CN118139643A - 与PD-L1、CD137和/或TGFβ的双特异性和三特异性结合蛋白及其用途 - Google Patents

与PD-L1、CD137和/或TGFβ的双特异性和三特异性结合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开提供了结合PD‑L1和CD137(PD‑L1/CD137双特异性)的结合蛋白、结合PD‑L1和TGFβ(PD‑L1/TGFβ双特异性)的结合蛋白、结合PD‑L1、TGFβ和CD137(PD‑L1/TGFβ/CD137三特异性)的结合蛋白以及结合CD137、TGFβ和PD‑L1(CD137/TGFβ/PD‑L1三特异性)的结合蛋白。本公开还提供了包含这些结合蛋白的药物组合物及其用于治疗和/或预防癌症的方法。

Description

与PD-L1、CD137和/或TGFβ的双特异性和三特异性结合蛋白及 其用途
相关申请交叉引用
本国际专利申请要求2021年9月3日提交的美国临时专利申请第63/240,404号的权益，所述美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文中。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以XML形式代替纸质副本提供，并且据此通过引用并入说明书中。包含序列表的XLM文件的名称为122863-5008_Sequence_Listing_ST.26.xml。文本文件为约108000字节，创建于2022年8月28日左右，并且经由EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本公开属于免疫疗法领域并且涉及结合至PD-L1和CD137的结合蛋白(PD-L1/CD137双特异性)、结合PD-L1和TGFβ的结合蛋白(PD-L1/TGFβ双特异性)以及结合PD-L1、TGFβ和CD137的结合蛋白(PD-L1/TGFβ/CD137三特异性)。本公开还涉及结合至CD137、TGFβ和PD-L1的结合蛋白(CD137/TGFβ/PD-L1三特异性)。本公开还涉及编码这些结合蛋白的多核苷酸序列和产生它们的细胞。本公开进一步涉及包含这些结合蛋白的药物组合物，以及它们用于调节用于免疫疗法的PD-1/PD-L1轴和/或CD137轴的方法。
背景技术
免疫检查点是指免疫细胞为了调节和控制免疫应答的持久性同时保持自身耐受性而拥有的一组抑制途径。肿瘤微环境中免疫检查点分子(例如，PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、Lag-3、VISTA、B7-H3、TIGIT、CD73、LAIR1)的上调被认为是限制效应T细胞的抗肿瘤活性的重要机制。
程序性细胞死亡-1(PD-1)是靶向癌症免疫疗法的主要免疫T细胞受体检查点受体之一。PD-1及其配体程序性死亡配体-1和程序性死亡配体-2(分别为PD-L1和PD-L2)充当共抑制因子，其调节T细胞活化、耐受性和免疫病理学之间的平衡。在不存在癌症的情况下，PD-1/PD-L1轴用于防止正常组织中的过度炎症，并且有助于维持对自身抗原的免疫耐受性。在存在癌症的情况下，PD-1途径被破坏以在肿瘤和外周组织两者中提供肿瘤免疫抗性的主要机制。该轴被重新用于通过增强肿瘤细胞存活率来促进癌症发展和进展。
PD-l配体、PD-L1(也被称为分化簇274(CD274))或B7同源物1(B7-H1)和PD-L2(也被称为B7-DC或CD273))通常在树突状细胞或巨噬细胞的表面上表达。PD-L1也在肿瘤细胞上或在肿瘤微环境(TME)中的未转化的细胞上过表达。PD-1与PD-L1的相互作用导致T细胞受体(TCR)信号传导和CD28共刺激的抑制，并且最终导致T细胞失活和增殖能力丧失。肿瘤微环境中的PD-L1表达允许癌细胞利用PD-1/PD-L1检查点途径作为逃避机制，以防止或避免患者的抗原特异性T细胞免疫应答。
PD-1受体或其配体与抗体的阻断剥夺了癌细胞的逃避策略，并且增强或促进抗肿瘤免疫应答。迄今为止，六种PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂(ICI)已经获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准：三种PD-1抑制剂(纳武单抗、帕博利珠单抗和西米普利单抗)和三种PD-L1抑制剂(阿替利珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。
用治疗性单克隆抗体来消除免疫应答的PD-1/PD-L1检查点抑制的癌症免疫疗法已经彻底改变了各种恶性肿瘤的治疗。然而，一些初始应答者最终发展对单一疗法的获得性抗性并经历复发性疾病，并且大量患者表现出原发性抗性并且对PD-1/PD-L1免疫检查点阻断没有应答。鉴于检查点抑制剂疗法抗性的报道普遍存在，对于难治性或复发性癌症患者存在对额外治疗剂的未满足的需求。
CD137(4-1BB或TNFRSF9)是TNF受体超家族的成员。CD137在先天免疫细胞和适应性免疫细胞两者上表达。它在肿瘤微环境(TME)中起多方面的作用。它在TME中的T细胞上普遍上调，并且提供对CD8和CD4 T细胞活化、增殖和存活的共刺激。它还调节TME中的其他细胞功能，如促进NK细胞以与CD8 T细胞相互作用，增强DC细胞上的肿瘤抗原呈递。CD137激动剂可以增强抗肿瘤免疫应答，并且可以与其他抗肿瘤剂协同起作用，包括PD1/PD-L1阻断抗体。
TGFβ的分泌是免疫逃避和肿瘤进展的另一个主要促成因素。TGFβ通过防止T细胞增殖并降低T细胞和NK细胞两者的效应子功能来促进肿瘤进展和免疫抑制。它还增强了T调节细胞的功能并诱导上皮到间充质转变(EMT)。
由于PD1、CD137和TGFβ调节独立的免疫抑制或免疫刺激途径，因此可能的是，靶向PD1和CD137、PD1和TGFβ，或靶向PD1、CD137和TGFβ将增加抗肿瘤功效，特别是对于免疫排斥肿瘤和免疫沙漠肿瘤。
发明内容
本公开通过提供多特异性结合蛋白来解决上述需求，所述多特异性结合蛋白包括例如结合PD-L1和CD137的结合蛋白(PD-L1/CD137双特异性)、结合PD-L1和TGFβ的结合蛋白(PD-L1/TGFβ双特异性)以及结合PD-L1、TGFβ和CD137的结合蛋白(PD-L1/TGFβ/CD137三特异性)。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性是结合PD-L1和CD137并且包含以下的结合蛋白：(a)呈IgG形式的抗体支架模块(例如，包含两条重链和两条轻链的Y形对称或不对称抗体)，所述抗体支架模块包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合PD-L1的第二抗原结合位点；(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合CD137的第三抗原结合位点。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性是结合PD-L1和TGFβ并且包含以下的结合蛋白：(a)呈IgG形式的抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合PD-L1的第二抗原结合位点；(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ的第三抗原结合位点。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性是包含以下的结合蛋白：(a)呈IgG形式的抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合PD-L1的第二抗原结合位点；(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ的第三抗原结合位点；以及(c)至少一个第二结合模块，所述至少一个第二结合模块包含结合CD137的第四抗原结合位点。
本公开还涉及结合人CD137的结合蛋白，包括结合CD137、TGFβ和PD-L1的结合蛋白(CD137/TGFβ/PD-L1三特异性)。更具体地，本公开涉及结合CD137的结合蛋白及其用于刺激CD137并促进持久的抗肿瘤免疫应答的用途。在示例性的实施方案中，结合蛋白可以结合CD137并且包含呈IgG形式的抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合CD137的第一抗原结合位点和结合CD137的第二抗原结合位点。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性是包含以下的结合蛋白：(a)呈IgG形式的抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合CD137的第一抗原结合位点和结合CD137的第二抗原结合位点；(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ的第三抗原结合位点；以及(c)至少一个第二结合模块，所述至少一个第二结合模块包含结合PD-L1的第四抗原结合位点。
尽管免疫疗法的进展归因于PD-1/PD-L1阻断剂的使用，但对结合蛋白存在需求，所述结合蛋白可以结合PD-L1和T细胞上的共刺激靶标和/或通过中和TGFβ在肿瘤微环境中逆转免疫抑制。三种TGFβ同种型TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3在许多肿瘤中高度表达，这主要通过抑制先天免疫***和适应性免疫***两者来促进癌症进展。并且其血清浓度与不良预后相关。在肿瘤微环境中，TGFβ通过基质修饰、血管生成和上皮-间质转变(EMT)的诱导来促进肿瘤进展。TGFβ信号传导诱导Treg细胞的分化并且通过髓样细胞驱动转移。此外，TGFβ1可以直接抑制T细胞和NK细胞功能。
结合蛋白可以同时结合单个抗原或多于一个靶抗原的两个或三个表位，允许通过单特异性治疗性抗体或融合蛋白无法实现的多种机制功能和潜在协同效应。有利地，与使用多种治疗剂相关的风险相比，使用结合两种或三种抗原的结合蛋白可以具有较低的毒性风险。
从广义上讲，本文公开的所公开的双特异性和三特异性基于具有或不具有修饰以促进重链异二聚化的天然IgG支架，并且特征在于两种或三种结合特异性(例如，PD-L1、CD137和/或TGFβ)由源自抗体Fab或scFv片段和/或融合蛋白的抗原结合位点贡献，所述融合蛋白由附着到IgG支架中的IgG重链或轻链的N末端或C末端的TGFβRII受体的胞外结构域(ECD)制备。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性、PD-L1/TGFβ双特异性或PD-L1/TGFβ/CD137三特异性单独地或组合地表现出以下结构特征中的一种或多种：
(a)具有scFv形式的抗CD137，
(b)具有scFv形式的抗PD-L1，
(c)具有在IgG支架中的抗体轻链的N末端处融合的scFv，
(d)具有在IgG支架中的抗体重链的N末端处融合的scFv，
(e)具有在IgG支架中的抗体轻链的C末端处融合的scFv，
(f)具有在IgG支架中的抗体重链的C末端处融合的scFv，
(g)具有以单价或二价形式存在的CD137的scFv，
(h)包含在IgG支架中的轻链的C末端处融合的人TGFβRII，或
(i)包含在IgG支架中的重链的C末端处融合的人TGFβRII。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性、PD-L1/TGFβ双特异性和PD-L1/TGFβ/CD137三特异性提供了靶向耗竭的PD-1+CD8 T细胞并使功能失调的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)恢复活力的免疫疗法。结合PD-L1的此类结合蛋白作为实体瘤中的治疗剂可能是特别有益的，所述实体瘤的特征在于富含耗竭的TCD8+细胞和/或有助于PD-1/PD-L1抗性的调节性T细胞的微环境。在实践中，阻断PD-1/PD-L1信号传导轴减少了存在于TME中的免疫抑制信号并增强了抗肿瘤免疫，这继而产生持久的临床应答，从而延长患者存活。
在一些实施方案中，所公开的结合PD-L1的结合蛋白是对PD-L1和CD137或人TGFβ具有特异性的双特异性四价分子。
在其他实施方案中，所公开的结合PD-L1的结合蛋白是对PD-L1以及CD137和人TGFβ两者具有特异性的分子。
在一些实施方案中，所公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性被设计成提供靶向在肿瘤微环境中表达CD137的免疫细胞的免疫疗法。结合CD137的结合蛋白作为实体瘤中的治疗剂可能是特别有益的。在实践中，激活CD137信号传导轴将增强TME中存在的效应T功能并增强抗肿瘤免疫，这继而可以产生持久的临床应答，从而延长患者存活。
在其他实施方案中，所公开的结合蛋白结合CD137以及PD-L1和人TGFβ两者。
根据一些实施方案，所公开的结合PD-L1的结合蛋白包含一组六个互补决定区(CDR)序列，所述一组六个互补决定区序列选自由以下组成的组：选自SEQ ID NO:1和3的抗PD-L1抗体重链(HC)可变区序列的三个CDR以及选自SEQ ID NO:2和4的轻链可变区序列的三个CDR。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ ID NO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ IDNO:15。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列，或其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
在其他实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列或其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
在其他实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白包含选自以下组合的重链可变区序列和轻链可变区序列：
(a)包含SEQ ID NO:1的重链可变区序列和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区序列；或
(b)包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列和包含SEQ ID NO:4的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白包含：
(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ IDNO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10；或
(b)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ IDNO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQID NO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:15。
在一些实施方案中，提供了一种结合PD-L1的结合蛋白，其中第一抗原结合位点和第二抗原结合位点结合PD-L1，并且其中抗体支架模块包含：
(i)如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列；或
(ii)如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，提供了一种结合PD-L1的结合蛋白，其中第一抗原结合位点和第二抗原结合位点结合PD-L1，并且其中抗体支架模块包含：
如SEQ ID NO:45中所示的重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的轻链序列。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白包含表1中公开的一个或多个重链可变区CDR和/或表2中公开的一个或多个轻链可变区CDR。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白单独地或组合地表现出以下结构和功能特征中的一种或多种：
(a)对人PD-L1具有特异性，
(b)与食蟹猴PD-L1交叉反应，
(c)破坏PD-1和PD-L1的相互作用，或
(d)去抑制PD-1/PD-L1检查点介导的T细胞抑制。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白特异性地结合至表达PD-L1的内源水平的人细胞和被工程改造为过表达人PD-L1的宿主细胞。结合PD-L1的结合蛋白还可以以亚纳摩尔EC50值结合至过表达人或cyno PD-L1的细胞。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白与食蟹猴PD-L1(cynoPD-L1)交叉反应，并且不表现出与小鼠PD-L1(mu-PD-L1)的交叉反应性结合。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白破坏人PD-1/PD-L1结合相互作用。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白去抑制PD-1/PD-L1检查点介导的T细胞抑制。
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白进一步包含Fc区，所述Fc区被工程改造以消除/最小化与FcγR的交联活性，该FcγR沉默或消除T细胞的Fc介导的效应子功能。
本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码结合PD-L1的上述结合蛋白中的至少一种。
本公开还提供了载体，其包含上述多核苷酸序列中的至少一个。
本公开还提供了细胞，其包含上述多核苷酸序列之一或上述载体之一。
本公开还提供了药物组合物，其包含结合PD-L1的结合蛋白中的至少一种，以及任选地药学上可接受的稀释剂、载剂、媒介物和/或赋形剂或由其组成。此类药物组合物可以用于治疗癌症。
本公开还涉及用于治疗患者中的癌症的方法，其包括单独或与另一种治疗剂组合向患者施用治疗有效量的所公开的结合PD-L1的结合蛋白中的至少一种。
根据一些实施方案，结合CD137的结合蛋白包含选自由以下组成的组的一组六个互补决定区(CDR)序列：选自SEQ ID NO:16、18和20的抗CD137抗体重链(HC)可变区序列的三个CDR和选自SEQ ID NO:17、19和21的轻链可变区序列的三个CDR。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:22和CDR3：SEQ ID NO:23；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:24、CDR2：SEQ ID NO:25和CDR3：SEQ IDNO:26。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:27、CDR2：SEQ ID NO:28和CDR3：SEQ ID NO:29；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:30、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ IDNO:31。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:32、CDR2：SEQ ID NO:33和CDR3：SEQ ID NO:34；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:35、CDR2：SEQ ID NO:36和CDR3：SEQ IDNO:37。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白包含如SEQ ID NO:16、18或20中所示的重链可变区序列，或其与SEQ ID NO:16、18或20具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
在其他实施方案中，结合CD137的结合蛋白包含如SEQ ID NO:17、19或21中所示的轻链可变区序列，或者与SEQ ID NO:17、19或21具有至少90％序列同一性的其类似物或衍生物。
在其他实施方案中，结合CD137的结合蛋白包含如SEQ ID NO:16、18或20中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:17、19或21中所示的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，结合的结合蛋白包含选自以下组合的重链可变区序列和轻链可变区序列：
(a)包含SEQ ID NO:16的重链可变区序列和包含SEQ ID NO:17的轻链可变区序列；
(b)包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和包含SEQ ID NO:19的轻链可变区序列；以及
(c)包含SEQ ID NO:20的重链可变区序列和包含SEQ ID NO:21的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，提供了一种结合CD137的结合蛋白，其包含：
(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ IDNO:22和CDR3：SEQ ID NO:23；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQID NO:24、CDR2：SEQ ID NO:25和CDR3：SEQ ID NO:26；
(b)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:27、CDR2：SEQ IDNO:28和CDR3：SEQ ID NO:29；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQID NO:30、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:31；或
(c)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:32、CDR2：SEQ IDNO:33和CDR3：SEQ ID NO:34；和/或轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQID NO:35、CDR2：SEQ ID NO:36和CDR3：SEQ ID NO:37。
在一些实施方案中，提供了一种结合CD137的结合蛋白，其中第一抗原结合位点和第二抗原结合位点结合CD137，并且其中抗体支架模块包含：
(i)如SEQ ID NO:16中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列；
(ii)如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列；或
(iii)如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，提供了一种结合CD137的结合蛋白，其中第一抗原结合位点和第二抗原结合位点结合CD137，并且其中抗体支架模块包含如SEQ ID NO:75中所示的重链序列和如SEQ ID NO:76中所示的轻链序列。
在一些实施方案中，抗CD137抗体包含表3中公开的一个或多个重链可变区CDR和/或表4中公开的一个或多个轻链可变区CDR。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白单独地或组合地表现出以下结构和功能特征中的一种或多种：
(a)对人CD137具有特异性，
(b)与食蟹猴CD137交叉反应，
(c)破坏(例如，减少或防止)人CD137L与CD137的结合，
(d)对CD137表现出快速开启和快速关闭的性质；
(e)对CD137信号传导具有交联依赖性激动活性，或
(f)以交联依赖性方式激活T细胞。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白特异性地结合至表达CD137的内源水平的人细胞和被工程改造为过表达人CD137的宿主细胞。在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白以在0.2至1.1nM范围内(例如，0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM或1.1nM)的EC50值结合至过表达人或cyno CD137的细胞。
在一些实施方案中，结合至CD137的结合蛋白具有快速开启和快速关闭的动力学性质。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白与食蟹猴CD137(cynoCD137)交叉反应，并且不表现出与小鼠CD137(mu-CD137)的交叉反应性结合。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白破坏CD137配体/CD137结合相互作用。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白对CD137信号传导具有交联依赖性激动活性。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白以交联依赖性方式激活T细胞。
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白进一步包含Fc区，所述Fc区被工程改造以消除/最小化与FcγR的交联活性，所述FcγR沉默或消除T细胞的Fc介导的效应子功能。
本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码结合CD137的上述结合蛋白中的至少一种。
本公开还提供了载体，其包含上述多核苷酸序列中的至少一个。
本公开还提供了细胞，其包含上述多核苷酸序列之一或上述载体之一。
本公开还提供了药物组合物，其包含结合CD137的结合蛋白中的至少一种，以及任选地药学上可接受的稀释剂、载剂、媒介物和/或赋形剂或由其组成。此类药物组合物可以用于治疗癌症。
