两种(或所有)活性剂的生物活性同时发挥。

当施用时，化疗剂通常以此类药剂已知的剂量给予，或在某些情况下由于药剂的联合作用或抗代谢物化疗剂施用导致的不良副作用而降低剂量。这种化疗剂的制备和给药方案可以根据制造商的说明或通过本领域技术人员的经验确定来完成。

本说明书中公开了可以组合使用的各种化疗剂。

在一些实施方案中，组合的优选化疗剂选自由以下各项组成的组：来那度胺(REVLIMID)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(VELCADE)和PS342)、植物来源的(长春新碱、长春碱、依托泊苷、伊立替康、诺替康(nogitecan)、紫杉醇、多西他赛)，硼紫杉烷(包括多西他赛和紫杉醇)，长春花(例如，长春瑞滨或长春碱)，铂化合物(例如，卡铂、顺铂或奈达铂)，芳香酶抑制剂(例如，来曲唑、阿那曲唑、或依西美坦)，抗***(例如，氟维司群或他莫昔芬)，依托泊苷，噻替派，烷化剂(环磷酰胺、异环磷酰胺)、甲氨蝶呤、脂质体多柔比星、聚乙二醇脂质体多柔比星、卡培他滨、吉西他滨、长春瑞滨、美沙林、抗癌抗生素(博来霉素、培布霉素、丝裂霉素C、多柔比星、表柔比星、吡柔比星)、长春新碱、伊立替康、COX-2抑制剂(如塞来昔布)或类固醇(如***和强的松)、代谢拮抗剂(5-氟尿嘧啶、UFT(替加氟尿嘧啶)、去氧氟尿苷和TS-1(也缩写为S-1)(替加氟、吉美拉西和奥曲西钾)、阿糖胞苷)。在一些实施方案(例如，与t(4；14)+多发性骨髓瘤的治疗相关的实施方案)中，将以下各项组合：***与来那度胺，或***，或硼替佐米，或长春新碱，多柔比星与***，或沙利度胺与***，或脂质体多柔比星，长春新碱与***，或来那度胺与***，或硼替佐米与***，或硼替佐米，多柔比星与***。在一些实施方案(例如，涉及膀胱癌的实施方案)中，将以下各项组合：紫杉烷类(例如，紫杉醇、多西他赛)或培美曲塞，或甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星和顺铂，或卡铂，或丝裂霉素C与5-氟尿嘧啶的组合，或顺铂，或顺铂和5-氟尿嘧啶。

制剂、剂量和施用

本公开中使用的治疗剂的制剂、剂量和施用是根据良好的医学实践确定的。在这种情况下要考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定受试者、个体患者的临床状况、病症的原因、药物的递送部位、施用方法、剂量方案、和联合使用的药物之间的相互作用以及医疗保健专业人员已知的其他因素。

使用本领域已知的标准方法，通过将所需纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences(第20版)，A.Gennaro编辑，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，费城，PA)。

本文的制剂还可以包括待治疗的特定症状所需的两种或更多种活性化合物，优选具有互补活性且不会相互逆转作用的化合物。此类分子以对预期目的有效的量适当组合。

本公开的治疗剂可以通过以下方式施用至人类患者：以推注形式静脉内施用，或在一定时间段内连续输注，或根据已知方法如肌肉内、口内、脑脊髓内、皮下、关节内、脑膜内、鞘内、口服或局部施用，或通过吸入。可根据患者年龄和症状选择合适的施用方法。对于每个剂量，剂量可以选择为例如0.0001mg至1,000mg/kg体重。或者，可以选择剂量，例如，从每名患者0.001mg/身体至100,000mg/身体。然而，本发明的药物组合物的剂量不限于此。离体策略也可用于治疗应用。在离体策略中，从受试者收获的细胞用编码FGFR3拮抗剂的多核苷酸转染或转导。然后将转染或转导的细胞返回给受试者。细胞可以是多种细胞中的任何一种，包括但不限于造血细胞(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌肉细胞。

产生细胞内抗体的基因疗法

在本申请中，考虑通过基因疗法施用抗抗体。参见，例如，1996年3月14日公开的WO96/07321，关于使用基因疗法产生细胞内抗体。

产品

以下是本公开的方法和组合物的实施例。应当理解，基于以上概述，各种其他实施方案是可行的。

[实施例]