本公开还涉及用于治疗患者中的癌症的方法，其包括单独或与另一种治疗剂组合向患者施用治疗有效量的所公开的结合CD137的结合蛋白中的至少一种。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性是这样的结合蛋白，所述结合蛋白结合PD-L1和CD137，并且包含：(a)呈IgG形式的抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合PD-L1的第二抗原结合位点；(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合CD137的第三抗原结合位点。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ IDNO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ ID NO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:15。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块包含如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块包含如SEQ IDNO:1中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块包含如SEQ IDNO:1中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列、如SEQID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块包含如SEQ IDNO:42中所示的重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的轻链序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:45中所示的重链序列和如SEQ IDNO:40中所示的轻链序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性具有一个第一结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性具有两个第一结合模块。在示例性的实施方案中，所述PD-L1/CD137双特异性具有抗体支架模块，所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端、抗体支架模块轻链序列的C末端、抗体支架模块重链序列的N末端、抗体支架模块轻链序列的N末端，或其组合，任选地其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块直接或通过链间接头彼此共价连接。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的第一结合模块和抗体支架模块通过链间接头彼此共价连接，并且链间接头是从N末端至C末端如SEQ ID NO:58所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的第一结合模块和抗体支架模块通过链间接头彼此共价连接，并且链间接头是从N末端至C末端如SEQ ID NO:59所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，当在PD-L1/CD137双特异性中存在多于一个第一结合模块时，每个第一结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或抗体支架模块的不同端。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块是scFv，其包含重链可变区序列和轻链可变序列，其中所述序列直接或通过scFv融合接头彼此共价连接。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含甘氨酸和丝氨酸。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含序列Gly-Gly-Gly-Ser。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含如SEQ IDNO:58中所示的序列。在示例性的实施方案中，scFv融合接头是如SEQ ID NO:58中所示的序列。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含如SEQ ID NO:59中所示的序列。在示例性的实施方案中，scFv融合接头是如SEQ ID NO:59中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块包含如SEQ ID NO:53中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块包含如SEQ ID NO:54中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块包含如SEQ ID NO:55中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块包含如SEQ IDNO:56中所示的序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块从N末端至C末端包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:22和CDR3：SEQ ID NO:23；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:24、CDR2：SEQ ID NO:25和CDR3：SEQ ID NO:26。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块从N末端至C末端包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:27、CDR2：SEQ ID NO:28和CDR3：SEQ ID NO:29；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:30、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:31。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块从N末端至C末端包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:32、CDR2：SEQ ID NO:33和CDR3：SEQ ID NO:34；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:35、CDR2：SEQ ID NO:36和CDR3：SEQ ID NO:37。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:16中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性中的第一结合模块从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性从N末端至C末端包含：如SEQ IDNO:38中所示的抗体支架模块的重链序列和第一结合模块；以及如SEQ ID NO:40中所示的抗体支架模块的轻链序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:44中所示的抗体支架模块的重链序列和第一结合模块；以及如SEQ IDNO:40中所示的抗体支架模块的轻链序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:45中所示的抗体支架模块的重链序列；以及如SEQ IDNO:46中所示的抗体支架模块的轻链序列和第一结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:47中所示的抗体支架模块的重链序列和第一结合模块；以及如SEQ ID NO:40中所示的抗体支架模块的轻链序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:50中所示的抗体支架模块的重链序列和第一结合模块；以及如SEQ ID NO:40中所示的抗体支架模块的轻链序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块进一步包含恒定区。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块的恒定区包含至少一个Fc沉默突变。在示例性的实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块的恒定区中的Fc沉默突变是L234AL235A或N297A。在示例性实施方案中，PD-L1/CD137双特异性的抗体支架模块的恒定区包含杵臼(KiH)突变。
根据一些实施方案，PD-L1/CD137双特异性(例如，1923Ab8、1923Ab11、1923Ab12、1923Ab13和1923Ab18)能够有效地阻断PD-L1与其受体PD-1之间以及CD137与其配体之间的相互作用。所公开的PD-L1/CD137双特异性包含作为PD-L1抗体支架模块的源自本文公开的结合PD-L1的结合蛋白之一(例如1923Ab2或1923Ab3)的氨基酸序列和作为CD137第一结合模块的源自本文公开的结合CD137的结合蛋白之一(例如1923Ab4、1923Ab5或1923Ab6)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性包含结合PD-L1并且破坏PD-1/PD-L1结合相互作用并且去抑制PD-1/PD-L1检查点介导的T细胞抑制的结合蛋白。如本文所例示，在非限制性实例中，结合PD-L1的抗体支架模块可以包含单链可变片段(例如，结合PD-L1的所公开的结合蛋白之一的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与接头肽连接)(scFv)。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性包含CD137结合模块，所述CD137结合模块由源自结合CD137的所公开的结合蛋白之一的片段组成。在一个实施方案中，CD137结合模块可以呈源自结合本文公开的CD137的结合蛋白之一的结合片段的形式。如本文所例示，在非限制性实例中，CD137结合模块可以包含单链可变片段(例如，结合CD137的所公开的结合蛋白之一的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与接头肽连接)。可替代地，CD137结合模块可以呈IgG分子的形式。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab8包含抗体支架模块，所述抗体支架模块具有来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、包含具有L234A L235A突变的两个Fc恒定链的人IgG1 Fc(SEQ ID NO:61)，以及连接至两条Fc恒定链中的每一条的C末端的源自1923Ab4的scFv片段(VH在VL之前)(SEQ ID NO:53)。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab11包含抗体支架模块，所述抗体支架模块具有来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、包含具有L234A L235A突变的两个Fc恒定链的人IgG1 Fc(SEQ ID NO:61)以及连接至两条Fc恒定链中的每一条的C末端的源自1923Ab4的scFv片段(VL在VH之前)(SEQ ID NO:54)。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab12包含抗体支架模块，所述抗体支架模块具有来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、包含具有L234A L235A突变的两个恒定链的人IgG1 Fc(SEQ ID NO:61)和二硫键稳定的scFv片段(VH在VL之前)(SEQ ID NO:56)，所述片段源自连接至Fab中的每条轻链的N末端的1923Ab4。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab13包含抗体支架模块，所述抗体支架模块具有来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、包含具有L234A L235A突变的两个恒定链的人IgG1 Fc(SEQ ID NO:61)以及连接至Fab中的每条重链的N末端的源自1923Ab4的二硫键稳定的scFv片段(VH在VL之前)(SEQ ID NO:56)。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab18包含抗体支架模块，所述抗体支架模块具有来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、包含具有L234A L235A突变的两个Fc恒定链的人IgG1 Fc(SEQ ID NO:61)以及连接至每个Fc恒定链的C末端的源自1923Ab4的二硫键稳定的scFv片段(VH在VL之前)(SEQ ID NO:55)。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性包含选自以下组合的可变重链序列和可变轻链序列：
(a)包含SEQ ID NO:38的重链序列和包含SEQ ID NO:40的轻链序列；
(b)包含SEQ ID NO:44的重链序列和包含SEQ ID NO:40的轻链序列；
(c)包含SEQ ID NO:45的重链序列和包含SEQ ID NO:46的轻链序列；
(d)包含SEQ ID NO:47的重链序列和包含SEQ ID NO:40的轻链序列；以及
(e)包含SEQ ID NO:50的重链序列和包含SEQ ID NO:40的轻链序列。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性包含选自由以下组成的组的重链序列：SEQ ID NO:38、42、44、45、47和50或其与SEQ ID NO:38、42、44、45、47或50具有至少90％序列同一性的片段。
在其他实施方案中，PD-L1/CD137双特异性包含选自由SEQ ID NO:40和46组成的组的轻链序列或其与SEQ ID NO:40或46具有至少90％序列同一性的片段衍生物。
在一些实施方案中，CD137结合模块是scFv亚基，其阻断CD137/CD137配体相互作用，并且对CD137信号传导和T细胞活化具有交联依赖性激动活性。在一些实施方案中，CD137结合模块是用二硫键稳定的scFv亚基。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性包含具有IgG形式的抗体支架模块，其中CD137 scFv结合模块融合至抗体支架模块的重链或轻链的C末端以产生PD-L1/CD137双特异性。
在一些实施方案中，所公开的PD-L1/CD137双特异性进一步包含Fc区，所述Fc区被工程改造以消除/最小化与FcγR的交联活性，所述FcγR沉默或消除T细胞的Fc介导的效应子功能。
本公开还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的PD-L1/CD137双特异性中的至少一种，以及任选地药学上可接受的稀释剂、载剂、媒介物和/或赋形剂或由其组成。此类药物组合物可以用于治疗癌症。
本公开还涉及用于治疗患者中的癌症的方法，其包括单独或与另一种治疗剂组合向患者施用治疗有效量的所公开的PD-L1/CD137双特异性中的至少一种。
本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文所述的PD-L1/CD137双特异性中的至少一个。本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文所述的PD-L1/CD137双特异性序列中的至少一个。
本公开还提供了载体，其包含本文所述的PD-L1/CD137双特异性的多核苷酸。
本公开还提供了载体，其包含本文所述的PD-L1/CD137双特异性多核苷酸序列中的至少一个。
本公开还提供了细胞，其包含本文所述的PD-L1/CD137双特异性多核苷酸序列之一或上述载体之一。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性是这样的结合蛋白，所述结合蛋白结合PD-L1和TGFβ并且包含：(a)呈IgG形式的抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合PD-L1的第二抗原结合位点；(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ的第三抗原结合位点。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ IDNO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ ID NO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:15。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列、如SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:42中所示的重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的轻链序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:45中所示的重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的轻链序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性具有一个第一结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性具有两个第一结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性具有抗体支架模块，所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端、抗体支架模块轻链序列的C末端、抗体支架模块重链序列的N末端、抗体支架模块轻链序列的N末端，或其组合，任选地其中第一结合模块和抗体支架模块直接或通过链间接头彼此共价连接。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的第一结合模块和抗体支架模块通过链间接头彼此共价连接，并且链间接头是从N末端至C末端如SEQ ID NO:58所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的第一结合模块和抗体支架模块通过链间接头彼此共价连接，并且链间接头是从N末端至C末端如SEQ ID NO:59所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，当在PD-L1/TGFβ双特异性中存在多于一个第一结合模块时，每个第一结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或抗体支架模块的不同端。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性中的第一结合模块包含TGFβRII的胞外结构域。在示例性的实施方案中，TGFβRII序列的胞外结构域在SEQ ID NO:67中示出。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性具有两个第一结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块的重链序列和第一结合模块包含如SEQ ID NO:51中所示的序列；并且其中PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块的轻链序列包含从N末端至C末端如SEQ ID NO:40中所示的序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块进一步包含恒定区。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块的恒定区包含至少一个Fc沉默突变。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块的恒定区中的Fc沉默突变是L234A L235A或N297A。在一个示例性实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性的抗体支架模块的恒定区包含杵臼(KiH)突变。
根据一些实施方案，本公开提供了能够有效地阻断PD-L1与其受体PD-1和螯合物TGFβ之间的相互作用的PD-L1/TGFβ双特异性(例如1923Ab20)。所公开的PD-L1/TGFβ双特异性包含作为PD-L1抗体支架模块的源自结合本文所公开的PD-L1的结合蛋白之一(例如，1923Ab2或1923Ab3)的氨基酸序列的全部或一部分，以及包含TGFβRII的全长胞外结构域或TGFβRII的截短(例如，N末端或C末端截短)的氨基酸序列，条件是序列可以结合并中和TGFβ的生物活性。在一些实施方案中，附加到结合PD-L1的结合蛋白的第一结合模块是源自人TNFβRII受体的ECD的重组TGFβ结合蛋白。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性1923Ab20包含抗体支架模块，所述抗体支架模块具有来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有带有L234A L235A突变的两个Fc恒定链的人IgG1 Fc(SEQ ID NO:61)以及编码TGFβRII的胞外结构域(SEQ ID NO:67)的两个多肽，每个多肽各自连接至每个Fc恒定链的C末端。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性包含表5中公开的重链和/或轻链序列。在其他实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性包含表6中公开的重链和/或轻链序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性包含包含SEQ ID NO:51的重链序列和包含SEQ ID NO:40的轻链序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性包含选自由以下组成的组的重链序列：SEQ ID NO:42、45和51或其与SEQ ID NO:42、45或51具有至少90％序列同一性的片段。
在其他实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ ID NO:39和40或其与SEQ ID NO:39和40具有至少90％序列同一性的片段衍生物。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性单独地或组合地表现出以下特征中的一种或多种：
(a)对人PD-L1具有特异性并且结合人TGFβ；
(b)与食蟹猴PD-L1交叉反应；
(c)破坏PD-1和PD-L1的相互作用；
(d)去抑制T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号；或
(e)螯合人TGFβ；
本公开还提供了药物组合物，其包含本文公开的PD-L1/TGFβ双特异性中的至少一种，以及任选地药学上可接受的稀释剂、载剂、媒介物和/或赋形剂或由其组成。此类药物组合物可以用于癌症的基于抗体的免疫疗法。
本公开还涉及用于治疗患者中的癌症的方法，其包括单独或与另一种治疗剂组合向患者施用治疗有效量的所公开的PD-L1/TGFβ双特异性中的至少一种。
本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文所述的PD-L1/TGFβ双特异性中的至少一种。本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文所述的PD-L1/TGFβ双特异性序列中的至少一个。
本公开还提供了载体，其包含本文所述的PD-L1/TGFβ双特异性的多核苷酸。
本公开还提供了载体，其包含本文所述的PD-L1/TGFβ双特异性多核苷酸序列中的至少一个。
本公开还提供了细胞，其包含本文所述的PD-L1/TGFβ双特异性多核苷酸序列之一或上述载体之一。
本公开还提供了一种结合PD-L1、TGFβ和CD137的结合蛋白，所述结合蛋白包含：(a)呈IgG形式的抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合PD-L1的第二抗原结合位点；(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ的第三抗原结合位点；以及(c)至少一个第二结合模块，所述至少一个第二结合模块包含结合CD137的第四抗原结合位点。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性以重组蛋白的形式构建，所述重组蛋白包含结合PD-L1的抗体支架模块、包含源自TGFβ受体II结合蛋白的氨基酸序列的第一结合模块(所述TGFβ受体II结合蛋白能够结合至人TGFβ并中和其活性)，以及结合CD137的第二结合模块。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ ID NO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:15。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块包含如SEQID NO:1或SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块包含如SEQID NO:1中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块包含如SEQID NO:1中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块包含如SEQID NO:42中所示的重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的轻链序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:45中所示的重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的轻链序列。
在示例性实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有一个第一结合模块。在示例性实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有两个第一结合模块。在示例性的实施方案中，所述PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有抗体支架模块，所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中该抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的C末端、抗体支架模块轻链序列的C末端、抗体支架模块重链序列的N末端、抗体支架模块轻链序列的N末端，或其组合，任选地其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块直接或通过第一结合模块链间接头彼此共价连接。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一结合模块和抗体支架模块通过第一结合模块链间接头彼此共价连接，并且第一结合模块链间接头是从N末端至C末端如SEQ ID NO:58所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一结合模块和抗体支架模块通过第一结合模块链间接头彼此共价连接，并且第一结合模块链间接头是从N末端至C末端如SEQ ID NO:59所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，当在PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中存在多于一个第一结合模块时，每个第一结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或抗体支架模块的不同端。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的第一结合模块包含TGFβRII的胞外结构域。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的TGFβRII的胞外结构域包含如SEQ ID NO:67中所示的序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的第二结合模块是scFv，其包含重链可变区序列和轻链可变序列，其中所述序列直接或通过scFv融合接头彼此共价连接。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含甘氨酸和丝氨酸。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含序列Gly-Gly-Gly-Ser。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含如SEQ ID NO:58中所示的序列。在示例性的实施方案中，scFv融合接头是如SEQ ID NO:58中所示的序列。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含如SEQ ID NO:59中所示的序列。在示例性的实施方案中，scFv融合接头是如SEQ ID NO:59中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的第二结合模块包含如SEQ ID NO:53中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的第二结合模块包含如SEQ IDNO:54中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的第二结合模块包含如SEQ ID NO:55中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的第二结合模块包含如SEQ ID NO:56中所示的序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有一个第二结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有两个第二结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有抗体支架模块，所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的C末端、抗体支架模块轻链序列的C末端、抗体支架模块重链序列的N末端、抗体支架模块轻链序列的N末端，或其组合，任选地其中所述第二结合模块和所述抗体支架模块直接或通过第二结合模块链间接头彼此共价连接。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块和抗体支架模块通过第二结合模块链间接头彼此共价连接，并且第二结合模块链间接头在SEQ ID NO:58中示出。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块和抗体支架模块通过第二结合模块链间接头彼此共价连接，并且第二结合模块链间接头在SEQ IDNO:59中示出。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端，并且PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端，并且PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。
在示例性的实施方案中，当在PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中存在多于一个第二结合模块时，每个第二结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或抗体支架模块的不同端(例如，一个结合模块可以连接至抗体支架模块中的重链的C末端，而另一个结合模块可以连接至同一条重链的N末端)。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有一个第二结合模块，并且其中所述一个第二结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有一个第二结合模块，并且其中所述一个第二结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有两个第二结合模块，并且其中一个第二结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端，并且另一个第二结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块是scFv。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:22和CDR3：SEQID NO:23；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:24、CDR2：SEQID NO:25和CDR3：SEQ ID NO:26。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:27、CDR2：SEQID NO:28和CDR3：SEQ ID NO:29；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQID NO:30、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:31。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQID NO:32、CDR2：SEQ ID NO:33和CDR3：SEQ ID NO:34；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:35、CDR2：SEQ ID NO:36和CDR3：SEQ ID NO:37。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含如SEQ ID NO:16中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含如SEQID NO:53中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含如SEQ ID NO:54中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含如SEQ ID NO:55中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的第二结合模块包含如SEQ ID NO:56中所示的序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有两个第一结合模块和两个第二结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含如SEQ ID NO:38中所示的抗体支架模块的重链序列和第二结合模块；以及如SEQ ID NO:39中所示的抗体支架模块的轻链序列和第一结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含如SEQ ID NO:50中所示的抗体支架模块的重链序列和第二结合模块；以及如SEQ IDNO:39中所示的抗体支架模块的轻链序列和第一结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含如SEQ ID NO:51中所示的抗体支架模块的重链序列和第一结合模块；以及如SEQ ID NO:52中所示的抗体支架模块的轻链序列和第二结合模块。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有两个第一结合模块和一个第二结合模块。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含：如SEQ ID NO:41中所示的抗体支架模块的重链序列和第二结合模块；如SEQ ID NO:39中所示的抗体支架模块的轻链序列和第一结合模块，抗体支架模块的重链序列包含如SEQ ID NO:42中所示的序列；抗体支架模块的轻链序列和第一结合模块包含如SEQ ID NO:39中所示的序列。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性具有以下结构：其从N末端至C末端为：抗体支架模块的重链序列和第二结合模块包含如SEQ ID NO:43中所示的序列；抗体支架模块的轻链序列和第一结合模块包含如SEQ ID NO:39中所示的序列，抗体支架模块的重链序列包含如SEQ ID NO:42中所示的序列；抗体支架模块的轻链序列和第一结合模块包含如SEQ IDNO:39中所示的序列。
在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块进一步包含恒定区。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块的恒定区包含至少一个Fc沉默突变。在示例性的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块的恒定区中的Fc沉默突变是L234A L235A或N297A。在一个示例性实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的抗体支架模块的恒定区包含杵臼(KiH)突变。
根据一些实施方案，本公开提供了PD-L1/TGFβ/CD137三特异性(例如1923Ab7、1923Ab9、1923Ab10、1923Ab17和1923Ab19)，其：1)阻断PD-L1与其受体PD-1之间的相互作用；2)对CD137信号传导具有交联依赖性激动活性和/或3)中和TGFβ的免疫抑制活性。
在一些实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含作为抗体支架模块的源自结合PD-L1的结合蛋白之一(例如，1923Ab2或1923Ab3)的氨基酸序列和作为第一结合模块的源自本文所公开的人TGFβRII受体的ECD的TGFβ结合氨基酸序列，以及作为CD137第二结合模块的源自结合本文所公开的CD137的结合蛋白之一(例如，1923Ab4、1923Ab5或1923Ab6)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含抗体支架模块，所述抗体支架模块破坏PD-1/PD-L1结合相互作用并且去抑制PD-1/PD-L1检查点介导的T细胞抑制。PD-L1抗体支架模块可以呈IgG分子的形式(例如，1923Ab7、1923Ab9、1923Ab10、1923Ab17、1923Ab19)。
在一些实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性进一步包含CD137第二结合模块，所述CD137第二结合模块阻断CD137/CD137配体相互作用并且对CD137信号传导具有激动活性。在替代的实施方案中，CD137第二结合模块可以包含scFv(例如1923Ab7、1923Ab9、1923Ab10、1923Ab17和1923Ab19)。在替代的实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性可以包含融合至PD-L1抗体支架模块的重链或轻链的C末端的第二结合模块(例如，CD137 scFv)。在替代的实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性可以包含融合至PD-L1抗体支架模块的重链或轻链的N末端的第二结合模块(例如，CD137 scFv)。
在一些实施方案中，结合CD137的第二结合模块有助于与CD137的单价结合。在替代的实施方案中，结合CD137的第二结合模块有助于与CD137的二价结合。
在一些实施方案中，第二结合模块是CD137 scFv，并且可以用二硫键稳定。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含TGFβ第一结合模块。在一些实施方案中，所公开的TGFβ第一结合模块包含人TGFβRII受体的胞外结构域。TGFβ第一结合模块用于中和肿瘤微环境中存在的TGFβ的生物活性。在替代的实施方案中，TGFβ第一结合模块包含能够与人TGFβ结合的人TNFβRII受体的截短形式(例如，N末端或C末端截短)。
在替代的实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含PD-L1抗体支架模块，其中TGFβ第一结合模块经由接头连接至PD-L1抗体支架模块的重链或轻链的C末端或N末端。
在一些实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含具有对称的分子设计的抗体支架模块(例如，1923Ab7、1923Ab17和1923Ab19)。在替代的实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的特征在于不对称设计(例如，1923Ab9和1923Ab10)。为了引导不对称的所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的重链的异二聚化，可以应用杵臼(KIH)技术。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab7包含：具有两个来自1923Ab3的Fab的PD-L1抗体支架模块；具有两个具有L234A L235A突变的Fc恒定链的人IgG1Fc(SEQ ID NO:61)；两个源自1923Ab4的CD137 scFv形式的第二结合模块(VH在VL之前)(SEQ ID NO:53)，每个第二结合模块分别连接到两个Fc恒定链的C末端；以及作为编码TGFβRII的胞外结构域的多肽的两个TGFβ第一结合模块(SEQ ID NO:67)，每个第一结合模块分别连接到Fab中每条轻链的C末端。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab9包含具有两个来自1923Ab3的Fab的PD-L1抗体支架模块；异二聚体人IgG1 Fc，所述异二聚体人IgG1 Fc具有两条具有L234A L235A突变和杵臼(KiH)突变的Fc恒定链(例如，Fc恒定链在SEQ ID NO:62和63中示出)；连接至杵Fc恒定链的C末端的源自1923Ab4的呈CD137 scFv形式的一个第二结合模块(VH在VL之前)(SEQ ID NO:53)；以及作为编码TGFβRII的胞外结构域的多肽的两个TGFβ第一结合模块(SEQ ID NO:67)，每个第一结合模块分别连接至Fab中的每条轻链的C末端。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab10包含具有两个来自1923Ab3的Fab的PD-L1抗体支架模块；异二聚体人IgG1 Fc，所述异二聚体人IgG1 Fc具有两条具有L234A L235A突变和杵臼(KiH)突变的Fc链(例如，Fc恒定链在SEQ ID NO:62和63中示出)；源自连接至杵Fc恒定链的C末端的1923Ab4的呈CD137 scFv形式的一个第二结合模块(VL在VH之前)(SEQ ID NO:54)；以及作为编码TGFβRII的胞外结构域的多肽的两个TGFβ第一结合模块(SEQ ID NO:67)，每个第一结合模块分别连接至Fab中的每条轻链的C末端。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab17包含具有来自1923Ab3的两个Fab的PD-L1抗体支架模块；具有两个具有L234A L235A突变的Fc链的人IgG1-Fc(SEQID NO:61)；衍生自1923Ab4的二硫键稳定的CD137scFv(VH在VL之前)形式的两个第二结合模块(SEQ ID NO:55)，每个第二结合模块分别连接至每条Fc链的C末端；和作为编码TGFβRII的胞外结构域的多肽的两个TGFβ第一结合模块(SEQ ID NO:67)，每个第一结合模块分别连接至Fab中的每条轻链的C末端。
在一些实施方案中，所述PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab19包含具有来自1923Ab3的两个Fab的PD-L1抗体支架模块；具有两个具有L234A L235A突变的Fc链的人IgG1-Fc(SEQ ID NO:61)；作为编码TGFβRII的胞外结构域的多肽的两个TGFβ第一结合模块(SEQ ID NO:67)，每个第一结合模块分别连接至Fab中的每条轻链的C末端；和衍生自1923Ab4的两个CD137第二结合模块二硫键稳定的ScFv(VH在VL之前)(SEQ ID NO:56)，其分别连接到每条Fc链的C末端。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含源自表7中公开的重链和/或轻链序列的PD-L1抗体支架模块。在替代的实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含根据表7配对的两条重链和轻链序列的组合。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含选自以下组合的重链序列和轻链序列：
(a)包含SEQ ID NO:38的重链序列和包含SEQ ID NO:39的轻链序列；
(b)包含SEQ ID NO:48的重链序列和包含SEQ ID NO:49的轻链序列；
(c)包含SEQ ID NO:50的重链序列和包含SEQ ID NO:39的轻链序列；以及
(d)包含SEQ ID NO:51的重链序列和包含SEQ ID NO:52的轻链序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含选自以下组合的两个不同的可变重链序列(设计成使用杵臼形式异二聚化)和可变轻链序列：(a)包含SEQ ID NO:41的第一重链序列、包含SEQ ID NO:42的第二重链序列和包含SEQ ID NO:39的轻链序列；以及(b)包含SEQ ID NO:43的第一重链序列、包含SEQ ID NO:42的第二重链序列和包含SEQ IDNO:39的轻链序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含选自由以下组成的组的重链序列：SEQ ID NO:38、41、42、43、48、50和51或其与SEQ ID NO:38、41、42、43、48、50或51具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
在其他实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性包含选自由以下组成的组的轻链序列：SEQ ID NO:39、49和52或其与SEQ ID NO:39、49或52具有至少90％序列同一性的类似物或衍生物。
在一些实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性进一步包含Fc区，所述Fc区被工程改造以消除/最小化与FcγR的交联活性，该FcγR沉默或消除T细胞的Fc介导的效应子功能。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性单独地或组合地表现出以下功能特征中的一种或多种：
(a)能够与人PD-L1、CD137和TGFβ结合；
(b)与食蟹猴PD-L1和CD137交叉反应；
(c)破坏(例如，减少或防止)PD-1和PD-L1的相互作用；
(d)破坏(例如，减少或防止)人CD137L与CD137的结合；(e)表现出对CD137的快速开启和快速关闭的性质；
(f)去抑制T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号；
(g)抑制TGFβ信号传导并中和其生物活性；
(h)对CD137信号传导具有PD-L1依赖性激动活性；
(i)以PD-L1依赖性方式激活T细胞；以及
(j)通过激活CD8 T细胞来杀死表达PD-L1的肿瘤细胞。
本公开还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的至少一种，以及任选地药学上可接受的稀释剂、载剂、媒介物和/或赋形剂或由其组成。此类药物组合物可以用于治疗癌症。
本公开还涉及用于治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括单独或与另一种治疗剂组合向患者施用治疗有效量的本文公开的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的至少一种。
本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文所述的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性中的至少一个。本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文所述的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性序列中的至少一个。
本公开还提供了载体，其包含本文所述的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的多核苷酸。
本公开还提供了载体，其包含本文所述的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性多核苷酸序列中的至少一个。
本公开还提供了细胞，其包含本文所述的PD-L1/TGFβ/CD137三特异性多核苷酸序列之一或上述载体之一。
本公开还提供了一种结合CD137、TGFβ和PD-L1的结合蛋白，所述结合蛋白包含：(a)呈IgG形式的抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合CD137的第一抗原结合位点和结合CD137的第二抗原结合位点；(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ的第三抗原结合位点；以及(c)至少一个第二结合模块，所述至少一个第二结合模块包含结合PD-L1的第四抗原结合位点。在一些实施方案中，本公开还提供了以重组蛋白的形式构建的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性，所述重组蛋白包含结合CD137的抗体支架模块；包含源自TGFβ受体II结合蛋白的氨基酸序列的第一结合模块，所述TGFβ受体II结合蛋白能够结合至人TGFβ并中和其活性；以及结合PD-L1的第二结合模块。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:22和CDR3：SEQ ID NO:23；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:24、CDR2：SEQ ID NO:25和CDR3：SEQ ID NO:26。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:27、CDR2：SEQ ID NO:28和CDR3：SEQ ID NO:29；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:30、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:31。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQID NO:32、CDR2：SEQ ID NO:33和CDR3：SEQ ID NO:34；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:35、CDR2：SEQ ID NO:36和CDR3：SEQ ID NO:37。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含如SEQID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列。在示例性实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:21中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含如SEQID NO:16中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含如SEQID NO:16中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQID NO:66中所示的轻链恒定区序列。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列、如SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列、如SEQ IDNO:21中所示的轻链可变区序列和如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
在示例性实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架部分包含如SEQ IDNO:75中所示的重链序列和如SEQ ID NO:76中所示的轻链序列。
在示例性实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有一个第一结合模块。在示例性实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有两个第一结合模块。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有抗体支架模块，所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的C末端、抗体支架模块轻链序列的C末端、抗体支架模块重链序列的N末端、抗体支架模块轻链序列的N末端，或其组合，任选地其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块直接或通过第一结合模块链间接头彼此共价连接。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一结合模块和抗体支架模块通过第一结合模块链间接头彼此共价连接，并且第一结合模块链间接头在SEQ ID NO:58中示出。在一个示例性实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一结合模块和抗体支架模块通过如SEQ ID NO:59中所示的第一结合模块链间接头彼此共价连接。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，当在CD137/TGFβ/PD-L1三特异性中存在多于一个第一结合模块时，每个第一结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或抗体支架模块序列的不同端。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性中的第一结合模块包含TGFβRII的胞外结构域。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性中的TGFβRII的胞外结构域包含如SEQ ID NO:67中所示的序列。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性中的第二结合模块是scFv，其包含重链可变区序列和轻链可变序列，其中所述序列直接或通过scFv融合接头彼此共价连接。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含甘氨酸和丝氨酸。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含序列Gly-Gly-Gly-Ser。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含如SEQ ID NO:58中所示的序列。在示例性的实施方案中，scFv融合接头是如SEQ ID NO:58中所示的序列。在示例性的实施方案中，scFv融合接头包含如SEQ ID NO:59中所示的序列。在CD137抗体提供支架部分的示例性CD137/TGFβ/PD-L1三特异性实施方案中，第二结合模块是结合至包含SEQ ID NO:57的PD-L1的scFv。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有一个第二结合模块。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有两个第二结合模块。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的C末端、抗体支架模块轻链序列的C末端、抗体支架模块重链序列的N末端、抗体支架模块轻链序列的N末端，或其组合，任选地其中所述第二结合模块和所述抗体支架模块直接或通过第二结合模块链间接头彼此共价连接。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块和抗体支架模块通过第二结合模块链间接头彼此共价连接，并且第二结合模块链间接头如SEQ ID NO:58所示。在一个示例性实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块和抗体支架模块通过如SEQ ID NO:59中所示的第二结合模块链间接头彼此共价连接。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端，并且CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端，并且CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第一结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。
在示例性的实施方案中，当在CD137/TGFβ/PD-L1三特异性中存在多于一个第二结合模块时，每个第二结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或抗体支架模块的不同端。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有一个第二结合模块，并且一个第二结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有一个第二结合模块，并且一个第二结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有两个第二结合模块，并且一个第二结合模块共价地连接至抗体支架模块重链序列的C末端，并且另一个第二结合模块共价地连接至抗体支架模块轻链序列的C末端。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块是scFv。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块从N末端至C末端包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ IDNO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块从N末端至C末端包含：重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ ID NO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:15。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块从N末端至C末端包含：如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的第二结合模块包含如SEQ IDNO:57中所示的序列。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有两个第一结合模块和两个第二结合模块。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有以下结构：其中抗体支架模块的重链序列和第二结合模块包含SEQ ID NO:48，并且抗体支架模块的轻链序列和第一结合模块包含SEQ ID NO:49。