[实施例1]选择性结合人FGFR3(hFGFR3)S249C突变体的抗体的制备。

表达hFGFR3的CHO细胞(hFGFR3/CHO DXB11s)和表达hFGFR3 S249C突变体的CHO细 胞(hFGFR3/S249C/CHO DXB11s)的制备

将编码hFGFR3蛋白(SEQ ID NO：1)的cDNA序列(SEQ ID NO：2)和编码hFGFR3S249C突变体蛋白(SEQ ID NO：3)的cDNA序列(SEQ ID NO：4)***pCXND3(WO2008/156083)中以制备表达载体。通过电穿孔法(LONZA，Nucleofector)将这些载体的PvuI消化产物引入CHO细胞(DXB11s，由东京大学分配)。用500μg/mL遗传霉素选择基因导入的细胞系。药物选择后，使用细胞分选仪(FACS Aria III，BD)将所选择的细胞系以1细胞/孔接种到96孔板中以获得单细胞来源的克隆，并进行扩增培养以建立单克隆细胞系(hFGFR3/CHO DXB11s细胞和hFGFR3 S249C/CHO DXB11s细胞)。

测量强制表达野生型hFGFR3的CHO细胞(hFGFR3/CHO DXB11s)和强制表达hFGFR3 S249C突变体的CHO细胞(hFGFR3 S249C/CHO DXB11s)中的hFGFR3表达水平

使用QIFI试剂盒(DAKO)测量野生型hFGFR3或hFGFR3 S249C突变体在hFGFR3/CHODXB11s和hFGFR3 S249C/CHO DXB11s细胞中的抗体结合能力(ABC)。将结合野生型和S249C突变体的抗FGFR3抗体(R&D systems)添加到各自5.0x10⁴个细胞中，最终浓度为20μg/mL，并在4℃下孵育30分钟。洗涤后，加入1/50体积的二抗(附在试剂盒上)并在4℃下孵育30分钟。使用FACS Lyric分析洗涤的细胞并计算ABC。FGFR3/CHO DXB11s的ABC为2.69x10⁴/细胞，hFGFR3 S249C/CHO DXB11s的ABC为2.58x10⁴/细胞，显示几乎相同的表达水平。

[表2]

细胞系	抗体结合能力(ABC)(抗体/细胞)
		hFGFR3/CHO DXB11s	2.69x10<sup>4</sup>
hFGFR3 S249C/CHO DXB11s	2.58x10<sup>4</sup>

[实施例2]抗hFGFR3 S249C突变体抗体的制备

本说明书中的抗体根据以下规则命名：

(重链可变区)-(重链恒定区)/(轻链可变区)-(轻链恒定区)

例如，如果抗体名称为A0000-B0000/C0000-D0000，则表示该抗体的重链可变区为A0000，重链恒定区为B0000，轻链可变区为C0000，以及轻链恒定区为D0000。

类似地，抗体的可变区可以按照以下规则表示：

(重链可变区)/(轻链可变区)。

例如，如果抗体名称为A0000/C0000，则表示该抗体的重链可变区为A0000，并且轻链可变区为C0000。

此外，双特异性抗体根据以下规则命名：

AA(第一抗体重链)/XX(第一抗体轻链)//BB(第二抗体重链)/YY(第二抗体轻链)。

在抗hFGFR3 S249C突变体抗体的制备中，使用Helios基因枪和用于兔免疫的体内基因转移装置(ECM830)进行DNA免疫(SEQ ID NO：4)，并通过流式细胞术使用实施例1中描述的hFGFR3/CHO DXB11s和hFGFR3 S249C/CHO DXB11s进行单克隆抗体筛选。

对于免疫，使用12周龄的兔(新西兰白兔，购自Kitayama Labes Co.，Ltd.)。对于通过基因枪进行的基因转移，根据BIO-RAD的Helios基因枪简单操作手册，将编码hFGFR3S249C突变体的质粒DNA(SEQ ID NO：4)包被在金颗粒上并免疫至兔腹部。在通过基因枪进行基因转移的同时，使用体内基因转移装置(ECM830)将相同的表达质粒引入兔子双腿的大腿肌肉和肩和腿的皮肤。免疫计划为每周一次，总共进行了6至10次免疫。在确认由于DNA免疫导致的抗体滴度增加后收集血液和脾脏。