在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块进一步包含恒定区。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块的恒定区包含至少一个Fc沉默突变。在示例性的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块的恒定区中的Fc沉默突变是L234A L235A或N297A。在一个示例性实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的抗体支架模块的恒定区包含杵臼(KiH)突变。
根据一些实施方案，本公开提供了CD137/TGFβ/PD-L1三特异性(1923Ab16)，其：1)阻断CD137与其配体之间的相互作用；2)破坏(例如，减少或阻止PD-1与PD-L1的相互作用；以及3)中和TGFβ的免疫抑制活性。
在一些实施方案中，所公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性包含作为抗体支架模块的源自结合CD137的结合蛋白之一(例如，1923Ab4、1923Ab5或1923Ab6)的氨基酸序列，和作为第一结合模块的源自本文所公开的人TGFβRII受体的ECD的TGFβ结合氨基酸序列，以及作为PD-L1第二结合模块的源自结合本文公开的PD-L1的结合蛋白之一(例如，1923Ab2或1923Ab3)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性包含阻断CD137/CD137配体相互作用并对CD137信号传导具有激动活性的抗体支架模块。CD137抗体支架模块可以呈IgG分子(例如，1923Ab16)或其结合片段的形式。
在一些实施方案中，所公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性进一步包含PD-L1第二结合模块，其破坏PD-1/PD-L1结合相互作用并抑制PD-1/PD-L1检查点介导的T细胞抑制。在替代的实施方案中，PD-L1第二结合模块可以包含scFv(例如，1923Ab16)。在替代的实施方案中，所公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性可以包含融合至CD137抗体支架模块的重链或轻链的C末端的PD-L1 scFv第二结合模块。
在一些实施方案中，PD-L1第二结合模块有助于与PD-L1的单价结合。在替代的实施方案中，PD-L1第二结合模块有助于与PD-L1的二价结合。
在一些实施方案中，PD-L1 scFv第二结合模块可以用二硫键稳定。
在一些实施方案中，所公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性包含肿瘤微环境调节剂，其在本文中例示为TGFβ第一结合模块。在一些实施方案中，所公开的TGFβ第一结合模块包含人TGFβRII受体的胞外结构域。TGFβ第一结合模块用于中和肿瘤微环境中存在的TGFβ的生物活性。在替代的实施方案中，TGFβ第一结合模块可以包含能够与人TGFβ结合的人TNFβRII受体的截短形式(例如，N末端或C末端截短)。
在替代的实施方案中，所公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性包含CD137抗体结合模块，其中TGFβ第一结合模块经由接头连接至CD137抗体结合模块的重链或轻链的C末端或N末端。
在一些实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性具有对称的分子设计。在替代的实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的特征在于不对称设计。为了引导不对称的所公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的重链的异二聚化，可以应用杵臼(KIH)技术。
在一些实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性1923Ab16包含具有来自1923Ab4的两个Fab的CD137抗体支架模块；具有具有L234A L235A突变的两个Fc链的人IgG1 Fc(SEQID NO:61)；源自1923Ab3的两个PD-L1第二结合模块scFv(VH在VL之前)(SEQ ID NO:57)，每个第二结合模块scFv分别连接至每个Fc链的C末端；以及作为编码TGFβRII的胞外结构域的多肽的两个TGFβ第一结合模块(SEQ ID NO:67)，每个第一结合模块分别连接至Fab中的每条轻链的C末端。
在一些实施方案中，所公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性进一步包含Fc区，所述Fc区被工程改造以消除/最小化与FcγR的交联活性，所述FcγR沉默或消除T细胞的Fc介导的效应子功能。
在一些实施方案中，CD137/TGFβ/PD-L1三特异性单独地或组合地表现出以下功能特征中的一种或多种：
(a)能够与人PD-L1、CD137和TGFβ结合；
(b)与食蟹猴PD-L1和CD137交叉反应；
(c)破坏(例如，减少或防止)PD-1和PD-L1的相互作用；
(d)破坏(例如，减少或防止)人CD137L与CD137的结合；
(e)表现出对CD137的快速开启和快速关闭的性质；
(f)去抑制T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号；
(g)抑制TGFβ信号传导并中和其生物活性；
(h)对CD137信号传导具有PD-L1依赖性激动活性；
(i)以PD-L1依赖性方式激活T细胞；以及
(j)通过激活CD8 T细胞来杀死表达PD-L1的肿瘤细胞。
本公开还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性中的至少一种，以及任选地药学上可接受的稀释剂、载剂、媒介物和/或赋形剂或由其组成。此类药物组合物可以用于癌症的基于抗体的免疫疗法。
本公开还涉及用于治疗患者中的癌症的方法，其包括单独或与另一种治疗剂组合向患者施用治疗有效量的本文公开的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性中的至少一种。
本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文所述的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性中的至少一种。本公开还提供了分离的多核苷酸序列，其编码本文所述的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性序列中的至少一个。
本公开还提供了载体，其包含本文所述的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性的多核苷酸。
本公开还提供了载体，其包含本文所述的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性多核苷酸序列中的至少一个。
本公开还提供了细胞，其包含本文所述的CD137/TGFβ/PD-L1三特异性多核苷酸序列之一或上述载体之一。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本公开的以下详细描述。出于说明本公开的目的，在图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解，本公开不限于所示的精确布置、实例和工具。
图1A-K提供了结合PD-L1或结合CD137的人结合蛋白的VH和VL结构域的氨基酸序列、PD-L1/CD137双特异性、PD-L1/TGFβ双特异性和PD-L1/CD137/TGFβ三特异性的HC和LC序列以及用于制备所公开的三特异性的scFv亚基。抗PD-L1和抗CD137的CDR序列(Kabat编号)在其相应的可变结构域序列中加下划线。提供序列标识符。
图2A-B显示了通过ELISA的PD-L1单特异性A)1923Ab2和B)1923Ab3与人、小鼠和cyno PD-L1蛋白的结合活性。
图3显示了通过图像结合测定在表达人PD-L1的HEK293T中PD-L1单特异性的结合活性。
图4A-B显示了通过PD-1/PD-L1阻断报告基因测定的阻断PD-L1和PD-1相互作用的PD-L1单特异性A)1923Ab2和B)1923Ab3的活性。
图5A-C显示了通过图像结合测定的CD137单特异性与人、小鼠和表达cyno CD137的HEK293T细胞的结合活性。
图6显示了通过图像结合测定的CD137抗体与人表达CD137的HEK293T细胞的结合活性的比较。
图7显示了通过生物层干涉测量法(BLI)阻断CD137L与CD137结合的CD137单特异性的活性。
图8显示了CD137单特异性的交联对表达人CD137和NFκB荧光素酶报告基因的HEK293T CD137报告细胞的影响。
图9显示了CD137单特异性的交联对用抗CD3刺激的人PBMC诱导IFNγ分泌的影响。
图10A显示了四个人/小鼠杂交CD137表达构建体的示意图。人CRD区域被其小鼠对应物取代，并在HEK293T细胞上瞬时表达。图10B-F显示了乌瑞芦单抗-NR(PC2)、乌托鲁单抗-NR(PC3)和1923Ab4与人CD137野生型(10B)和人/小鼠杂交CD137蛋白msCRD1(10C)、msCRD2(10D)、msCRD3(10E)和msCRD4(10F)的结合活性。
图11A显示了人和小鼠CD137的CRD4结构域的序列比对。如M1-M5所示，通过将人氨基酸序列改变为小鼠氨基酸序列来产生人CD137的五种表达构建体，并在HEK293T细胞上瞬时表达。图11B-G显示了乌瑞芦单抗-NR(PC2)和1923Ab4与人CD137 WT(11B)以及五种突变的人CD137蛋白M1(11C)、M2(11D)、M3(11E)、M4(11F)和M5(11G)的结合活性。
图12显示了通过HDX-MS鉴定的人CD137上的1923Ab4的表位区域(描绘为阴影条)。加框的区域限定富含CD137半胱氨酸的结构域(CRD)区。
图13A-13L显示了所公开的双特异性和三特异性的结构特征：1923Ab7(A)；1923Ab8(B)、1923Ab9(C)、1923Ab10(D)、1923Ab11(E)、1923Ab12(F)、1923Ab13(G)、1923Ab16(H)、1923Ab17(I)、1923Ab18(J)、1923Ab19(K)和1923Ab20(L)。
图14A-14B描述了包含所公开的双特异性(A)和所公开的三特异性(B)的重链和轻链。
图15提供了用于构建结合蛋白的抗体支架模块和结合模块的结构和功能子组分的详细描述。
图16A-16B显示了通过图像结合测定(A)和流式细胞术(B)在表达人HEK293T的CD137中双特异性和三特异性抗体的结合活性。
图17A-17B显示了使用HEK293T CD137报告细胞(A)和Jurkat T CD137报告细胞(B)的双特异性和三特异性对CD137信号传导的激动剂活性。
图18A-18B显示了在存在靶细胞(A)的情况下或在不存在靶细胞(B)的情况下，使用Jurkat T CD137报告细胞通过双特异性和三特异性进行的CD137信号传导的靶细胞依赖性激活。
图19A-19B显示了通过在抗体的不同区域处融合CD137的scFv而产生的(A)三特异性和(B)双特异性的靶细胞依赖性激活CD137信号传导。使用Jurkat T细胞CD137报告细胞来评估CD137信号传导活性。
图20显示了通过PD-1/PD-L1阻断报告基因测定的阻断PPD-L1和PD-1的相互作用的双特异性和三特异性的活性。
图21显示了通过TGFβ阻断报告基因测定的阻断TGFβ诱导的信号传导的三特异性的抑制活性。
图22A-22B显示了双特异性和三特异性对用抗CD3刺激以诱导IFNγ分泌的人PBMC的作用。
图23A-23B显示了(A)T细胞介导的杀伤活性和(B)在与表达内源性PD-L1的NUGC4肿瘤细胞共培养的人CD8 T细胞上诱导双特异性和三特异性的IFNγ分泌。
图24显示了在CMV再调用测定中用CMV裂解物刺激的人PBMC上双特异性和三特异性的抗原特异性T细胞活化的活性。测量分泌的IFNγ水平作为T细胞活化的指示。
图25显示了在用1923Ab18或媒介物剂对照处理后，MC38-h-PD-L1荷瘤hCD137和hDP-L1双敲入小鼠中的肿瘤生长。绘制了第21天来自不同治疗组的肿瘤大小的单向ANOVA分析。
图26A-26E显示了在用1923Ab18或媒介物对照处理后来自MC38-h-PD-L1荷瘤hCD137和hDP-L1双敲入小鼠的肿瘤浸润性淋巴细胞的分析。汇总(A)CD3+CD45+、(B)CD4+CD3+、(C)CD8+CD3+、(D)在CD3+中的Treg的百分比以及(E)CD8/Treg比率。
具体实施方式
PD-1及其配体程序性死亡配体-1和程序性死亡配体-2(PD-L1和PD-L2)充当共抑制因子，其调节T细胞活化、耐受性和免疫病理学之间的平衡。靶向PD-1/PD-L1信号传导轴是密集的治疗探索区域。本公开提供了结合PD-L1的结合蛋白，包含结合PD-L1的结合蛋白(PD-L1单特异性)、结合PD-L1和CD137的结合蛋白(PD-L1/CD137双特异性)、结合PD-L1和TGFβ的结合蛋白(PD-L1/TGFβ双特异性)以及结合PD-L1、TGFβ和CD137的结合蛋白(PD-L1/TGFβ/CD137三特异性)，其可以用于治疗癌症。有利地，本文公开的结合蛋白允许抑制PD-L1，导致较低剂量的制剂，导致较低频率和/或更有效的给药，并且导致降低的成本和提高的效率。为了可以更容易地理解本公开，下文具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中的别处具体定义，否则本文所使用的所有其他技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
在整个本公开中，将使用以下缩写：
mAb或Mab或MAb-单克隆抗体。
CDR-免疫球蛋白可变区中的互补决定区。
VH或VH-免疫球蛋白重链可变区。
VL或VL-免疫球蛋白轻链可变区。
Fc或Fc区-免疫球蛋白重链的保守区，包含CH2和CH3结构域以及部分铰链区。
Fab或Fab片段-抗体的单价抗原结合片段，其由VH、CH1和VL、CL区组成。
FR-抗体框架区，除CDR区外的免疫球蛋白可变区
如本文所述，术语“PD-L1”包含变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情况下，对人PD-L1蛋白具有特异性的抗体可以与来自除人以外的物种的PD-L1蛋白发生交叉反应。在其他实施方案中，对人PD-L1蛋白具有特异性的抗体可以对人PD-L1蛋白有特异性，并且可以表现出物种或其他类型的交叉反应性，或者可以与来自某些其他物种的PD-L1发生交叉反应，但不能与所有其他物种发生交叉反应(例如，与猴PD-L1发生交叉反应，但不与小鼠PD-L1发生交叉反应)。术语“人PD-L1”是指人序列PD-L1，例如具有NCBI登录号NP_054862的人PD-L1的完整氨基酸序列。PD-L1是B7蛋白家族的成员，并且与B7.1和B7.2共享大约20％的氨基酸序列同一性。人PD-L1分别与鼠和食蟹猴PD-L1直系同源物共享70％和93％的氨基酸序列同一性。
如本文所用，术语“PD-1”、“PD1”、“程序性细胞死亡蛋白1”、“CD279”和“分化簇279”(例如，Genebank登录号NP_005009(人))意指I型膜蛋白，其是T细胞调节因子的延伸的CD28/CTLA-4家族的成员。PD1包含胞外IgV结构域，随后是跨膜区，并且胞内尾部PD1在活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞的表面上表达。
术语“CD137”是指4-1BB或TNFRSF9(TNF受体超家族成员9)，是TNF受体超家族(TNFRSF)的成员，并且是在免疫细胞活化后表达的共刺激分子，所述免疫细胞是先天免疫细胞和适应性免疫细胞两者。如本文所用，4-1BB可以源自哺乳动物，例如智人(人)(NCBI登录号NP_001552)。如本文所述，术语CD137包含变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情况下，对人CD137蛋白具有特异性的抗体可以与来自除人以外的物种的CD137蛋白发生交叉反应。在其他实施方案中，对人CD137蛋白具有特异性的抗体可以完全对人CD-137蛋白具有特异性，并且可以表现出物种或其他类型的交叉反应性，或者可以与来自某些其他物种的CD137发生交叉反应，但不与所有其他物种发生交叉反应(例如，与猴CD137发生交叉反应，但不与小鼠4-1BB发生交叉反应)。术语“cyno CD137”是指食蟹猴CD137，例如具有NCBI登录号XP_005544945.1的完整氨基酸序列。术语“小鼠CD137”是指小鼠序列4-1BB，例如具有NCBI登录号NP_035742.1的小鼠4-1BB的完整氨基酸序列。本公开中的人CD137序列可以与NCBI登录号NP_001552的人CD137的不同之处在于具有例如保守突变或非保守区域中的突变，并且本公开中的CD137具有与NCBI登录号NP_001552的人CD137基本上相同的生物学功能。
如本文所用，术语“转化生长因子β”、“TGF-β”或“TGFβ”可以指任何TGF-β蛋白，包括但不限于TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，包含天然存在的TGF-β蛋白和合成蛋白，包含变体和模拟物。TGF-β蛋白是结构上相似的调节蛋白的超家族的成员，包括但不限于哺乳动物TGF-β-1、2和3、抑制素、激活素和骨形态发生蛋白。成熟TGF-β通常作为同二聚体存在，例如二聚体成熟TGF-β分子，其含有两个共价缔合的TGF-β分子。
如本文所用，术语“TGFβ受体II”(“TGFβRII”)意指具有野生型人TGFβ受体2型同种型A序列或同种型B序列或其结合TGFβ的一部分的多肽(例如，NCBI参考序列(RefSeq)登录号分别为NP_001020018或NP_003233.4的氨基酸序列)，包含例如SEQ ID NO:74，或具有与SEQ ID NO:74基本上相同的氨基酸序列的序列。TGFβRII可以保留野生型序列的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％的TGFβ结合活性。表达的TGFβRII的多肽缺乏信号序列。
本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体和三特异性抗体。
本文的术语“抗体支架模块”是指具有两条重链和两条轻链的Y形抗体。两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。抗体支架可以具有连接至其重链和/或轻链中的一个或多个的一个或多个结合模块。抗体结合支架包含两个Fab和具有两个恒定区序列的Fc部分。
示例性的抗体例如IgG包含两条重链和两条轻链。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH区和VL区可以进一步细分成高变区，被称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，例如，组成该群体的单独的抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，包含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产和/或储存期间产生的变体抗体。与通常包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定子。因此，修饰词“单克隆的”指示抗体的特性是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应被解释为需要通过任何方法产生抗体。例如，根据本公开的待使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“嵌合抗体”是指重组抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性。另外，可以进行互补决定区(CDR)接枝以改变抗体分子的某些性质，包含亲和力或特异性。通常，可变结构域从来自实验动物(如啮齿动物)的抗体(“亲本抗体”)获得，并且恒定结构域序列从人抗体获得，使得所得的嵌合抗体可以指导人受试者中的效应子功能，并且将比从其衍生的亲本(例如，小鼠)抗体更不可能引发不利的免疫应答。
“人抗体”是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已经使用本领域技术人员已知的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这种定义具体地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术产生，包含Cole等人，《单克隆抗体与癌症疗法(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)》，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，《免疫学杂志(J.Immunol)》、147(I):86-95(1991)中描述的方法。还参见van Dijk和van de Winkel，《药理学的当前观点(Curr.Opin.Pharmacol》，5:368-74(2001)。人抗体可以通过将靶抗原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已经被修饰以产生此类抗体以响应抗原攻击，但其内源性基因座已被禁用，例如免疫的HuMab小鼠(参见例如关于HuMab小鼠的Nils Lonberg等人，1994，《自然(Nature)》368:856-859，WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918和WO 01/09187)、Xenomice(参见例如关于XENOMOUSETM技术的美国专利第6,075,181和6,150,584号)或Trianni小鼠(参见例如WO 2013/063391、WO 2017/035252和WO 2017/136734)。
术语“人源化抗体”是指这样的抗体，该抗体已经被工程改造以在可变区中包含一个或多个人框架区以及重链和/或轻链的非人(例如小鼠、大鼠或仓鼠)互补决定区(CDR)。在某些实施方案中，人源化抗体包含除CDR区外完全是人的序列。相对于非人源化抗体，人源化抗体通常对人的免疫原性较低，因此在某些情况下提供治疗益处。本领域技术人员将知道人源化抗体，并且也将知道产生人源化抗体的合适的技术。参见例如，Hwang,W.Y.K.等人，《方法(Methods)》36:35,2005；Queen等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,86:10029-10033,1989；Jones等人，《自然》,321:522-25,1986；Riechmann等人，《自然》,332:323-27,1988；Verhoeyen等人，《科学》,239:1534-36,1988；Orlandi等人，《美国国家科学院院刊》,86:3833-37,1989；美国专利第5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370号；和Selick等人，WO 90/07861，它们中的每一个通过引用以其整体并入本文。
抗体的“类别”是指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干个可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
抗体或类似术语的抗体(或简称“结合结构域”)的术语“抗原结合结构域”是指保留特异性地结合至抗原复合物的能力的抗体的一个或多个片段。涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”中的结合片段的实例包含(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)《自然》341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)，和(vii)可以任选地通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。
如本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指主要负责介导特异性抗原识别的重链和轻链多肽两者的可变区内的短多肽序列。在每个VL和每个VH中存在三个CDR(称为CDR1、CDR2和CDR3)。除非另有说明，否则CDR区和框架区根据Kabat编号方案进行注释(Kabat E.A.等人，1991,《免疫目的蛋白质的序列(Sequences of proteins ofImmunological interest)》,载于:NIH公开号91-3242，美国卫生与公众服务部(USDepartment of Health and Human Services)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，Md))。
在其他实施方案中，抗体的CDR可以根据MacCallum RM等人，(1996)《分子生物学杂志(J Mol Biol)》262:732-745来确定，该文献通过引用以其整体并入本文。在其他实施方案中，抗体的CDR可以根据AbM编号方案来确定，该AbM编号方案是指AbM高变区，其表示Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(牛津分子集团公司(Oxford Molecular Group，Inc.))使用，该软件通过引用以其整体并入本文。CDR也可以通过在Kabat等人，1991，载于：《免疫目的蛋白质的序列》，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局(Public Health Service,National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达中的序列比较来定义，而HVL是根据可变结构域的三维结构在结构上定义的，如Chothia和Lesk，1987，《分子生物学杂志》196:901-917所描述的。在这两种方法导致CDR的略微不同的鉴定的情况下，结构定义是优选的。如由Kabat所定义的，在轻链可变结构域中，CDR-L1位于约残基24-34处，CDR-L2位于约残基50-56处，并且CDR-L3位于约残基89-97处；在重链可变结构域中，CDR-H1位于约残基31-35处，CDR-H2位于约残基50-65处，并且CDR-H3位于约残基95-102处。IMGT和NORTH提供了CDR的替代定义(参见Lefranc MP.用于免疫遗传学分析的独特数据库编号***(Unique database numbering system forimmunogenetic analysis)，《今日免疫学(Immunol Today)》(1997)18:509；和North B,Lehmann A,Dunbrack RLJ.一种新的抗体CDR环构象聚类(Anew clustering of antibodyCDR loop conformations)，《分子生物学杂志》(2011)406:228–56)。另外，CDR可以根据化学计算组(CCG)编号来定义(Almagro等人，《蛋白质(Proteins)》2011；79:3050-3066和Maier等人，《蛋白质》2014；82:1599-1610)。因此，重链和轻链的CDR1、CDR2、CDR3限定对给定抗体具有特异性的独特和功能性质。
抗体的“可变结构域”(V结构域)介导结合并且赋予特定抗体的抗原特异性。然而，可变性跨过可变结构域的110个氨基酸跨度不均匀地分布。相反，V区由15-30个氨基酸的被称为框架区(FR)的相对不变的区段组成，这些区段被具有极端可变性的较短区域分隔开，这些区域在本文中被称为“高变区”或CDR，每个区域长9-12个氨基酸。如本领域技术人员将理解的，CDR的确切编号和放置在不同的编号***中可以不同。然而，应当理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开包含相关CDR的公开。因此，每个可变重链区的公开是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开，并且每个可变轻区的公开是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开。
“Fv”由紧密的非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠产生了六个高变环(3个环各自来自H链和L链)，这些环有助于抗原结合的氨基酸残基并且赋予抗体抗原结合特异性。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。关于sFv的回顾，参见Plückthun in《单克隆抗体的药理学(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)》，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，纽约州，第269-315页(1994)。在一些方面，所述区域与十个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以获得柔性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或者反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头，但该蛋白质仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。通过经由使VH或VL中的特定残基突变来引入成对的半胱氨酸对二硫键稳定的scFv进行工程改造。这些残基在VH和VL的界面处。请参见参考文献Weatherill,E.E.等人，朝向通用二硫化物稳定的单链Fv形式：链间二硫化物键位置和vL-vH取向的重要性(Towards a universal disulphide stabilised single chain Fv format:importanceof interchain disulphide bond location and vL-vH orientation)，《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng Des Sel)》25，321-329，NovaRock在实例中使用VH44-VL100。
“框架”或“框架区”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。
“人共有框架”是表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最经常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的子组。通常，序列的子组是如Kabat等人，《免疫目的蛋白质序列》，第五版，NIH出版社91-3242，马里兰州贝塞斯达,(1991)，第1-3卷中的子组。在一个实施方案中，对于VL，子组是如Kabat等人(同上)中的子组κI。在一个实施方案中，对于VH，子组是如Kabat等人(同上)中的子组Ill。
“铰链区”通常被定义为从人IgG1的216-238(EU编号)或226-251(Kabat编号)拉伸。铰链可以进一步被分成三个不同区，上铰链、中铰链(例如，芯)和下铰链。
术语“Fc区”和“恒定区”在本文中用于限定含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包含天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外指明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号***，也称为EU索引，如Kabat等人，《免疫目的蛋白质序列》，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局，马里兰州贝塞斯达(1991)中所述。
源自抗体Fc区与某些Fc受体的相互作用的术语“效应子功能”包括但不限于Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、FcyR介导的效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和细胞表面受体的下调。此类效应子功能通常需要Fc区与抗原结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
术语“T细胞依赖性细胞毒性”(TDCC)描述了当分子同时结合至肿瘤细胞并接合细胞毒性T细胞并通过使T细胞和靶细胞紧密接近来重定向细胞溶解时的一系列事件。ADCC和TDCC的激活都导致靶细胞的杀伤。然而，在这两种不同类型的细胞毒性之间存在一些主要差异。ADCC效应通过在天然杀伤(NK)细胞上表达的Fcγ受体介导，以结合至附着在靶细胞的表面上的抗体的恒定区。TDCC效应通过使细胞毒性T细胞与靶细胞紧密接合来介导。
术语“Fc受体”或“FcR”描述了结合免疫球蛋白的Fc区的抗体受体，其参与位于某些免疫细胞的膜处的抗原识别，所述免疫细胞包含B淋巴细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞。识别IgG的Fc部分的Fc受体被称为Fcγ受体(FcγR)。FcγR家族包含等位基因变体和这些受体的替代剪接形式。基于IgG结合的结构、功能和亲和力的差异，FcγR被分为三个主要组：FcγRI、FcγRII(FcγRIIa和FcγRIIb)和FcγRIII(FcγRIIIa和FcγRIIIb)。其中，FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIIa(CD16a)是在FcγRI和FcγRIIIa的γ亚基中或在FcγRIIa的细胞质尾部中包含信号转导基序、基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的激活受体。在抗原-抗体复合物结合后，激活性Fcγ受体(人：FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB和鼠：FcγRI、FcγRIII、FcγRIV)触发免疫效应子功能。相比之下，FcγRIIb(CD32b)是抑制性受体。FcγRIIb的交联导致基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的磷酸化和抑制性信号传导转导(Patel等人，《免疫学前沿(Front Immunol.)》2019；10:223)。
术语“Fc沉默的”是指这样的Fc区，其被工程改造以最小化/消除与FcγR和补体的结合活性，从而导致沉默或消除Fc介导的效应子功能。用于工程改造Fc的策略包含Fc糖基化的修饰、使用IgG亚类的混合体或在铰链和/或CH2区中引入一个或多个突变。对效应子功能重要的残基和使Fc沉默的相应突变是本领域已知的，例如，Strohl,WR和Strohl LM,“用于最佳抗体性能的抗体Fc工程改造(Antibody Fc engineering for optimal antibodyperformance)”，载于《治疗性抗体工程(Therapeutic Antibody Engineering)》、Cambridge:Woodhead出版社(2012)，第242页，国际专利公开号WO2017008169A1和WO2021055669。
可以被工程改造以使人IgG1 Fc沉默的位点的具体的非限制性实例包含L234、L235、G237、D265、N297、P329、P331，所有这些都在EU编号中。
如本文所用，术语“T调节性细胞”或“Treg”是指通过阻止/抑制其他免疫细胞如CD8阳性(CD8+)效应T细胞的增殖、活化和细胞毒性能力而具有调节作用的免疫***的细胞。调节性T细胞(Treg)通过主转录因子叉头框P3(Foxp3)的表达来表征。存在两个主要的Treg细胞亚群，即在胸腺中发育的“天然”Treg(nTreg)细胞和在来自CD4+Foxp3-常规T细胞的外周中出现的“诱导的”Treg(iTreg)细胞。天然Treg被表征为表达CD4 T细胞共受体和CD25两者，CD25是IL-2受体的组分。因此，Treg是CD4+CD25+。核转录因子叉头框P3(FoxP3)的表达是决定天然Treg发育和功能的决定性质。Treg细胞通过多种作用模式发挥其抑制作用，包含通过以下的抑制：抑制性细胞因子(例如，IL-10、TGFβ、IL-35)的分泌、树突状细胞功能/成熟的调节、免疫调节性表面分子(例如，CTLA-4、LAG-3)的表达或细胞溶解(例如，颗粒酶A介导的和/或颗粒酶B介导的)。
如本文所用，术语“双特异性”是指包含抗体支架模块和第一结合模块的结合蛋白，其中所述模块源自对两种不同抗原具有结合特异性的抗体和/或受体蛋白。在一个实施方案中，抗体支架模块对PD-L1具有结合特异性，并且第一结合模块对任何其他抗原，例如，对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、肿瘤微环境调节剂、细胞因子等具有结合特异性。在另一实施方案中，抗体支架模块对CD137具有结合特异性，并且第一结合模块对任何其他抗原，例如，对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、肿瘤微环境调节剂、细胞因子等具有结合特异性。
如本文所用，术语“三特异性”是指包含抗体支架模块和第一结合模块以及第二结合模块的结合蛋白，其中所述模块源自对三种不同抗原具有结合特异性的抗体和/或受体蛋白。在一个实施方案中，抗体支架模块对PD-L1具有结合特异性，并且第一结合模块和第二结合模块对任何其他抗原(除了另一个结合模块的抗原之外)具有结合特异性，例如，对细胞表面共刺激受体(包括但不限于CD137)、受体、受体亚基、组织特异性抗原、肿瘤微环境调节剂、细胞因子等具有结合特异性。在一个实施方案中，抗体支架模块对CD137具有结合特异性，并且第一结合模块和第二结合模块对任何其他抗原(除了另一个结合模块的抗原之外)具有结合特异性，例如，对细胞表面共刺激受体(包括但不限于PD-L1)、受体、受体亚基、组织特异性抗原、肿瘤微环境调节剂、细胞因子等具有结合特异性。
关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性地结合至”或对特定多肽或特定多肽靶上的表位“具有特异性”意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。可以例如通过与对照分子的结合相比确定分子的结合来测量特异性结合。例如，可以通过与类似于靶标(例如过量的未标记的靶标)的对照分子竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则指示特异性结合。如本文所使用的术语“特异性结合”或“特异性地结合至”或对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“具有特异性”可以通过例如具有10-4M或更低(可替代地10-5M或更低、可替代地10-6M或更低、可替代地10-7M或更低、可替代地10-8M或更低、可替代地10-9M或更低、可替代地10-10M或更低、可替代地10-11M或更低、可替代地10-12M或更低)的对靶标的Kd或在10-4M至10-6M或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M范围内的Kd的分子来呈现。如本领域技术人员将理解的，亲和力和KD值是反向相关的。通过低KD值来测量对抗原的高亲和力。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指分子结合至特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合至任何其他多肽或多肽表位的结合。如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性地结合”和“选择性地结合”是指抗体结合至CD137、PDL1和/或TGF的表位β。
如本文所用，术语“亲和力”意指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，所述解离常数Kd被定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka由1/Kd定义。用于确定mAb的亲和力的方法可见于Harlow等人，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州，1988)、Coligan等人编辑，《免疫中的当前方案》，格林出版协会(Greene Publishing Assoc.)和Wiley Interscience，纽约州(1992,1993)和Muller，Meth.Enzymol.92:589-601(1983)，所述参考文献通过引用完全并入本文。本领域熟知的用于确定mAb的亲和力的一种标准方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTMSPR分析装置分析)。
“表位”是指示抗体与其抗原之间的相互作用的一个或多个位点的本领域术语。如由(Janeway,C,Jr.,P.Travers等人(2001)，《免疫生物学:健康和疾病中的免疫***(Immunobiology:the immune systemin health and disease)》，第II部分，第3-8章，纽约州，Garland出版公司)所述：“抗体通常仅识别大分子(例如蛋白质)的表面上的小区域……[某些表位]可能由来自[抗原]多肽链的不同部分的氨基酸组成，所述氨基酸已通过蛋白质折叠聚集在一起”。这种类别的抗原决定子被称为构象表位或不连续表位，因为识别的结构由蛋白质的区段组成，所述区段在抗原的氨基酸序列中是不连续的，但在三维结构中聚集在一起。相比之下，由多肽链的单个区段组成的表位被称为连续表位或线性表位”(Janeway,C,Jr.,P.Travers等人(2001)，《免疫生物学:健康和疾病中的免疫***，第II部分，第3-8章，纽约州，Garland出版公司)。
如本文所用，术语“KD”旨在是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。它由下式计算：Koff/Kon＝KD
如本文所用，术语“IC50”旨在是指中和其结合的抗原的50％生物活性所需的本文公开的结合蛋白的有效浓度。
关于药剂和特定活性(例如，与细胞的结合、酶促活性的抑制、免疫细胞的活化或抑制)的“EC50”是指药剂的有效浓度，其产生其关于此类活性的最大应答或效应的50％。关于药剂和特定活性的“EC100”是指药剂的有效浓度，其产生其关于此类活性的基本上最大的响应。
如本文所用，术语“T细胞耗竭”被定义为T细胞增殖和分泌细胞因子的能力受损，其由延长的抗原刺激诱导的免疫检查点受体(如PD-1、CTLA-4、T细胞Ig和含粘蛋白结构域(TIM)-3)和淋巴细胞活化基因3的过度表达引起。
如本文所用，T细胞上的术语“共刺激受体”是指可以积极地诱导信号传导以通过TCR信号传导和细胞因子刺激完全激活T细胞的细胞表面分子。共信号传导途径在T细胞引发和激活中以及在调节T细胞分化、效应子功能和存活中起关键作用。共刺激受体通常被分为2组：Ig受体超家族(IgSF)和TNF受体超家族(TNFRSF)。
术语“结合模块”是指结合PD-L1、CD137、TGFβ或任何其他靶标的任何物质，与支架模块本身相比，所述物质可以增强本发明的结合蛋白的比活性。结合模块的非限制性实例包含anticalin、重复体(repebody)、单体、scFv、Fab、scFab、亲和体、fynomer、DARPin、纳米体、肽适体和核酸适体。
术语“Fab”或“抗原结合片段”是指抗体的两个相同片段，其通常通过赋予抗体结合特异性的酶促消化来制备。抗体的木瓜蛋白酶消化产生由整个轻链(L)以及重链(H)的可变区结构域(VH)和一个重链的第一恒定结构域(CH1)组成的两个相同的Fab片段。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够使抗原交联。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处具有另外的几个残基，包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
术语“接头”是指在两个化学实体之间形成共价键的至少一个原子。术语“接头”可以指在支架模块与结合模块的另一共价键之间形成共价键的至少一个原子。如果支架模块和结合模块仅通过肽键连接，则接头被称为“肽接头”。否则，接头被称为“化学接头”。此外，“柔性肽接头”主要包含小的、非极性或极性氨基酸，而“刚性肽接头”包含α螺旋形成序列和/或富含脯氨酸残基(Chen等人，2013.《高级药物递送综述(Adv Drug Deliv Rev.)》65(10):1357-1369)。
术语“支架模块”是指包含两个抗原结合位点并且可以充当一个或多个结合模块的支撑结构的蛋白质。结合模块可以通过接头连接至支架模块，和/或结合模块可以并入到支架模块中存在的任何环区域中。
此处应当注意，如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另有明确说明。
T细胞活化和耗竭
T细胞活化
T细胞上的T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)的表面上的如由MHC复合物呈递的抗原结合。TCR/MHC/抗原的结合触发T细胞的初始激活。通过T细胞抗原受体(TCR)/CD3复合物的T细胞信号传导触发激活多个效应子途径的信号阵列。
T细胞活化通过TCR/CD3复合物产生的信号和由其他细胞表面受体发出的信号和/或由可溶性介质递送的信号正向和负向调节，以确保T细胞对适当的配体作出响应并持续适当的持续时间。T细胞活化的核心原则是，仅通过TCR的信号传导会导致无能状态(T细胞对特定抗原的低响应状态，其可以通过缺乏共刺激诱导)。
多个表面受体已经被描述为能够为T细胞提供共刺激，包含CD28、CD30、CD5、CD2、ICOS、OX40和4-1BB(CD137)。CD28在免疫应答的诱导期间表达，并且它促进包含ICOS、OX40和CD137的若干其他共刺激分子的表达。
TCR生成的调节信号也由来自其他共受体例如细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡-1(PD-1，也称为CD279)的连接的信号补充，这两种受体都具有限制TCR触发的T细胞的扩增和激活的功能。鉴于它们作为负调节因子的功能，CTLA-4和PD-1被描述为免疫检查点。众所周知，在活化的T细胞上表达的PD-1与PD-L1配体(也称为B7-H1或CD274)的连接激活关键免疫检查点，导致T细胞耐受性、功能障碍和T细胞耗竭。
在存在炎性细胞因子的情况下长期暴露于肿瘤抗原肽/MHC I类复合物诱导实体瘤中存在的T细胞中的不同表型，特征在于效应子功能的逐渐丧失、抑制性免疫检查点受体的高和持续表达、增殖能力差(Pauken KE和Wherry EJ.,《免疫学趋势(Trends Immunol)》2015；36(4):265–276(2015)，Wherry EJ和Kurachi M.,《自然评论免疫学(Nat RevImmunol)》2015 15(8):486–499(2015)、代谢失调、较差的记忆再调用以及不同的转录和表观遗传学程序(McLane,L等人，《免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)》37:457(2019)。
T细胞耗竭
功能失调或慢性刺激的T细胞是在癌症中重复TCR刺激后发展的不同谱系，并且在小鼠模型和人中发现(Zajac AJ等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med)》188,2205-2213(1998),Bakhli MY Cytokine,71,339-347(2011)，Wherry和Kurachi《自然评论免疫学》15,486-499(2015)。在存在炎性细胞因子的情况下长期暴露于肿瘤抗原肽/MHC I类复合物诱导实体瘤中存在的T细胞中的不同表型，特征在于效应子功能的逐渐丧失、抑制性免疫检查点受体的高和持续表达、增殖能力差(Pauken KE和Wherry EJ.,《免疫学趋势》2015；36(4):265–276(2015)，Wherry EJ和Kurachi M.、《自然评论免疫学》2015 15(8):486–499(2015)、代谢失调、较差的记忆再调用以及不同的转录和表观遗传学程序(McLane、L等人，《免疫学年鉴》37:457(2019)。
由于免疫抑制检查点的激活而产生的负调节信号被认为是TME中的效应T细胞功能障碍的主要机制。在癌症研究中肿瘤抗原特异性应答和同时进行性疾病的存在将PD-1鉴定为耗竭的标志物。研究表明，检查点阻断可以至少部分地使T细胞功能恢复活力(FuertesMarraco SA等人，《免疫学前沿》6,310(2015)。阻断PD-1/PD-L1相互作用已经显示部分地恢复T细胞功能。
PD-1/PD-L1途径
PD-1/PD-L1途径已经被广泛研究(Salmaninejad等人，2019；Han等人，2020；Makuku等人，2021)。PD-1是具有288个氨基酸的55kDa跨膜蛋白，所述氨基酸含有IgV样胞外结构域，随后是跨膜区和胞内尾部，所述胞内尾部具有用于TCR信号传导和调节的两个磷酸化位点(Ishida，Agata，Shibahara，&Honjo)。PD-L1是从具有290个氨基酸的1型膜传代的33-kDa糖蛋白，在其细胞外区中具有Ig和IgC样结构域(Freeman等人，2000)。PD-1和PD-L1是免疫检查点蛋白。
PD-1在多种活化的免疫细胞中表达，所述活化的免疫细胞例如活化的T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)、活化的单核细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞和未成熟的兰格汉斯细胞。PD-1也在持续暴露于抗原的T细胞的表面上上调，并且是耗竭的T细胞的标志物之一(Ahmadzadeh等人，2009)。包含NFAT、NOTCH、FOXO1和IRF9的转录因子触发PD-1表达的转录(Staron等人，2014)。细胞因子例如IL-2、IL-21、IL-15、IL-7和1型IFN可以增强PD-1表达。分别使用信号转导子和转录激活子3(STAT3)和STAT4的IL-6和IL-12增加脾CD8 T细胞中的PD-1表达(Salmaninejad等人，2019)。
PD-L1由抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、B细胞、DC和一些上皮细胞组成性地表达，特别是在炎性条件下(Sharpe等人，2007)。外周组织中PD-L1的存在是防止自身免疫损伤所必需的。另外，PD-L1由若干种类型的肿瘤细胞表达，例如非小细胞肺癌(NSCLC)、血液恶性肿瘤和病毒感染的细胞，作为逃避抗肿瘤响应的“适应性免疫机制”(Ohaegbulam等人，2015)。已经揭示若干转录因子参与癌细胞中PD-L1的转录上调，例如缺氧诱导型因子a(HIF-1a)、STAT3和NF-kB(Chen等人，2015)。此外，由浸润的免疫细胞产生的细胞因子例如IL-4、IL-10、TNFα、IFNγ和生长干细胞因子以及细菌LPS和VEGF上调PD-L1基因的表达(Ji等人，2015)。
PD-1的生理作用是抑制功能性T细胞和T调节(Treg)细胞的发育。Treg和共抑制性免疫检查点如PD-1/PD-L1充当故障保护措施，以防止免疫***的异常和慢性激活以及针对自身抗原的免疫应答性。然而，熟知的是，PD-1/PD-L1途径由癌细胞或肿瘤相关抗原呈递细胞共同选择，作为逃避抗肿瘤T细胞应答和促进肿瘤免疫逃逸的手段(Hargadon等人，2018)。肿瘤可以通过表达PD-L1来逃避宿主免疫监测。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致T细胞的下调及其凋亡和从肿瘤微环境中排除，从而使得癌细胞逃避免疫应答(Iwai等人，2017)。
靶向PD-1/PD-L1
PD-1是共享共同结构的B7/CD28受体家族的成员：免疫球蛋白样胞外结构域、跨膜结构域和含有基于免疫受体酪氨酸的抑制和信号传导基序的胞内结构域。当PD-1与其配体PD-L1接合时，此类相互作用导致SRP同源磷酸酶SHP1和SHP2的募集，所述SRP同源磷酸酶SHP1和SHP2将信号传输到细胞中。PD-1主要在活化的T细胞上表达，活化的T细胞是适应性免疫应答的主要细胞毒性效应物，并且其传输的信号有助于抑制T细胞介导的免疫应答。研究表明，阻断PD-1的抑制作用可以引发针对肿瘤细胞的有效免疫应答。阻断这种相互作用的PD-1/PD-L1检查点抑制剂增加免疫细胞增殖并增强身体的天然抗肿瘤监测***的功效。因此，了解癌症逃避免疫检查点的机制对于个性化免疫疗法的递送的方法至关重要。
需要两个单独的信号来完全激活T细胞，从而抑制细胞毒性活性。第一种来自T细胞受体与抗原呈递细胞(APC)的表面上的主要组织相容性复合物呈递的抗原表位之间的相互作用。第二种来自T细胞和APC表面上共刺激受体-配体对的接合。PD-1属于经由配体结合调节T细胞活性的一组共抑制受体，其可以将T细胞驱动到称为耗竭的状态，其中它们不能增殖或执行其效应子功能。
PD-1/PD-L1途径的阻断已经显示可以重振/恢复耗竭的肿瘤浸润性T淋巴细胞的功能。例如，已经报道用抗PD-1/PD-L1和抗CTLA-4免疫检查点抑制剂治疗可重振功能障碍的TIL并增强其抗肿瘤效果(Wherry和Kurachi，2015；Zarour，2016；Miller等人，2019)。
CD137共刺激途径
CD137，其也被称为4-1BB，或TNFRSF9(TNF受体超家族成员9)首先被鉴定为在活化的T细胞上表达的诱导性共刺激受体，是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFRSF)的30kDa跨膜糖蛋白。目前对4-1BB的理解表明，表达通常是活化依赖性的，并且涵盖广泛的免疫细胞亚群，包含活化的T细胞、活化的天然杀伤(NK)和天然杀伤T(NKT)细胞、调节性T细胞、树突状细胞(DC)，包含卵泡DC、刺激的肥大细胞、分化髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。4-1BB表达也已经在肿瘤脉管***和动脉粥样硬化内皮上证实。刺激CD137的配体(CD137L)在活化的抗原呈递细胞(APC)、髓样祖细胞和造血干细胞上表达(Wang等人，《免疫学评论(Immunological Reviews)》、2009,229,192-215)。
CD137在初始T细胞的表面上不可检测。在刺激TCR信号传导后，CD137表达在刺激后2-3天诱导并达到峰值，并且在3天之后下降。CD137在活化的T细胞的细胞表面上作为单体和二聚体两者表达。基于与TNFRSF家族中的其他成员的同源性，配体结合诱导受体三聚化，导致受体的激活。在从细胞表面切割胞外结构域之后，TNFRSF的一些成员可以以可溶性形式存在。可溶性4-1BB和可溶性4-1BBL已经在一些患有自身免疫性疾病和癌症的患者的血清中检测到(Wang等人，《免疫学评论》,2009,229,192-215)。
CD137是TNF受体(TNFR)超家族的成员，在其胞质结构域中没有已知的内在酶促活性。它依赖于TNFR相关因子(TRAF)衔接蛋白家族来构建CD137信号小体以用于将信号转导到细胞中。在通过结合CD137L三聚体或通过与激动剂单克隆抗体交联而活化CD137时，TRAF1、TRAF2和TRAF3容易募集到CD137的胞质结构域，可能作为具有不同构型的同型和/或异型三聚体，启动CD137信号小体的构建，这导致NF-κB和丝裂原活化蛋白(MAP)激酶级联的下游活化，所述MAP激酶级联包含ERK、JNK和p38 MAP激酶(Bartkowiak等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》，2018,24,1138–1151)。
CD137在维持有效的T细胞免疫应答和生成免疫记忆中起关键作用。CD137的表达谱以及其在与肿瘤免疫相关的多个淋巴细胞亚群中增强稳健的效应响应的独特能力使CD137成为免疫疗法的独特吸引力靶标。
对小鼠和人T细胞的多项研究表明，CD137促进细胞增殖、存活和细胞因子产生。CD137激动剂抗体已经显示出显著地增强细胞溶解性T淋巴细胞应答。激动剂CD137抗体作为单一疗法或与其他疗法(如检查点抑制剂)组合在预防性和治疗性环境中提供了抗肿瘤益处的证据。CD137的刺激已经显示出在体内产生持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答(Fisher等人，《癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol Immunother)》2012,61,1721-1733)。最近，CD137激动剂抗体已经显示出增加细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-选择素在肿瘤脉管***上的表达，导致T细胞迁移到肿瘤微环境中增加(Palazon等人，《癌症研究(Cancer Research)》,2011,71(3),8001-811)。