由血液和脾脏制备的外周血单核细胞和脾细胞用抗兔IgG-PE染色，并用细胞分选仪浓缩在表面上的表达B细胞受体的B细胞。将获得的B细胞接种在96孔板上，并在25,000个细胞/孔的EL4细胞存在的情况下在BT培养基中培养6-12天(通过先前的X射线照射处理抑制细胞生长)。作为BT培养基，将含有L-Gln(nacalai tesque)的RPMI 1640用作基础培养基，其中加入胎牛血清、超低IgG(Life Technologies)和1/20倍稀释的兔T细胞培养基。通过在补充有植物血凝素-M(Roche，目录号1 1082132-001)、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Sigma，目录号P1585)和2％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养兔细胞来制备兔T细胞培养基。

筛选如下进行。将分泌到B细胞培养基中的兔抗体与表达FGFR3的细胞系(CHODXB11s细胞、hFGFR3/CHO DXB11s细胞和hFGFR3 S249C/CHO DXB11s细胞)反应后，用针对结合至细胞表面的兔抗体的二抗(山羊抗兔IgG(H+L)-Alexa647，Thermo FisherScientific，目录号A-21244)对细胞进行染色，然后用流式细胞仪(CyAnTM ADP，BeckmanCoulter)进行分析。作为筛选的结果，与与CHO DXB11s细胞和hFGFR3/CHO DXB11s细胞的结合相比，含有与hFGFR3 S249C/CHO DXB11s细胞结合更强的抗体的孔被选为阳性孔，其含有表达选择性结合FGFR3 S249C突变体的抗体的B细胞。

如下克隆所选阳性孔中B细胞的抗体基因。B细胞通过用CellsDirect/重悬浮和裂解缓冲液(Life Technologies，11739-010)处理来裂解，然后添加DNase I(E1009-A，ZymoResearch)并反应以破坏基因组DNA。使用SuperScript III CellsDirect cDNA合成***(Life Technologies，18080-300)合成抗体基因的重链和轻链cDNA。使用所得的cDNA为模板，可变区(FGA0002VH(SEQ ID NO：5)，FGA0002VL(SEQ ID NO：6)，FGA0005VH(SEQ ID NO：7)，FGA0005VL(SEQ ID NO：8)，FGA0007VH(SEQ ID NO：9)和FGA0007VL(SEQ ID NO：10))通过PCR(Platinum Taq DNA聚合酶，高保真度，Life Technologies，11304-029)进行扩增，并根据手册使用In-fusion将PCR扩增产物掺入到编码人重链恒定区(F760mnN17，SEQ ID NO：11)和人轻链恒定区(k0MTC，SEQ ID NO：12)的质粒DNA中。

[参考实施例1]抗体的表达和纯化

将制备的质粒瞬时引入人胚胎肾癌细胞来源的HEK293H株(Invitrogen)、FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Invitrogen)中以表达抗体。回收得到的培养上清液，通过0.22μm过滤器(MILLEX(R)-GV(Millipore))或0.45μm过滤器(MILLEX(R)-GV(Millipore))过滤，以获得培养上清液。通过本领域技术人员已知的方法，使用rProteinA Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Japan)或Protein G Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare Japan)从该获得的培养上清液中纯化抗体。通过使用分光光度计测量280nm处的吸光度来计算纯化抗体浓度，并且使用通过诸如PACE(Protein Science1995；4：2411-2423)的方法计算的吸光系数由获得的值计算抗体浓度。

[实施例3]双特异性抗体的制备

通常，抗体具有两个具有相同抗原结合活性的臂，因此它是两个臂可以同时结合细胞表面上的靶抗原的二价抗体(本说明书中称为“单特异性抗体”)。相反，由具有不同抗原结合活性的两个臂组成的抗体称为双特异性抗体(在本说明书中称为“双特异性抗体”)，并且仅一个臂与仅表达一种抗原的细胞结合(单价结合)。由于二价抗体和双特异性抗体的结合活性不同，因此除了二价抗体之外还制备双特异性抗体以评估单价结合和二价结合。

通过筛选而选择的二价抗体的制备如下进行。将通过B细胞筛选而选择的抗体基因引入Expi293细胞(Invitrogen)中以表达抗体。向培养瓶中加入200mL培养基，并按照制造商手册进行转染。培养4天后，制备细胞上清液，通过本领域技术人员已知的方法使用rProtein A Sepharose(GE Healthcare)通过柱纯化，获得纯化的抗体。

[表3]