然而，CD137-/-小鼠和不可知CD137抗体两者均表现出增强的抗肿瘤活性的令人困惑的观察结果表明，仅CD137信号传导的激活不能完全解释其抗肿瘤作用。多项研究已经报道了在结合至CD137L时的CD137信号传导。最近，积累的证据表明CD137L/CD137相互作用导致双向信号传导。由于CD137L主要在活化的APC例如DC上表达，因此来自CD137L的反向信号传导已经被报道影响DC的发育和功能(Kwon,《免疫网络(Immune Network)》,2015,15(3),121-124)。在2017年，报告发现证明了肿瘤中抗原呈递树突状细胞(DC)中CD137配体(CD137L)的反向信号传导可以解释这些矛盾的结果。具体来说，CD137L反向信号传导抑制了产生IL12的CD103+DC和1型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的肿瘤内分化，这些细胞在生成产生IFNγ的CD8+细胞毒性T淋巴细胞中起重要作用。值得注意的是，CD137L阻断增加了IL12和IFNγ的水平，这进一步促进了肿瘤内产生IFNγ的CD8+T细胞、产生IL12的CD103+DC和1型TAM的肿瘤内分化。因此，在T细胞中激活CD137信号传导同时阻断DC中的CD137L反向信号传导应当完全引发C137途径的抗肿瘤活性(Kang等人，《癌症研究》,2017,77(21),5989-6000)。
据报道，初始小鼠和荷瘤小鼠中高剂量的CD137激动剂抗体可诱导T细胞向肝脏浸润以及天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的升高，这是肝脏炎症或损伤的指标。基于评估抗CD137抗体(乌瑞芦单抗，Bristol Myers)的功效的临床研究，激活CD137活性可以引发治疗性抗肿瘤活性。然而，肝毒性限制了其临床发展。第二种抗CD137药物(乌托鲁单抗，辉瑞公司)的临床评估表明可接受的安全性概况，但有限的临床功效。迄今为止，没有针对CD137的经批准的治疗性抗体。
靶向PD/PD-L1检查点和CD137的双特异性
由于共刺激受体在调节T细胞的效应子功能中起关键作用，因此共刺激途径的激动可以改善检查点抑制功效，并且可以导致持久的抗肿瘤应答。被设计成靶向PD-1/PD-L1途径的双特异性分子和T细胞共刺激分子可以去抑制检查点，并且同时共刺激T细胞以提供抗肿瘤免疫的有效诱导。取决于分子设计的方面，T细胞活化可以通过反式结合发生并且依赖于PD-L1结合，从而有效地限制对肿瘤微环境的免疫活性。T细胞上的合适的共刺激靶标包括但不限于CD137、OX40、CD28、CD27、CD226、GITR、ICOS、TNFRSF25、LIGHT(TNFSF14)、TIM-1和LFA-1。
先前的临床前实验和临床数据清楚地支持激动共刺激途径可以是用于重振癌症中的T细胞应答的有效策略，特别是当与其他免疫激活策略组合使用时。对PD-L1和T细胞上的共刺激分子具有双特异性的结合蛋白应当介导与表达PD-L1的抗原呈递细胞(APCs)或肿瘤细胞和活化的T细胞的同时结合，导致肿瘤特异性T细胞(如肿瘤浸润性T细胞和CD8+细胞溶解性T细胞)的条件性活化，以减轻激动剂抗CD137抗体的中靶肿瘤外毒性。
TGFβ
TGFβ超家族是一大组结构上相关的蛋白质，包含TGFβ、结节、激活素、左右决定因子(lefty)、骨形态发生蛋白以及生长和分化因子。TGFβ信号传导通过Smad和非Smad途径转导。TGFβ是多效细胞因子，其在介导TME中的免疫抑制和免疫监视逃避方面具有关键功能。TGFβ由肿瘤异常产生，并且主要通过抑制先天免疫***和适应性免疫***两者来促进癌症进展。作为抗肿瘤免疫的负调节因子，TGF-β损害抗PD-1/PD-L1的功效并且诱导抗药性。
据报道，当用抗PD-1/PD-L1单一疗法治疗时，患有大多数癌症的患者中仅有约10-30％达到目标应答，即使在仅选择性纳入治疗前肿瘤标本表达PD-L1的患者的试验中也是如此(Lipson，EJ等人，《肿瘤学研讨会(Semin.Oncol.)》42(4):587(2015)。对这种缺乏应答的一种可能的解释是肿瘤微环境的免疫抑制性质，这归因于免疫抑制细胞(例如调节性T细胞(Treg)和其他抑制T细胞引发或抑制效应T细胞功能的因子(例如细胞因子和代谢途径)的存在。据报道，抗PD-1/PD-L1疗法的效果在以过度活跃的TGFβ信号传导为特征的TME中有限(Tauriello DVF等人，《自然)》,554:538–543(2018)。
TGFβ信号传导的效应由三种TGFβ配体(TGF-β1-3)通过TGFβ1型(TGFβR1)和2型受体TGFβR2介导，所有三种TGFβ配体均作为同二聚体存在。在肿瘤微环境中，存在与TGFβ信号传导的平衡紧密相关的许多细胞上下文依赖性因子(Liu S等人，《分子医学报告(Mol MedRep)》17:699-704(2018)。TGFβ已经被证明是用于抑制抗肿瘤免疫应答的重要因素，但T细胞和肿瘤来源的TGF-β的精确作用仍然不太了解。
Treg、单核细胞髓源性抑制细胞(MDSC)、可替代地极化巨噬细胞(M2表型)及其相关的可溶性因子是公认的抑制机制，其可以抑制抗肿瘤免疫。MDSC据报道是肿瘤微环境中TGFβ的主要来源。
Treg通常在实体瘤中发现，并且可以通过若干种机制促进免疫抑制，包含与效应细胞竞争激活细胞因子和分泌免疫抑制细胞因子。例如，Treg有助于肿瘤微环境中的转化生长因子-β(TGFβ)的水平，这是破坏适应性免疫引发和效应子应答两者的免疫抑制因子。
设计靶向肿瘤微环境调节剂的治疗剂是用于优化肿瘤免疫疗法的公认策略。例如，TGFβ和免疫细胞的相互作用已经被鉴定为肿瘤微环境和癌症进展中的重要调节轴。TGFβ通过诱导Treg的分化、降低T细胞和天然杀伤(NK)细胞的细胞毒性、限制免疫细胞的肿瘤浸润并抑制通过树突状细胞(DC)的抗原呈递来调节许多免疫细胞的功能(Yi，M等人，《血液学与肿瘤学杂志(J.Hematol.Oncol.)》14(1):27(2021)。抑制TGF-β信号传导途径的主要策略是设计干扰TGF-β与其受体的结合、阻断胞内信号传导或使用反义寡核苷酸破坏表达的治疗剂。
作为肿瘤微环境调节剂的TGFβ
抗PD-1/PD-L1免疫疗法的作用在通过过度活性TGFβ信号传导表征的TME中是有限的。来自临床前研究的数据支持以下假设：阻断或拮抗TGFβ可能会破坏若干种有助于TGFβ的免疫抑制作用的因素。Budhu等人的研究发现，T细胞的抗肿瘤活性被肿瘤驻留调节性T(Treg)细胞抑制，并且免疫抑制取决于Treg细胞表面上TGFβ的存在。针对TGF-β的阻断抗体逆转了免疫抑制并且增强了抗肿瘤应答(S.Budhu等人，《科学信号传导(Sci.Signal.)》，10，eaak9702(2017)。其他已发表的数据表明，TGFβ通过阻断T细胞浸润肿瘤来抑制抗肿瘤免疫应答。在尿路上皮癌的小鼠模型中进行的研究表明，与靶向TGF-β信号传导和PD-L1的抗体的组合疗法增加了T细胞穿透肿瘤的能力，诱导肿瘤消退并且增强抗肿瘤免疫应答(Mariathasan，S等人，《自然》554,544–548(2018)。
Tauriello,D.V.F.等人研究了表达与结肠直肠癌相关的四个突变的小鼠，并且发现小鼠中的转移通过基质中减少的T细胞浸润和活性TGFβ来表征。PD-1–PD-L1免疫检查点的抑制在模型***中引发有限的应答，然而TGFβ的抑制释放出防止转移的强力和持久细胞毒性T细胞应答。在患有进行性肝转移性疾病的小鼠中，TGFβ信号传导的阻断使肿瘤易受抗PD-1/PD-L1疗法影响，并且导致存活率增加(Tauriello，《自然》554,544–548(2018)。
M7824(Bintrafusp alfa)是由德国Merck KGaA、Darmstadt和GlaxoSmithKline开发的双功能融合蛋白。M7824包含源自人源化IgG1单克隆抗体阿维鲁单抗的VH和VL序列，所述人源化IgG1单克隆抗体阿维鲁单抗经由柔性(Gly4Ser)4Gly接头遗传融合至TGF-βRII的可溶性胞外结构域(136个氨基酸)的N末端。它充当所有三种TGF-β(TGF-β1-3)配体同种型的细胞因子陷阱。
若干临床前研究已经显示，Bintrafusp alfa能够(1)预防或逆转TGFβ诱导的人癌细胞中的上皮间质转化；肿瘤细胞可塑性的这种改变显示出使人肿瘤细胞对免疫介导的攻击以及对若干种化疗剂更敏感；(2)改变自然杀伤细胞和T细胞的表型，从而增强它们针对肿瘤细胞的细胞溶解能力；(3)经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性机制介导人肿瘤细胞的增强的裂解；(4)降低Treg细胞的抑制活性；(5)在多种临床前模型中介导抗肿瘤活性，以及(6)与放疗、化学疗法和若干种被设计成同时阻断PD-L1和TGFβ途径的其他免疫治疗剂结合增强抗肿瘤活性(Lind H等人，《癌症免疫疗法杂志(J Immunother Cancer)》，Feb；8(1):e000433(2020)。据报道，用抗PD-L1/TGFβTrap(bintrafusp)治疗已显示出引发协同抗肿瘤作用，其优于单药剂抗PD-L1或TGFβTrap蛋白的抗肿瘤作用(US 9,676,863)。
观察到的协同作用归因于免疫细胞上的PD-1和肿瘤细胞上的PD-L1之间的相互作用的同时阻断以及肿瘤微环境中TGFβ的中和作用(US 9,676,863)。推测协同效应基于同时阻断两种主要免疫逃逸机制。通过拮抗肿瘤微环境中的TGFβ细胞因子水平(由于肿瘤细胞的抗PD-L1靶向)和通过PD-L1受体介导的内吞作用破坏TGFβ来实现TGFβ的耗竭(US 9,676,863)。
靶向PD/PD-L1检查点和TGFβ的PD-L1结合蛋白
已经报道PD-1/PD-L1和TGFβ的双重阻断具有协同抗肿瘤活性(Chen,X等人，《国际癌症杂志(Int.J.Cancer)》143:2561(2018)和Yi,M等人，《血液学与肿瘤学杂志(J.Hematol.Oncol.)》14(1):27(2021)。考虑到PD-1/PD-L1轴和TGFβ的免疫抑制作用是互补和独立的，设计能够阻断TGFβ信号传导以增强抗PD-L1免疫疗法的功效的PD-L1结合蛋白是合理的(Yi,M等人，《血液学与肿瘤学杂志》，14(1):27(2021))。另外，结合PD-L1并且包含TGF-β途径拮抗剂的双特异性或三特异性结合蛋白可以为对PD-1/PD-L1单一疗法有抗性的患者提供有效选项(Kim等人，《血液学与肿瘤学杂志》，14:55(2021))。
为了增强抗PD-L1免疫疗法的功效，提供了可以同时阻断PD-1/PD-L1轴和TGFβ信号传导途径的结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白还可以结合CD137并且提供促进T细胞应答性的共刺激信号。
PD-L1单特异性
在一些实施方案中，所公开的PD-L1单特异性(1923Ab2和1923Ab3)对人PD-L1具有特异性(例如，特异性地结合人PD-L1)。这些结合蛋白及其片段可以通过独特的CDR序列集合、对PD-L1的特异性来表征，并且表现出PD-1/PD-L1信号传导的强抑制活性。更具体地，在一个方面，本公开涉及结合人PD-L1的结合蛋白，以及它们作为单一疗法或与其他抗癌剂组合以调节位于肿瘤微环境的细胞的PD-L1介导的活性的用途。在替代的实施方案中，所公开的结合PD-L1的结合蛋白也可以用作双特异性和三特异性的亚基，所述双特异性和三特异性被设计成从PD-1/PD-L1检查点抑制中去抑制/释放效应T细胞。
在替代的方面，本公开涉及结合PD-L1以设计结合PD-L1的双特异性或三特异性的所公开的结合蛋白的用途及其用于抑制PD-L1/PD-L1检查点并促进T细胞活化的用途。
在示例性的实施方案中，本发明提供了结合PD-L1的结合蛋白，所述结合蛋白包含抗体支架模块，所述抗体支架模块包含：(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含表1中的1923Ab2的CDR序列；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含表2中的1923Ab2的CDR序列。
在示例性的实施方案中，本发明提供了结合PD-L1的结合蛋白，所述结合蛋白包含抗体支架模块，所述抗体支架模块包含：(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含表1中的1923Ab3的CDR序列；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含表2中的1923Ab3的CDR序列。
表1：PD-L1结合重链可变区的CDR序列
PD-L1单特异性参考编号 CDR1 CDR2 CDR3
1923Ab2 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7
1923Ab3 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:13
表2：PD-L1结合轻链可变区的CDR序列
PD-L1单特异性参考编号 CDR1 CDR2 CDR3
1923Ab2 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10
1923Ab3 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:15
在一些实施方案中，结合PD-L1的结合蛋白可以是单克隆的、嵌合的、双特异性的或三特异性的，具有包含VH(例如SEQ ID NO.1和3)和VL(例如SEQ ID NO.2和4)的重链区序列，并且恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另外的实施方案中，本发明的抗体是具有Fc沉默突变(L234A L235A或N297A)的人IgG1型。
在一些实施方案中，有利的是，所公开的抗PD-L1抗体是Fc工程改造的。
在又一个实施方案中，本发明提供了结合PD-L1的结合蛋白，所述PD-L1包含重链序列和轻链序列，其中所述重链序列与SEQ ID NO.42或45具有至少85％的序列同一性，并且所述轻链序列与SEQ ID NO.40至少85％的序列同一性。
在一个实施方案中，所公开的抗体结合至人或食蟹猴PD-L1，并且能够阻断人PD-L1与PD1受体之间的相互作用。
在一个实施方案中，结合蛋白以5x10-9M或更小的KD、优选地以2x10-9M或更小的KD、并且甚至更优选地以1x10-9M或更小的KD结合人PD-L1。
在另外的实施方案中，本发明涉及结合人PD-L1或其片段的结合蛋白，所述结合蛋白与如本文所述的根据本发明的抗体(Tecentriq)交叉竞争结合PD-L1。
在一些实施方案中，结合PD-L1或其片段的结合蛋白单独地或组合地表现出以下结构和功能特征中的一种或多种：(a)对人PD-L1具有特异性，(b)与食蟹猴PD-L1发生交叉反应，(c)破坏PD-L1与PD-1的结合，或(d)去除T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号。
使用多种体外测定来研究PD-L1/PD-1相互作用的破坏和所公开的结合PD-L1的结合蛋白对激活检查点的去抑制。抗PD-L1部分的生物活性通过其破坏PD-1与PD-L1之间的相互作用以使用PD-1/PD-L1阻断测定来恢复TCR信号传导的能力来确定。
CD137单特异性
在一些实施方案中，所公开的CD137单特异性(1923Ab4、1923Ab5和1923Ab6)对人CD137具有特异性(例如，特异性地结合人CD137)。这些结合蛋白及其片段通过独特的CDR序列集合、对CD137的特异性来表征，并且作为单一疗法或与其他抗癌剂组合可用于癌症免疫疗法。如本文所展示的，结合CD137的结合蛋白还可以用作双特异性和三特异性的亚基，所述双特异性和三特异性被设计成重振从PD1/PD-L1检查点抑制释放的效应T细胞。更具体地，本公开涉及结合人CD137的结合蛋白，以及它们用于调节位于肿瘤微环境的细胞的CD137介导的活性的用途。
在示例性的实施方案中，本发明提供了结合CD137的结合蛋白，所述结合蛋白包含抗体支架模块，所述抗体支架模块包含：(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含表3中的1923Ab4的CDR序列；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含表4中的1923Ab4的CDR序列。
在示例性的实施方案中，本发明提供了结合CD137的结合蛋白，所述结合蛋白包含抗体支架模块，所述抗体支架模块包含：(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含表3中的1923Ab5的CDR序列；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含表4中的1923Ab5的CDR序列。
在示例性的实施方案中，本发明提供了结合CD137的结合蛋白，所述结合蛋白包含抗体支架模块，所述抗体支架模块包含：(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含表3中的1923Ab6的CDR序列；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含表4中的1923Ab6的CDR序列。
表3：CD137结合重链可变区的CDR序列
CD137单特异性参考编号 CDR1 CDR2 CDR3
1923Ab4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23
1923Ab5 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29
1923Ab6 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34
表4：CD137结合轻链可变区的CDR序列
CD137单特异性参考编号 CDR1 CDR2 CDR3
1923Ab4 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26
1923Ab5 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:31
1923Ab6 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:37
在一些实施方案中，结合CD137的结合蛋白可以是单克隆的、嵌合的、双特异性的或三特异性的，具有包含VH(例如SEQ ID NO:16、18和20)和VL(例如SEQ ID NO:17、19和21)的重链区序列，并且恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另外的实施方案中，本发明的抗体是具有Fc沉默突变(L234A L235A或N297A)的人IgG1型。
在一些实施方案中，有利的是，所公开的抗CD137抗体是Fc工程改造的。
在又一个实施方案中，本发明提供了结合CD137的结合蛋白，所述结合蛋白包含重链序列和轻链序列，其中所述重链序列与SEQ ID NO.75的重链序列具有至少85％的序列同一性，并且所述轻链序列与SEQ ID NO.76的轻链序列具有至少85％的序列同一性。
申请人试图发现结合CD137的结合蛋白，所述结合蛋白表现出克服中靶肿瘤外毒性和免疫抑制环境的期望的概况，以获得更好的免疫疗法。所公开的结合CD137的结合蛋白对于富含耗竭的T细胞或有助于抗PD-1/PD-L1抗性的调节性T细胞的肿瘤微环境可能是特别有益的。
在一些实施方案中，结合CD137及其片段的结合蛋白单独地或组合地表现出以下结构和功能特征中的一种或多种：
(a)对人CD137具有特异性，
(b)与食蟹猴CD137交叉反应，
(c)破坏(例如，减少或防止)人CD137L与CD137的结合，
(d)对CD137表现出快速开启和快速关闭的性质，
(e)具有与CD137信号传导的交联依赖性激动活性，或
(f)以交联依赖性方式激活T细胞。
在一个实施方案中，所公开的结合蛋白在存在交联剂的情况下激活CD137信号传导。在使用原代PBMC的T细胞活化测定中，它们以交联依赖性方式增强抗CD3刺激的IFN-γ释放。
在一些实施方案中，有利的是，所公开的结合蛋白结合至人CD137和食蟹猴CD137两者。与在食蟹猴(例如，食蟹猴(Macaca fascicularis))的细胞上表达的CD137的交叉反应性是有利的，因为它使得动物能够测试抗体分子而不必使用替代抗体。所公开的结合CD137、1923Ab4、1923Ab5和1923Ab6的结合蛋白都以显著的亲和力结合来自食蟹猴的CD137。尽管所公开的抗体不结合小鼠CD137，但人源化的CD137小鼠是可用的，并且可以用于在体内研究所公开的抗体在临床前小鼠肿瘤模型中的功效。
使用多种体外测定来研究所公开的抗CD137抗体对T细胞的活化。抗CD137部分的生物活性通过其使用过表达CD137并携带NFκB荧光素酶报告基因的测定细胞诱导交联依赖性CD137信号传导的能力来确定。另外，交联的抗CD137增强PBMC中的抗CD3刺激的IFNγ释放。
在一些实施方案中，本文公开的结合蛋白可以包含一个或多个保守氨基酸取代。本领域技术人员将认识到，保守氨基酸取代是用具有类似结构或化学性质(例如如类似的侧链)的另一种氨基酸取代一种氨基酸。示例性的保守取代在本领域中描述，例如，Watson等人，《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》，The Benjamin/Cummings出版公司，第4版(1987)。
“保守修饰”是指不显著地影响或改变含有氨基酸序列的结合蛋白的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包含氨基酸取代、添加和缺失。保守取代是其中氨基酸被具有类似侧链的氨基酸残基替换的那些取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族是明确定义的，并且包含具有酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳香族侧链(例如苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂肪族侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和含硫侧链(半胱氨酸、蛋氨酸)的氨基酸。此外，多肽中的任何天然残基也可以被丙氨酸取代，如先前针对丙氨酸扫描诱变所描述的(MacLennan等人，(1998)Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67；Sasaki等人，(1998)Adv Biophys 35:1-24)。对本文公开的结合蛋白的氨基酸取代可以通过已知方法，例如通过PCR诱变进行(美国专利第4,683,195号)。
在一些实施方案中，结合蛋白包含可变重链序列，所述可变重链序列包含与SEQID NO:16、18或20中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合蛋白保留包含SEQ ID NO:16、18或20的可变重链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。在另外的实施方案中，结合蛋白包含SEQID NO:16、18或20的可变重链序列，并且在重链可变序列中具有一个或多个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另外的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:16、18或20中的一个或多个框架区内(基于Kabat的编号***)。
在特定实施方案中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:16、18或20中所示的结合蛋白重链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的可变重链序列，在框架区包含一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号***)，并且保留了包含如SEQ ID NO:16、18或20中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:17、19或21中所示的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。
在一些实施方案中，结合蛋白包含可变轻链序列，所述可变轻链序列包含与SEQID NO:17、19或21中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合蛋白保留了包含SEQ ID NO:17、19或21的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。在另外的实施方案中，结合蛋白包含SEQ ID NO:17、19或21的可变轻链序列，并且在轻链可变序列中具有一个或多个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另外的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:17、19或21中的一个或多个框架区内(基于Kabat的编号***)。
在特定实施方案中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:17、19或21中所示的结合蛋白轻链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的可变轻链序列，在框架区包含一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号***)，并且保留了包含如SEQ ID NO:16、18或29中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:17、19或21中所示的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。
PD-L1/CD137双特异性
在某些实施方案中，本公开提供了PD-L1/CD137双特异性，其包含源自抗PD-L1抗体的PD-L1抗体支架模块和源自抗CD137抗体的CD137第一结合模块，其中所述双特异性激动CD137并以PD-L1依赖性方式激活T细胞。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性包含表5中公开的重链。例如，PD-L1/CD137双特异性可以包含具有源自1923Ab3的VH的一组CDR序列的HC，以及具有或不具有氨基酸修饰以减弱或消融Fc受体功能的经修饰的人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，HC可以进一步包含具有一组CDR序列的scFv，所述一组CDR序列源自结合本文公开的CD137的结合蛋白的VH和VL区，例如1923Ab4。在一些实施方案中，scFv可以通过定位在HC的N末端或C末端处的接头连接至HC。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性包含表5中公开的轻链。例如，PD-L1/CD137双特异性可以包含具有源自1923Ab3的VL的一组CDR序列的LC。在一个实施方案中，LC可以进一步包含具有一组CDR序列的scFv，所述一组CDR序列源自结合本文公开的CD137的结合蛋白的VH和VL区，例如1923Ab4。在一些实施方案中，scFv可以通过定位在LC的N末端或C末端处的接头连接至LC。
表5：PD-L1/CD137双特异性
双特异性参考编号 重链(HC) 轻链(LC)
1923Ab8 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:40
1923Ab11 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:40
1923Ab12 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46
1923Ab13 SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:40
1923Ab18 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:40
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab8(图13B)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1 Fc和源自1923Ab4的两个scFv片段(VH在VL之前)，其连接至Ab3重链的C末端。图14(A)提供了1923Ab8的重链和轻链的描述。图15提供了所公开的结合蛋白的子组分的更详细描述。重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:40中提供。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab11(图13E)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1Fc和源自1923Ab4的两个scFv片段(VL在VH之前)，其连接至Ab3重链的C末端。图14(A)提供了1923Ab11的重链和轻链的描述。图15提供了子组分的更详细描述。重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:44和SEQ IDNO:40中提供。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab12(图13F)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1Fc和源自1923Ab4的两个二硫键稳定的scFv片段(VH在VL之前)，其连接至Ab3轻链的N末端。图14(A)提供了1923Ab12的重链和轻链的描述。图15提供了子组分的更详细描述。重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中提供。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab13(图13G)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1Fc和源自1923Ab4的两个二硫键稳定的scFv片段(VH在VL之前)，其连接至Ab3重链的N末端。图14(A)提供了1923Ab13的重链和轻链的描述。图15提供了子组分的更详细描述。重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:40中提供。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性1923Ab18(图13J)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1 Fc和源自1923Ab4的两个二硫键稳定的scFv片段(VH在VL之前)，其连接至Ab3重链的C末端。图14(A)提供了1923Ab18的重链和轻链的描述。图15提供了子组分的更详细描述。重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ IDNO:50和SEQ ID NO:40中提供。
抗PD-L1部分的生物活性通过其破坏PD-1与PD-L1之间的相互作用以使用PD-1/PD-L1阻断测定来恢复TCR信号传导的能力来确定。抗CD137部分的生物活性通过其使用过表达CD137并携带NFκB荧光素酶报告基因的测定细胞诱导交联依赖性CD137信号传导的能力来确定。
在一些实施方案中，PD-L1/CD137双特异性单独或组合地表现出以下特征中的一个或多个：
(a)对人PD-L1具有特异性并且结合至人CD137；
(b)与食蟹猴PD-L1和CD137交叉反应；
(c)破坏PD-1和PD-L1的相互作用；
(d)破坏(例如，减少或防止)人CD137L与CD137的结合；
(e)表现出对CD137的快速开启和快速关闭的性质；
(f)去抑制T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号；
(g)对CD137信号传导具有PD-L1依赖性激动活性；
(h)以PD-L1依赖性方式激活T细胞；
(i)通过激活CD8 T细胞来杀死表达PD-L1的肿瘤细胞；
(j)在使用MC38-hPD-L1同基因肿瘤模型的人PD-L1和CD137敲入中展示抗肿瘤功效；
(k)增加肿瘤微环境中的CD8+T细胞；
(l)降低肿瘤微环境中Treg细胞的百分比；以及
(m)降低肿瘤微环境之外的中靶毒性。
在某些实施方案中，双特异性具有增强免疫细胞增殖、存活、细胞溶解活性CD8 T细胞和细胞因子分泌的能力。在特定实施方案中，所公开的PD-L1/CD137双特异性显示出以比单特异性抗体组合更大的效力在CMV再调用测定中活化人T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白具有选自由以下组成的组的特征：破坏PD-1和PD-L1的相互作用，去除T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号，对CD137信号传导具有PD-L1依赖性激动活性，以PD-L1依赖性方式激活T细胞，通过激活CD8 T细胞来杀死表达PD-L1的肿瘤细胞，在使用MC38-hPD-L1同基因肿瘤模型的人PD-L1和CD137敲入中展示抗肿瘤功效，增加肿瘤微环境中的CD8+/T细胞，以及降低肿瘤中Treg细胞的百分比。
在某些实施方案中，双特异性具有与表达CD137和PD-L1的细胞结合的能力。在另一实施方案中，双特异性与PD-L1的结合破坏其与PD-1的相互作用，这导致Jurkat T细胞中TCR信号传导的恢复。另外，PD-L1结合的双特异性激活CD137信号传导，而单特异性抗PD-L1抗体单独不能诱导CD137信号传导。此外，它们增强PBMC中的抗CD3刺激的IFNγ释放。更具体地，双特异性在体外重定向CD8+以杀死表达PD-L1的肿瘤细胞。在一个实施方案中，在人CD137和人PD-L1双敲入小鼠中使用表达人PD-L1的MC38小鼠肿瘤，所公开的双特异性已经显示出强大的抗肿瘤功效。
在一些实施方案中，结合蛋白包含可变重链序列，所述可变重链序列包含与SEQID NO:38、44、45、47或50中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合蛋白保留包含SEQ ID No:38、44、45、47或50的可变重链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。在另外的实施方案中，结合蛋白包含SEQ ID No:38、44、45、47或50的可变重链序列，并且在重链可变序列中具有一个或多个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另外的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:38、44、45、47或50中的一个或多个框架区内(基于Kabat的编号***)。
在特定实施方案中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:38、44、45、47或50中所示的结合蛋白重链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的可变重链序列，在框架区中包含一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号***)，并且保留了包含如SEQ ID NO:38、44、45、47或50中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:40或46中所示的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。
在一些实施方案中，结合蛋白包含可变轻链序列，所述可变轻链序列包含与SEQID NO:40或46中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合蛋白保留了包含SEQ ID NO:40或46的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。在另外的实施方案中，结合蛋白包含SEQ IDNO:40或46的可变轻链序列，并且在轻链可变序列中具有一个或多个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另外的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:40或46中的一个或多个框架区内(基于Kabat的编号***)。
在特定实施方案中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:40或46中所示的结合蛋白轻链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的可变轻链序列，在框架区中包含一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号***)，并且保留了包含如SEQ ID NO:38、44、45、47或50中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:40或46中所示的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。
PD-L1/TGFβ双特异性
在替代的实施方案中，本公开提供了PD-L1/TGFβ双特异性，其包含源自抗PD-L1抗体的PD-L1抗体支架模块和源自人TGFβRII的ECD的肿瘤微环境调节剂，其中所述双特异性去抑制PD-1/PD-L1检查点并且中和肿瘤微环境中TGFβ的免疫抑制作用。
在其他实施方案中，本公开提供了PD-L1/TGFβ双特异性，其包含源自抗PD-L1抗体的PD-L1抗体支架模块和源自人TGFβ受体II型的ECD的TGFβ第一结合模块，其中所述双特异性结合PD-L1和TGFβ两者并且能够中和TME中TGFβ的生物活性。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性1923Ab20(图13L)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1 Fc，以及编码TGFβRII的胞外结构域的两个多肽，所述胞外结构域附着至1923Ab3重链的C末端。图14(A)提供了1923Ab20的重链和轻链的描述。图15提供了子组分的更详细描述。表6分别提供了重链和轻链SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
表6：PD-L1/TGFβ双特异性
双特异性参考编号 重链(HC) 轻链(LC)
1923Ab20 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:40
抗PD-L1部分的生物活性通过其破坏PD-1与PD-L1之间的相互作用以使用PD-1/PD-L1阻断测定来恢复TCR信号传导的能力来确定。TGFβRII的胞外结构域(ECD)中和人TGFβ的生物活性的能力通过其使用SBE(SMAD结合元件)报告细胞阻断TGFβ诱导的信号传导级联的能力来确定。
在一些实施方案中，双特异性单独或组合地表现出以下特征中的一个或多个：(a)对人PD-L1具有特异性并且结合至人TGFβ；(b)破坏PD-1和PD-L1的相互作用；(c)去抑制T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号；(d)结合人TGFβ并中和其生物活性；(e)降低肿瘤微环境之外的毒性；(f)增加肿瘤微环境中的CD8+T细胞；或(g)降低肿瘤微环境中Treg细胞的百分比。
在某些实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ双特异性具有增强免疫细胞增殖、存活、CD8 T细胞的细胞溶解活性和细胞因子分泌的能力。在特定实施方案中，所公开的PD-L1/TGFβ双特异性被示出为在CMV再调用测定中以比单特异性抗体组合更大的效力活化人T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的结合蛋白具有选自由以下组成的组的特征：破坏PD-1和PD-L1的相互作用，去除T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号，以PD-L1依赖性方式激活T细胞，通过激活CD8 T细胞来杀死表达PD-L1的肿瘤细胞，增加肿瘤微环境中的CD8+T细胞，以及降低肿瘤中Treg细胞的百分比。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ双特异性单独或组合地表现出以下功能特征中的一种或多种：破坏PD-1和PD-L1的相互作用，去除T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号，抑制TGFβ信号传导。
在特定实施方案中，所公开的双特异性与乌瑞芦单抗-NR组合显示出在CMV再调用测定中激活人T细胞。
在一个实施方案中，所公开的包含TGFβRII胞外结构域(ECD)的抗体阻断携带SBE报告基因的HEK细胞中的TGFβ诱导的信号传导。
在某些实施方案中，双特异性具有与表达PD-L1的细胞结合的能力。在另一实施方案中，双特异性与PD-L1的结合破坏其与PD-1的相互作用，这导致Jurkat T细胞中TCR信号传导的恢复。
在一些实施方案中，结合蛋白包含可变重链序列，所述可变重链序列包含与SEQID NO:51中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合蛋白保留包含SEQ ID NO:51的可变重链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。在还另外的实施方案中，结合蛋白包含SEQ ID NO:51的可变重链序列，并且在重链可变序列中具有一个或多个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在还另外的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:51中的一个或多个框架区内(基于Kabat的编号***)。
在特定实施方案中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:51中所示的结合蛋白重链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的可变重链序列，在框架区中包含一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号***)，并切保留包含如SEQ IDNO:51中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。
在一些实施方案中，结合蛋白包含可变轻链序列，所述可变轻链序列包含与SEQID NO:40中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合蛋白保留包含SEQ ID NO:40的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。在另外的实施方案中，结合蛋白包含SEQ ID NO:40的可变轻链序列，并且在轻链可变序列中具有一个或多个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另外的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:40中的一个或多个框架区内(基于Kabat的编号***)。
在特定实施方案中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:40中所示的结合蛋白轻链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的可变轻链序列，在框架区中包含一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号***)，并且保留包含如SEQ IDNO:51中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。
PD-L1/TGFβ/CD137三特异性
在某些实施方案中，本公开的结合蛋白是三特异性的并且以重组蛋白的形式构建，所述重组蛋白包含结合PD-L1的抗体支架模块(源自抗体)、包含TGFβ受体II结合蛋白的第一结合模块和结合CD137的第二结合模块(源自抗体)。
在特定实施方案中，本公开提供了三特异性，其包含结合源自抗PD-L1抗体的PD-L1的抗体支架模块、源自2型TGFβ受体的ECD的TGFβ第一结合模块和源自抗CD137抗体的CD137第二结合模块，其中所述三特异性结合PD-L1、CD137并且还从局部微环境中耗尽TGFβ，从而以PD-L1依赖性方式激活T细胞。
表7：PD-L1/TGFβRII/CD137三特异性
三特异性参考编号 重链1 重链2 轻链
1923Ab7 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:39
1923Ab9 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:39
1923Ab10 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:39
1923Ab17 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:39
1923Ab19 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:52
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab7(图13A)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab；具有L234A L235A突变的人IgG1 Fc；源自1923Ab4的两个scFv片段(VH在VL之前)，其连接至1923Ab3重链的C末端；以及编码TGFβRII的胞外结构域的两个多肽，其连接至1923Ab3轻链的C末端。图14(B)提供了1923Ab7的重链和轻链的描述。图15提供了三特异性的子组分的更详细描述。表7分别提供了重链和轻链SEQ ID NO:38和SEQID NO:39的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab9(图13C)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变和杵臼(KiH)突变的异二聚体人IgG1 Fc、源自连接至“杵”重链的C末端的1923Ab4的一个scFv片段(VH在VL之前)，以及连接至1923Ab3轻链的C末端的编码TGFβRII的胞外结构域的两个多肽。图14(B)提供了1923Ab9的重链和轻链的描述。图15提供了三特异性的子组分的更详细描述。表7提供了重链1(杵)(SEQ ID NO:41)、重链2(臼)(SEQ ID NO:42)和轻链(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab10(图13D)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变和杵臼(KiH)突变的异二聚体人IgG1 Fc、源自连接至“杵”重链的C末端的1923Ab4的一个scFv片段(VL在VH之前)，以及连接至Ab3轻链的C末端的编码TGFβRII的胞外结构域的两个多肽。图14(B)提供了1923Ab10的重链和轻链的描述。图15提供了三特异性的子组分的更详细描述。表7提供了重链1(杵)(SEQID NO:43)、重链2(臼)(SEQ ID NO:42)和轻链(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab17(图13I)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1 Fc、源自连接至Ab3重链的C末端的1923Ab4的两个二硫键稳定的scFv片段(VH在VL之前)，以及连接至Ab3轻链的C末端的编码TGFβRII的胞外结构域的两个多肽。图14(B)提供了1923Ab17的重链和轻链的描述。图15提供了三特异性的子组分的更详细描述。表7分别提供了重链和轻链SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性1923Ab19(图13K)包含来自1923Ab3的结合PD-L1的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1 Fc、连接至1923Ab3轻链的C末端的编码TGFβRII的胞外结构域的2个多肽，以及连接至1923Ab3重链的C末端的源自1923Ab4的两个二硫键稳定的scFv片段(VH在VL之前)。图14(B)提供了1923Ab19的重链和轻链的描述。图15提供了三特异性的子组分的更详细描述。表7分别提供了重链和轻链SEQ IDNO:51和SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
为了促进基于天然IgG样结构支架的重组物的异二聚化，已经广泛应用了杵臼(KiH)技术，其涉及工程改造CH3结构域以在每条重链中产生“杵”或“臼”以促进异二聚化。在一些实施方案中，特别是结合PD-L1的结合蛋白通过不对称设计来表征。“杵”突变的一个实例包含CH3结构域中的T366W，并且“臼”突变的一个实例包含CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V。在一个实施方案中，可以通过“杵”中的另外的S354C突变和“臼”中的另外的Y349C突变来引入稳定二硫键。所有残基编号均在EU编号中。
PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的生物活性通过由PD-L1、TGFβ或CD137调节的相应信号传导事件来确定。在一些方面，使用PD-1/PD-L1阻断测定通过其破坏PD-1与PDPD-1之间的相互作用的能力来确定抗PD-L1部分。抗CD137部分的生物活性通过使用过表达CD137并携带NFκB荧光素酶报告基因的测定细胞诱导交联依赖性CD137信号传导的能力来确定。抗TGF-β部分的生物活性通过其使用SBE(SMAD结合元件)报告细胞阻断TGFβ诱导的信号传导级联的能力来确定。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性单独或组合地表现出以下功能特征中的一种或多种：
(a)能够与人PD-L1、CD137和TGFβ结合；
(b)与食蟹猴PD-L1和CD137交叉反应；
(c)破坏(例如，减少或防止)PD-1和PD-L1的相互作用；
(d)破坏(例如，减少或防止)人CD137L与CD137的结合；
(e)表现出对CD137的快速开启和快速关闭的性质；
(f)去抑制T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号；
(g)抑制TGFβ信号传导并中和其生物活性；
(h)对CD137信号传导具有PD-L1依赖性激动活性；
(pi)以PD-L1依赖性方式激活T细胞；以及
(j)通过激活CD8 T细胞来杀死表达PD-L1的肿瘤细胞。
在一些实施方案中，PD-L1/TGFβ/CD137三特异性单独或组合地表现出以下功能特征中的一种或多种：破坏PD-1和PD-L1的相互作用，去除T细胞PD-L1介导的检查点抑制信号，抑制TGFβ信号传导，对CD137信号传导具有PD-L1依赖性激动活性，以PD-L1依赖性方式激活T细胞，以及通过激活CD8 T细胞来杀死表达PD-L1的肿瘤细胞。
在某些实施方案中，三特异性具有增强免疫细胞增殖、存活、细胞溶解活性CD8 T细胞和细胞因子分泌的能力。在特定实施方案中，所公开的三特异性显示出在CMV再调用测定中以比单特异性抗体组合大的效力活化人T细胞。
在一个实施方案中，三特异性阻断携带SBE报告基因的HEK细胞中TGFβ诱导的信号传导。
在某些实施方案中，三特异性具有与表达CD137和PD-L1的细胞结合的能力。在另一实施方案中，三特异性与PD-L1的结合破坏了其与PD-1的相互作用，这导致Jurkat T细胞中TCR信号传导的恢复。另外，PD-L1结合的双特异性激活CD137信号传导。此外，它们增强PBMC中的抗CD3刺激的IFNγ释放。更具体地，三特异性在体外重定向CD8+以杀死表达PD-L1的肿瘤细胞。
在一些实施方案中，结合蛋白包含可变重链序列，所述可变重链序列包含与SEQID NO:38、41、42、43、50或51中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合蛋白保留包含SEQ ID NO:38、41、42、43、50或51的可变重链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。在另外的实施方案中，结合蛋白包含SEQ ID NO:38、41、42、43、50或51的可变重链序列，并且在重链可变序列中具有一个或多个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另外的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:38、41、42、43、50或51中的一个或多个框架区内(基于Kabat的编号***)。
在特定实施方案中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:38、41、42、43、50或51中所示的结合蛋白重链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的可变重链序列，在框架区中包含一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号***)，并且保留了包含如SEQ ID NO:38、41、42、43、50或51中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:39或52中所示的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。
在一些实施方案中，结合蛋白包含可变轻链序列，所述可变轻链序列包含与SEQID NO:39或52中所示的氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，结合蛋白保留包含SEQ ID NO:39或52的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。在还另外的实施方案中，结合蛋白包含SEQ IDNO:39或52的可变轻链序列，并且在轻链可变序列中具有一个或多个保守氨基酸取代，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在还另外的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:39或52中的一个或多个框架区域内(基于Kabat的编号***)。
在特定实施方案中，结合蛋白包含与SEQ ID NO:39或52中所示的结合蛋白轻链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的可变轻链序列，在框架区中包含一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号***)，并且保留了包含如SEQ ID NO:38、41、42、43、50或51中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:39或52中所示的可变轻链序列的结合蛋白的结合和/或功能活性。
CD137/TGFβ/PD-L1三特异性
在某些实施方案中，本公开的结合蛋白是三特异性的并且以重组蛋白的形式构建，所述重组蛋白包含结合CD137的抗体支架模块(源自抗体)、包含TGFβ受体II结合蛋白的第一结合模块和结合PD-L1的第二结合模块(源自抗体)。
在特定实施方案中，本公开提供了三特异性，其包含结合源自抗CD137抗体的CD137的抗体支架模块、源自TGFβ受体2型的ECD的TGFβ第一结合模块和源自抗PD-L1抗体的PD-L1第二结合模块，其中所述三特异性结合CD137、PD-L1，并且还从局部微环境中耗尽TGFβ，从而以PD-L1依赖性方式激活T细胞。
表8：CD137/TGFβRII/PD-L1三特异性
三特异性参考编号 重链 轻链
1923Ab16 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:49
在一些实施方案中，CD137/TGFβRII/PD-L1三特异性1923Ab16(图13H)包含来自1923Ab4的结合CD137的两个Fab、具有L234A L235A突变的人IgG1 Fc、连接至1923Ab4重链的C末端的源自1923Ab3的两个scFv片段(VL在VH之前)，以及连接至Ab4轻链的C末端的编码TGFβRII的胞外结构域的两个多肽。图14(B)提供了1923Ab16的重链和轻链的描述。图15提供了子组分的更详细描述。表8分别提供了重链和轻链SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
产生结合蛋白的方法
本文公开的结合蛋白可以通过本领域中已知的任何方法来制备。例如，接受者可以用可溶性重组人PD-L1和/或CD137蛋白，或与它们的载剂蛋白缀合的片段或肽免疫。可以使用任何合适的免疫方法。此类方法可以包括佐剂、其他免疫刺激剂、重复加强免疫以及一种或多种免疫途径的使用。
人PD-L1和/或CD137的任何合适的来源可以用作用于产生本文公开的组合物和方法的非人或人抗PD-L1和/或CD137抗体的免疫原。