接下来，如下进行双特异性抗体的制备。将两种抗体以各500μg混合，添加用D-PBS(-)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制备至250mM的2-巯基乙胺·HCl(2-MEA，Sigma-Aldrich)10μL。用D-PBS(-)将总体积增加到500μL。该溶液在37℃反应17小时后，使用Toru-kun(Nippon Genetics)在D-PBS(-)中通过透析除去2-MEA。

FGA0005和FGA0007和抗CD3抗体(重链可变区：TR01H113(SEQ ID NO：13)，重链恒定区：F760mnP17(SEQ ID NO：14)，轻链可变区：L0011(SEQ ID NO：15)，轻链恒定区：k0(SEQID NO：16))在反应条件下以下述组合混合以产生双特异性抗体，并根据参考实施例2中的方法评价反应产物。

(1)FGA0002VH-F760mnN17/FGA0002VL-k0MTC和TR01H113-F760mnP17/L0011-k0

(2)FGA0005VH-F760mnN17/FGA0005VL-k0MTC和TR01H113-F760mnP17/L0011-k0

(3)FGA0007VH-F760mnN17/FGA0007VL-k0MTC和TR01H113-F760mnP17/L0011-k0

反应条件：在PBS(pH7.4)中，[每个mAb]＝1.0mg/ml，[2-MEA(Sigma)]＝25mM，37℃，过夜反应。

[参考实施例2]通过离子交换层析评价双特异性抗体产生率

使用Prominence UFLC(Shimadzu Corporation)并使用离子交换层析纯化方法评价每个样品的分离。包含9.6mMTris、6.0mM哌嗪和11.0mM咪唑(pH5.0)的Tris缓冲液以及包含含有150mM氯化钠的9.6mM Tris、6.0nM哌嗪和11.0mM咪唑(pH：10.1)的Tris缓冲液用于流动相，并且ProPac WCX-10(Thermo Scientific)用作柱以便通过双溶液混合梯度法分离双特异性抗体。数据在280nm波长下采集，并且洗脱结果使用Empower2(Waters)进行评估。

通过将双特异性抗体峰面积值除以***中存在的所有抗体的峰面积值并乘以100获得双特异性抗体生产率(％)。当其中一种同源二聚体的回收率较差时，计算通过将其他同源二聚体的面积的两倍值与双特异性抗体峰面积值相组合而获得的值，作为所有抗体的峰面积值。

[表4]

因此，获得单特异性抗hFGFR3 S249C突变体抗体(FGA0002二价Ab、FGA0005二价Ab和FGA0007二价Ab)和双特异性抗hFGFR3 S249C突变体/CD3抗体(FGA0002/CD3-TRAB、FGA0005/CD3-TRAB和FGA0007/CD3-TRAB)，它们是能够特异性结合hFGFR3 S249C突变体的抗体。与hFGFR3 S249C突变体结合的各抗体臂的可变区的氨基酸序列和构成它们的CDR(HVR)如下：

[表5]

[实施例4]在hFGFR3/CHO DXB11s和hFGFR3 S249C/CHO DXB11s细胞中测量(a)单 特异性抗hFGFR3 S249C突变体抗体(FGA0005二价Ab和FGA0007二价Ab)和(b)双特异性抗 hFGFR3 S249C突变体/CD3抗体(FGA0005/CD3-TRAB和FGA0007/CD3-TRAB)的结合活性

使用流式细胞仪测量单特异性抗体FGA0005和FGA0007和双特异性抗体FGA0005/CD3-TRAB和FGA0007/CD3-TRAB针对通过实施例1中描述的方法制备的hFGFR3/CHO DXB11s细胞和hFGFR3 S249C/CHO DXB11s细胞和亲本株CHO DXB11s细胞的细胞表面上的野生型hFGFR3或hFGFR3 S249C突变体的结合活性。

在用补充有0.5％BSA的FACS/PBS洗涤每个细胞系的9x10⁶个细胞后，将450μL稀释5000倍的Fixable Viability Dye 780(eBioscience)添加到每个细胞中。将25μL每种制备的细胞悬液分配到V形底96孔板(Greiner Bio-one)中。制备了终浓度0.01、0.1、1μg/mL两倍的单特异性抗体FGA0005和FGA0007。此外，制备了终浓度5、10和20μg/mL两倍的双特异性抗体FGA0005/CD3-TRAB和FGA0007/CD3-TRAB。将25μL含有双倍浓度制备的单特异性抗体FGA0005二价Ab和FGA0007二价Ab和双特异性抗体FGA0005/CD3-TRAB和FGA0007/CD3-TRAB的溶液加入到V形底96孔板中，并在4℃静置30分钟。用FACS/PBS洗涤细胞后，各自添加用FACS/PBS稀释100倍的山羊抗人IgG Fc交叉吸附二抗，Dylight 650 Conjugate(Invitrogen)50μL，并在4℃下静置30分钟。用FACS/PBS洗涤细胞，然后通过流式细胞术进行分析。

结果，单特异性抗体FGA0005二价Ab和FGA0007二价Ab和双特异性抗体FGA0005/CD3-TRAB和FGA0007/CD3-TRAB对hFGFR3S249C/CHO DXB11s细胞显示出体积依赖性结合活性，但它们不显示针对hFGFR3/CHO DXB11s细胞和亲本株CHO DXB11s的结合活性。由以上可确认，单特异性抗体FGA0005二价Ab和FGA0007二价Ab以及双特异性抗体FGA0005/CD3-TRAB和FGA0007/CD3-TRAB显示出相比于野生型hFGFR3的针对hFGFR3 S249C突变体的选择性结合活性。

[实施例5]测量人肺癌细胞PC10细胞系(PC10)、强制表达野生型hFGFR3的PC10细 胞(PC10/FGFR3 WT)和强制表达hFGFR3 S249C突变体的PC10细胞(PC10/FGFR3 S249C)的细 胞表面上的hFGFR3表达水平

使用QIFI试剂盒(DAKO)通过流式细胞术，计算抗体针对PC10衍生细胞系细胞表面上野生型hFGFR3或hFGFR3 S249C突变体的结合能力。

使用QIFI试剂盒(DAKO)测量PC10、PC10/FGFR3 WT和PC10/FGFR3 S249C细胞中FGFR3或FGFR3 S249C的抗体结合能力。将结合野生型和S249C突变体的抗FGFR3抗体(R&Dsystems)添加到各自5x10⁵个细胞中，最终浓度为20μg/mL，并在4℃下孵育30分钟。洗涤后，加入1/50体积的二抗(附在试剂盒上)并在4℃下孵育30分钟。使用流式细胞仪分析洗涤的细胞并计算ABC。

计算了每个细胞系中细胞表面上的FGFR3 WT或S249C的ABC，并显示在表6中。对于PC10/FGFR3 WT，ABC为4.56x10⁴抗体/细胞，并且对于PC10/FGFR3 S249C，ABC为4.31x10⁴抗体/细胞，它们是几乎相同的表达水平。此外，在PC10中，它是1.94x10³抗体/细胞，表示几乎没有表达。

[表6]

细胞系	抗体结合能力(ABC)(抗体/细胞)
		PC10	1.94x10<sup>3</sup>
PC10/FGFR3 WT	4.56x10<sup>4</sup>
		PC10/FGFR3 S249C	4.31x10<sup>4</sup>

[实施例6]测量其中一个臂与hFGFR3 S249C突变体结合而另一臂与CD3结合的双 特异性抗体(FGA0002/CD3-TRAB)和其中一个臂不与hFGFR3 S249C突变体结合而另一臂与 CD3结合的双特异性抗体(KLH/CD3-TRAB)在PC10、PC10/hFGFR3 WT和PC10/hFGFR3 S249C中 的结合活性

对于每个细胞系，使用流式细胞术计算FGA0002/CD3-TRAB针对细胞表面上的FGFR3 WT或FGFR3 S249C的结合活性。

用补充有0.5％BSA的FACS/PBS洗涤每个细胞系的5.2x10⁶个细胞，然后将325μL稀释5000倍的Fixable Viability Dye 780(eBioscience)添加到每个细胞中。分配25μL每种制备的细胞悬液。将25μL含有FGA0002/CD3-TRAB或KLH/CD3-TRAB(以2倍浓度制备以获得3、0.3或0.03μg/mL的终浓度)的溶液添加到细胞制备溶液中，并在4℃下静置30分钟。用FACS/PBS洗涤细胞后，各自添加稀释100倍的山羊抗人IgGFc交叉吸附二抗，Dylight 650Conjugate(Invitrogen)50μL，并在4℃下静置30分钟。用FACS/PBS洗涤细胞，然后通过流式细胞术进行分析。

结果，FGA0002/CD3-TRAB显示出对PC10/FGFR3 S249C的强结合活性，但对PC10亲本株或PC10/FGFR3WT显示出几乎没有结合活性。从以上可以确认，与野生型hFGFR3相比，FGA0002/CD3-TRAB对hFGFR3 S249C突变体表现出选择性结合活性。

另一方面，确认了KLH/CD3-TRAB不显示对hFGFR3 S249C突变体的选择性结合活性。

[实施例7]使用人外周血单核细胞作为效应细胞在PC10、PC10/FGFR3 WT、PC10/ FGFR3 S249C中FGA0002/CD3-TRAB的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)活性

FGA0002/CD3-TRAB的TDCC活性按照以下方法测量。使用人外周血单核细胞(以下称为hPBMC)作为效应细胞，如下测量每种测试抗体的TDCC活性。

(1)靶细胞的制备

用胰蛋白酶(nacalai)分离靶细胞并测量细胞数。将细胞用各细胞的培养液(RPMI-1640(SIGMA)，含有10％FBS)(以下称为10％FBS/RPMI-1640)稀释以具有2×10⁵细胞/ml。将各50μL培养基加入E-Plate 96(ACEA Bioscience Inc)中，并测量背景细胞指数。将制备的靶细胞50μL加入E-Plate中，并开始细胞指数连续测量。

(2)抗体的制备

在(1)的次日制备抗体溶液。将用靶细胞培养液稀释至终浓度4倍浓度(0.12，0.4，1.2，4，12，和40μg/ml)的抗体溶液以每孔50μl加入E-plate 96。对于抗体，使用FGA0002/CD3-TRAB和KLH/CD3-TRAB作为对照。

(3)人PBMC溶液的制备

在(1)的次日，将冷冻保存的人PBMC(Cellular Technology Limited (CTL))解冻，同时加入20倍稀释的抗聚集洗涤液(CTL)。离心后去除上清液，并将细胞悬浮于10％FBS/RPMI-1640中并计数。将细胞悬浮在10％FBS/RPMI-1640中，使细胞密度为2x10⁶个细胞/ml。将50μl细胞悬液添加到E-plate 96的每个孔中作为效应细胞。

[实施例8]通过xCELLigence测量TDCC活性

将添加了靶细胞、抗体和效应细胞的E-Plate置于xCELLigence中，并且每10分钟测量细胞指数。细胞生长抑制(CGI)％是从添加抗体和效应细胞后72小时后的细胞指数和细胞添加前的细胞指数(全部设为1)通过以下方法计算的。它是在N＝3时测量的，并且平均值用于以下计算。

CCI％＝100x(A-B)/(A-1)

A：未添加抗体的孔(仅靶细胞和效应细胞)的细胞指数。

B：已添加靶细胞、抗体和效应细胞的孔的细胞指数。

将细胞添加前的所有细胞指数设置为1进行计算。

结果，FGA0002/CD3-TRAB对PC10/FGFR3 S249C显示出强TDCC活性，但在高浓度下对PC10/FGFR3 WT仅显示出弱的TDCC活性。此外，它对PC10亲本株没有表现出活性。综上所述，确认了与野生型hFGFR3相比，FGA0002/CD3-TRAB对hFGFR3 S249C突变体表现出选择性的

[工业实用性]

如前所述，众所周知，FGFR3在细胞增殖中起重要作用。然而，由于野生型FGFR3不仅在癌组织中表达，而且在正常组织中表达，因此与其结合的抗体也与正常组织结合。另一方面，FGFR3 S249C突变体在癌症中特异性表达。因此，区分野生型FGFR3和FGFR3 S249C突变体的抗体可以是针对癌细胞的特异性抗体药物。或者，对FGFR3 S249C突变体特异性的抗体也可用作癌组织成像、癌细胞病理学检查等中的诊断工具。

在优选的实施方案中，本公开提供了新的多特异性抗原结合分子，该分子具有长的血液半衰期，同时保持强抗肿瘤活性和优异的安全特性，例如不以癌抗原非依赖性方式诱导细胞因子风暴。包含本公开的抗原结合分子作为活性成分的细胞毒性剂可以通过靶向表达FGFR3 S249C突变体的细胞和含有该细胞的肿瘤组织来诱导细胞毒性。当将本公开的多特异性抗原结合分子施用于患者时，其不仅安全性高，而且能够实现身体负担更小且更方便的理想治疗。

Claims (23)

1.多特异性抗原结合分子，其包含：对FGFR3 S249C突变体具有选择性结合活性的第一抗原结合结构域；和具有T细胞受体复合物结合活性的第二抗原结合结构域。

2.根据权利要求1所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述选择性结合活性是这样的：当抗原结合分子以添加到表达FGFR3 S249C突变体的细胞系中至少10倍高的浓度添加到表达野生型FGFR3的细胞系中时，抗原结合分子与表达FGFR3 S249C突变体的细胞系的结合类似于或大于抗原结合分子与表达野生型FGFR3的细胞系的结合，其中表达细胞系是各自以相同程度表达野生型FGFR3或FGFR3 S249C突变体的细胞系。

3.根据权利要求1或2所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述多特异性抗原结合分子具有细胞毒活性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述T细胞受体复合物结合活性为与CD3ε链的结合活性。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述FGFR3 S249C突变体结合活性是与真核细胞表面上的FGFR3 S249C突变体的结合活性。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的任一个或两者为抗体可变片段。

7.分离的多特异性抗原结合分子，其具有第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中：

(a)

第一抗原结合结构域的重链可变区包括：

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；和

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列；和

第一抗原结合结构域的轻链可变区包括：

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；

(b)

第一抗原结合结构域的重链可变区包括：

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列；和

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；和

第一抗原结合结构域的轻链可变区包括：

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列；和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或

(c)

第一抗原结合结构域的重链可变区包括：

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列；和

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列；和第一抗原结合结构域的轻链可变区包括：

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列；和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列；

并且其中：

第二抗原结合结构域的重链可变区包括：

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列；和

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列；和

第二抗原结合结构域的轻链可变区包括：

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列；和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其进一步包含具有与Fcγ受体的结合活性降低的Fc区。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其是由具有FGFR3S249C突变体结合活性的第一抗体可变片段，具有CD3ε链结合活性的第二抗体可变片段，以及对FcγR的结合活性降低的Fc区组成的双特异性抗体。

10.核酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗原结合分子。

11.载体，其中已引入根据权利要求10所述的核酸。

12.细胞，其包含根据权利要求10所述的核酸或根据权利要求11所述的载体。

13.药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性抗原结合分子。

14.与FGFR3 S249C突变体结合的分离的抗原结合分子，其对FGFR3 S249C突变体的结合活性高于对野生型FGFR3的结合活性。

15.根据权利要求1至10所述的抗原结合分子，其中，与FGFR3 S249C突变体的结合与包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID No：10对的抗体竞争，或与包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID No：10对的抗体结合相同的表位。

16.根据权利要求14或15所述的抗原结合分子，其是(a)单克隆抗体；(b)人抗体、人源化抗体或嵌合抗体；(c)IgG抗体；或(d)抗体片段。

17.分离的抗原结合分子，其包含以下组的六个HVR的任一个：

(a)

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；

(b)

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列；和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；或

(c)

HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，

HVR-H2，其包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，

HVR-H3，其包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，

HVR-L1，其包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，

HVR-L2，其包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列；和

HVR-L3，其包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。

18.根据权利要求7所述的抗原结合分子，其进一步包含：包含SEQ ID NO：39、43和47的任一氨基酸序列的重链可变结构域框架FR1；包含SEQ ID NO：40、44和48的任一氨基酸序列的重链可变结构域框架FR2；包含SEQ ID NO：41、45和49的任一氨基酸序列的重链可变结构域框架FR3；和包含SEQ ID NO：42、46和50的氨基酸序列的重链可变结构域框架FR4。

19.根据权利要求14至17中任一项所述的抗原结合分子，其包含

(a)与SEQ ID NO：5、7和9的任一氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；

(b)与SEQ ID NO：6、8和10的任一氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或

(c)SEQ ID NO：5、7和9中任一项的VH序列和SEQ ID NO：6、8和10中任一项的VL序列。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子是(a)单克隆抗体；(b)人源化或嵌合抗体；(c)人抗体；(d)全长IgG抗体；或(e)抗体片段。

21.核酸，其编码根据权利要求20所述的抗原结合分子。

22.载体，其包含根据权利要求21所述的核酸。

23.细胞，其包含根据权利要求21所述的核酸或根据权利要求22所述的载体。

Images