PD-L1和/或CD137抗原的不同形式可以用于生成足以产生生物活性抗体的抗体。因此，引发的PD-L1和/或CD137抗原可以是单个表位、多个表位或单独的或与一种或多种免疫原性增强剂组合的整个蛋白质。在一些方面，引发的抗原是分离的可溶性全长蛋白或包含小于全长序列的可溶性蛋白(例如，用包含PD-L1和/或CD137的特定部分或表位的肽免疫)。如本文所用，术语“部分”是指构成所关注的抗原的免疫原性表位的最小数量的氨基酸或核酸，视情况而定。可以采用适合于转化所关注的细胞的任何遗传载体，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非病毒载体，例如阳离子脂质。
期望从各种哺乳动物宿主，例如小鼠、啮齿动物、灵长类动物、人等制备单克隆抗体(mAb)。用于制备此类单克隆抗体的技术的描述可见于例如Sties等人(编辑)《基础和临床免疫(BASIC和CLINICAL IMMUNOLOGY)》(第4版)Lance医学出版社，Los Altos,CA，以及其中引用的参考文献；Harlow和Lane(1988)《抗体：实验室手册(ANTIBODIES：A LABORATORYMANUAL)》CSH出版社；Goding(1986)《单克隆抗体：原则和实践(MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES和PRACTICE)》(第2版)学术出版社(Academic Press)，纽约州，纽约市。通常，通常通过与骨髓瘤细胞融合来永生化来自用期望的抗原免疫的动物的脾细胞。参见Kohler和Milstein(196)《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》，6:511-519。永生化的替代方法包括用爱泼斯坦巴尔病毒、癌基因或逆转录病毒或本领域已知的其他方法转化。参见例如Doyle等人(编辑1994和周期性补刊)《细胞和组织培养：实验室程序(CELL和TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES》，John Wiley和Sons，纽约州，纽约市。筛选由单个永生化细胞产生的集落用于产生对抗原具有所需特异性和亲和力的抗体，并且通过各种技术可以增强由此类细胞产生的单克隆抗体的产率，包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔中。可替代地，人们可以通过根据例如Huse等人，(1989)《科学》246:1275-1281概述的通用方案从人B细胞中筛选DNA文库来分离编码单克隆抗体或其抗原结合片段的DNA序列。因此，抗体可以通过本领域研究人员熟悉的多种技术获得。
其他合适的技术涉及选择噬菌体、酵母、病毒或类似载体中的抗体文库。参见例如Huse等人，同上；以及Ward等人，(1989)《自然》341:544-546。本文公开的多肽和抗体可以在有或没有修饰的情况下使用，包括嵌合或人源化抗体。通常，多肽和抗体将通过共价或非共价连接提供可检测信号的物质来标记。多种标记和缀合技术是已知的，并且在科学文献和专利文献两者中广泛报道。合适的标记物包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等。教导使用此类标记物的专利包括美国专利第3,817,837；3,850,752；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241号。另外，可以产生重组免疫球蛋白，参见Cabilly美国专利第4,816,567号；以及Queen等人(1989)《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l Acad.Sci.USA)》86:10029-10023；或在转基因小鼠中制备，参见NilsLonberg等人，(1994)，《自然》368:856-859；和Mendez等人，(1997)《自然遗传学(NatureGenetics)》15:146-156；转基因动物和使用方法(TRANSGENIC ANIMALS和METHODS OF USE)(WO 2012/62118)、Medarex、Trianni、Abgenix、Ablexis、OminiAb、Blatet和其他技术。
在一些实施方案中，可以使用标准结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)、ELISA、Western印迹、免疫荧光、流式细胞术分析、趋化测定和细胞迁移测定来评估产生的抗体结合至PD-L1和/或CD137的能力。在一些方面，还可以评估产生的抗体抑制PD-L1和/或激活CD137用于阻断PD-L1和/或激活CD137受体信号转导的能力。
可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳法、透析法和亲和色谱法来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和色谱法是典型的纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见例如Lindmark等人，1983《免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)》.62:1-13)。推荐蛋白质G用于所有小鼠同种型和人γ3(参见例如Guss等人，1986EMBO J.5:1567-1575)。亲和配体所附接的基质最经常是琼脂糖，但其他基质是可用的。机械稳定的基质，例如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，允许比利用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的加工时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，Bakbond ABXTM树脂(J.T.Baker,新泽西州菲利普斯堡(Phillipsburg,N.J.))可用于纯化。用于蛋白质纯化的其他技术，例如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的肝素SEPHAROSETM色谱法上的色谱法、色谱共聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的，这取决于待回收的抗体。
在任何初步纯化步骤之后，包含所关注的抗体和污染物的混合物可以使用在约2.5-4.5之间的pH的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用色谱法，通常以低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)进行。
还包括在如本文所定义的低、中等和高严格性条件下与由编码本公开的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸序列表示的核苷酸序列的全部或一部分(例如，编码可变区的部分)杂交的核酸。杂交核酸的杂交部分的长度通常为至少15个(例如，20、25、30或50个)核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗PD-L1和/或CD137多肽(例如，重链或轻链可变区)或其补体的核酸的一部分或全部序列至少80％，例如，至少90％，至少95％，或至少98％相同。本文所述的类型的杂交核酸可以例如用作克隆探针、引物，例如PCR引物或诊断探针。
多核苷酸、载体和细胞
其他实施方案涵盖包含编码如本文所公开的结合蛋白或其片段的序列的分离的多核苷酸、包含多核苷酸的载体和细胞，以及用于产生所公开的结合蛋白的重组技术。分离的多核苷酸可以编码任何所需形式的结合蛋白，包括例如全长单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、微抗体。
一些实施方案包括分离的多核苷酸，其包含编码具有SEQ ID NO:1、3、16、18和20中任一者的氨基酸序列的结合蛋白或其片段的重链可变区的序列。一些实施方案包括分离的多核苷酸，其包含编码具有SEQ ID NO:2、4、17、19和21中任一者的氨基酸序列的结合蛋白或其片段的轻链可变区的序列。
在一个实施方案中，分离的多核苷酸序列编码具有重链可变区和轻链可变区的结合蛋白或其片段，所述重链可变区和轻链可变区包含以下的氨基酸序列：(a)包含SEQ IDNO:1的重链可变区序列和包含SEQ ID NO：2的轻链可变区序列；(b)包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列和包含SEQ ID NO：4的轻链可变区序列；(c)包含SEQ ID NO:16的重链可变区序列和包含SEQ ID NO：17的轻链可变区序列；(d)包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列和包含SEQ ID NO：19的轻链可变区序列；或(e)包含SEQ ID NO:20的重链可变区序列和包含SEQ ID NO：21的轻链可变区序列。
在另一实施方案中，分离的多核苷酸序列编码具有重链可变区和轻链可变区的结合蛋白或其片段，所述重链可变区和轻链可变区包含以下的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:1为90％、95％或99％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO：2为90％、95％和99％相同的轻链可变区序列；(b)与SEQ ID NO:3为90％、95％或99％相同的重链可变区序列和与SEQID NO:4为90％、95％或99％相同的轻链可变区序列；(c)与SEQ ID NO:16为90％、95％或99％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:17为90％、95％或99％相同的轻链可变区序列；(d)与SEQ ID NO:18为90％、95％或99％相同性的重链可变区序列和与SEQ ID NO：19为90％、95％或99％相同的轻链可变区序列；或(e)与SEQ ID NO:20为90％、95％或99％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO：21为90％、95％或99％相同的轻链可变区序列。
如本领域已知的，包含编码本文公开的结合蛋白或其片段的序列的多核苷酸可以与一个或多个调节或控制序列融合，并且可以包含在如本领域已知的合适的表达载体或细胞中。编码重链或轻链可变结构域的多核苷酸分子中的每个可以独立地融合到编码恒定结构域(例如人恒定结构域)的多核苷酸序列，使得能够产生完整抗体。可替代地，多核苷酸或其部分可以融合在一起，提供用于产生单链抗体的模板。
为了重组生产，将编码结合蛋白或其片段的多核苷酸***到可复制载体中用于克隆(DNA的扩增)或用于表达。用于表达结合蛋白或其片段的许多合适的载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
本文公开的结合蛋白或其片段也可以作为融合多肽产生，其中结合蛋白与异源多肽融合，所述异源多肽例如信号序列或在成熟蛋白或多肽的氨基末端处具有特异性切割位点的其他多肽。所选择的异源信号序列通常是被细胞识别和处理(即，被信号肽酶切割)的信号序列。对于原核细胞，信号序列可以被原核信号序列取代。信号序列可以是例如碱性磷酸酶、青霉素酶、脂蛋白、热稳定的肠毒素II前导子等。对于酵母分泌，天然信号序列可以例如用从酵母转化酶α因子(包含木糖苷酶和克鲁维酵母α因子前导子)、酸性磷酸酶、白色念珠菌葡糖淀粉酶或WO 90/13646中描述的信号获得的前导序列取代。在哺乳动物细胞中，可以使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导物，例如单纯疱疹gD信号。此类前体区域的DNA在阅读框中连接至编码结合蛋白或其片段的DNA。
表达和克隆载体包含使载体能够在一个或多个所选的细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是使载体能够独立于宿主染色体DNA复制并且包括复制起点或自主复制序列的序列。此类序列对于多种细菌、酵母和病毒是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，并且各种病毒起点(SV40、多瘤、腺病毒、SVV和BPV)可用于克隆哺乳动物细胞中的载体。通常，对于哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常可以仅使用SV40起点，因为它包含早期启动子)。
表达和克隆载体可以包含编码选择性标志物的基因以促进表达的鉴定。典型的选择性标志物基因编码赋予抗生素或其他毒素抗性的蛋白质，例如氨苄西林、新霉素、甲氨喋呤或四环素，或可替代地，是补体营养缺陷，或在其他替代方案中，供应不存在于复杂培养基中的特定营养物，例如编码杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
细胞培养
用于产生如本文所公开的结合蛋白或其片段的细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)、Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、FreeStyleTM(Cibco)和Dulbeco改良的Eagle培养基((DMEM)、Sigma)适用于培养宿主细胞。这些或其他培养基中的任一种可以根据需要补充有激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(如通常以微摩尔或较低范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件(例如温度、pH等)包括先前与选择用于表达的细胞一起使用的那些，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。
非治疗用途
本文所述的结合蛋白可用作亲和纯化剂。在此过程中，使用本领域中熟知的方法将结合蛋白固定在固相(例如蛋白A树脂)上。使固定的结合蛋白与含有待纯化的PD-L1、TGFβ和/或CD137蛋白(或其片段)的样品接触，并且此后用合适的溶剂洗涤载体，所述溶剂将基本上去除样品中的所有材料，除了结合至固定的结合蛋白的PD-L1、TGFβ和/或CD137蛋白之外。最后，用另一种合适的溶剂洗涤载体，所述溶剂将从结合蛋白释放PD-L1、TGFβ和/或CD137蛋白。
本文公开的结合蛋白也可用于诊断测定以检测和/或定量PD-L1、TGFβ和/或CD137蛋白，例如检测特定细胞、组织或血清中的PD-L1、TGFβ和/或CD137表达。结合蛋白可以以诊断方式用于例如监测疾病的发展或进展，作为临床测试程序的一部分，以例如确定给定治疗和/或预防方案的功效。可以通过将结合蛋白偶联至可检测物质来促进检测。可检测物质的实例包含各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层摄影的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。关于金属离子，参见例如美国专利第4,741,900号，根据本公开，所述金属离子可以与结合蛋白缀合以用作诊断。
结合蛋白可以用于诊断PD-L1、TGFβ和/或CD137相关病症(例如，以PD-L1、TGFβ和/或CD137的异常表达为特征的病症)的方法中，或者用于确定受试者是否具有发展PD-L1、TGFβ和/或CD137相关病症的增加的风险。此类方法包括使来自受试者的生物样品与本文公开的结合蛋白接触，以及检测分子与PD-L1、TGFβ和/或CD137的结合。“生物样品”意指从个体、细胞系、组织培养物或潜在地表达PD-L1、TGFβ和/或CD137的其他细胞来源获得的任何生物样品。用于从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域熟知的。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括将患者样品中的PD-L1、TGFβ和/或CD137的水平与对照样品(例如，没有PD-L1、TGFβ和/或CD137相关病症的受试者)进行比较，以确定患者是否患有PD-L1、TGFβ和/或CD137相关病症或处于发展PD-L1、TGFβ和/或CD137相关病症的风险中。
在一些实施方案中，例如出于诊断目的，用可检测部分标记结合蛋白将是有利的。许多可检测标记物是可用的，包括放射性同位素、荧光标记、酶底物标记物等。标记物可以使用各种已知技术间接地与结合蛋白缀合。例如，结合蛋白可以与生物素缀合，并且上述三种广泛类别的标记物中的任何一种可以与抗生物素蛋白缀合，或者反之亦然。生物素选择性地与抗生物素蛋白结合，因此，标记物可以以这种间接方式与结合蛋白缀合。可替代地，为了实现标记与结合蛋白的间接缀合，结合蛋白可以与小半抗原(例如地高辛)缀合，并且上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合。因此，可以实现标记物与结合蛋白的间接缀合。
示例性的放射性同位素标记物包括35S、14C、125I、3H和131I。可以使用例如《当前免疫学方案(Current Protocols in Immunology)》，第1和2卷，1991，Coligen等人编辑Wiley-Interscience，纽约州，纽约市，Pubs.中描述的技术，用放射性同位素来标记结合蛋白。可以例如通过闪烁计数来测量放射性。
示例性的荧光标记物包括源自稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物的标记，罗丹明及其衍生物、丹磺酰、赖氨酸、藻红蛋白和德克萨斯红是可用的。荧光标记物可以经由已知技术，例如《免疫学中的当前方案(Current Protocols in Immunology)》中公开的技术与结合蛋白缀合。荧光可以使用荧光计定量。
存在本领域中已知的各种充分表征的酶底物标记物(参见例如美国专利第4,275,149号)。酶通常催化可以使用各种技术测量的显色底物的化学改变。例如，改变可以是可以分光光度测量的底物中的颜色变化。可替代地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于定量荧光的变化的技术。化学发光底物变得被化学反应电子激发，然后可以发射光，所述光例如可以使用化学发光计测量，或向荧光受体提供能量。
酶促标记物的实例包括荧光素酶，如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利第4,737,456号)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与结合蛋白缀合的技术描述于例如O'Sullivan等人,1981,用于制备用于酶免疫测定的酶-抗体缀合物的方法(Methods for the Preparationof Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)，载于《酶学方法(Methods in Enzym.》)(J.Langone&H.Van Vunakis编辑)，学术出版社，纽约州，73:147-166.
酶-底物组合的实例包括例如：以过氧化氢酶为底物的辣根过氧化物酶(HRPO)，其中过氧化氢酶氧化染料前体如邻苯二胺(OPD)或3,3,5,5-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)；以对硝基苯磷酸为显色底物的碱性磷酸酶；和具有生色底物的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)，如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。
在另一实施方案中，本文公开的结合蛋白用于未标记，，并且用结合结合蛋白的标记的抗体检测。
本文所述的结合蛋白可以用于任何已知的测定方法，例如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。参见例如Zola，《单克隆抗体：技术手册(MonoclonalAntibodies:AManual of Techniques)》，第147-158页(CRC出版公司，1987)。
本文公开的结合蛋白可以用于抑制PD-L1、TGFβ和/或CD137与其相应受体的结合。此类方法包括将本文公开的结合蛋白施用于细胞(例如哺乳动物细胞)或细胞环境，由此抑制由受体介导的信号传导。这些方法可以在体外或体内进行。“细胞环境”意指细胞周围的组织、培养基或细胞外基质。
组合物和治疗方法
本公开还提供了组合物，包括例如药物组合物，所述组合物包含本文公开的结合蛋白。此类组合物具有用于治疗、预防或改善疾病或病症如癌症的许多治疗用途。
本公开还提供了用于治疗或预防癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本文公开的结合蛋白和任选地另一种基于免疫的疗法的组合物或制剂。
所公开的结合蛋白也可单独(例如，作为单一疗法)或与其他免疫治疗剂和/或化学疗法组合用于治疗癌症的方法。
结合蛋白可以单独或与可用于治疗免疫介导的炎性病症或自身免疫性疾病的其他组合物组合施用。
在一些方面，提供了一种组合物，例如药物组合物，其包含本文公开的一种或多种结合蛋白。药物组合物可以按照常规技术与药学上可接受的载剂或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂一起配制，所述常规技术例如在《雷明顿:药学的科学与实践《(Remington:The Science and Practice of Pharmacy》，第19版，Gennaro编辑，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，Pa.)，1995中公开的技术。
通常，用于通过注射施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，药物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂，如利诺卡因，，以缓解注射部位处的疼痛。通常，成分单独地供应或以单位剂型混合地供应，例如，在气密密封容器中作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物供应，所述容器例如指示活性剂的量的安瓿或小袋。在药物将通过输注施用的情况下，它可以分配有含有无菌药物级水或盐水的输注瓶。在药物通过注射施用的情况下，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，使得可以在施用之前混合成分。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用的途径，活性化合物，即抗体、双特异性分子和多特异性分子，可以涂覆在材料中以保护化合物免受酸的作用和可能使化合物失活的其他天然条件。
组合物可以通过本领域中已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将根据期望的结果而变化。活性化合物可以用载体制备，所述载体将保护化合物免受快速释放，例如控释制剂，包含植入物、透皮贴剂和微囊封递送***。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法是本领域技术人员通常已知的。参见例如《持续和受控释放药物递送***(Sustained和Controlled Release Drug Delivery Systems)》，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker公司，纽约州，1978。
可以改变药物组合物中活性成分的剂量水平，以便获得有效实现对特定受试者、组合物和施用模式的期望治疗应答而不会对受试者有毒的活性成分的量。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，，包括所采用的特定组合物的活性、施用的途径、施用的时间、所采用的特定化合物的***速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、总体健康状况和既往病史等医学领域熟知的因素。
本文所述的药物组合物可以一有效量施用。“有效量”是指单独地或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病或特定病状的情况下，期望的反应优选地涉及疾病过程的抑制。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。
在一些方面，将本文所述的组合物例如体内施用于患者，以治疗或预防多种病症，例如本文所述的那些病症。优选的患者包含患有可以通过施用本文公开的结合蛋白来校正或改善的病症的人类患者。
在一些方面，常规的基于病毒的基因转移方法和基于非病毒的基因转移方法可以用于在哺乳动物细胞或靶组织中引入编码如本文所述的抗体或其衍生物的核酸。此类方法可以用于在体外将编码抗体的核酸施用于细胞。在一些实施方案中，编码抗体或其衍生物的核酸被施用用于体内或离体基因疗法用途。在其他实施方案中，基因递送技术用于研究抗体在基于细胞的或动物模型中的活性。非病毒载体递送***包括DNA质粒、裸核酸和与递送媒介物如脂质体复合的核酸。病毒载体递送***包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞之后具有游离型基因组或整合的基因组。此类方法是本领域熟知的。
非病毒递送编码本公开的工程改造多肽的核酸的方法包括脂质转染、微注射、生物弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子和DNA的药剂增强摄取。脂质转染方法和脂质转染试剂是本领域熟知的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适合于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的阳离子脂质和中性脂质。递送可以是递送至细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。脂质:核酸复合物(包括靶向脂质体，如免疫脂质复合物，)的制备是本领域技术人员熟知的。
使用基于RNA或DNA病毒的***递送编码本文所述的抗体的核酸利用了高度演进的过程，用于将病毒靶向体内的特定细胞并将病毒有效载荷运输至细胞核。病毒载体可以直接施用于患者(体内)，或者它们可以用于在体外治疗细胞，并且将经修饰的细胞施用于患者(离体)。用于递送本公开的多肽的常规基于病毒的***可以包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体以用于基因转移。病毒载体目前是靶细胞和组织中最有效和最通用的基因转移方法。逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可以整合到宿主基因组中，通常导致***的转基因的长期表达。另外，已经在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。所标识的所有专利和出版物均明确地通过引用并入本文，用于描述和公开例如此类出版物中描述的可能与本公开结合使用的方法的目的。提供这些出版物仅仅是为了在本申请的申请日之前公开它们。这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人没有权利凭借在先发明或任何其他原因而先于此类公开。关于这些文件的内容的日期或陈述的所有陈述均基于申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
实施例
一般方法
描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法和电泳。参见例如Coligan等人(2000)《蛋白质科学的当前方案(Current Protocols in Protein Science)》，第1卷，约翰·威利父子公司，纽约州。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生和蛋白质的糖基化。参见例如Coligan等人(2000)《蛋白质科学的当前方案》，第2卷，约翰·威利父子公司，纽约州；Ausubel等人，(2001)《分子生物学的当前方案(Current Protocolsin Molecular Biology)》，第3卷，约翰·威利父子公司，纽约州，纽约市，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich公司(2001)《生命科学研究产品(Products for Life ScienceResearch)》，密苏里州圣路易斯市(St.Louis，Mo.)；第45-89页；Amersham PharmaciaBiotech(2001)BioDirectory，新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,N.J.)第384-391页。描述了多克隆抗体和单克隆抗体的产生、纯化和片段化。Coligan等人(2001)《免疫学的当前方案(Current Protcols in Immunology)》，第1卷，约翰·威利父子公司，纽约州；Harlow和Lane(1999)《使用抗体(Using Antibodies)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约州；Harlow和Lane，同上。
根据制造商的程序，通过HiTrap蛋白G柱(GE，目录号17040401)纯化含有抗PD-L1或抗CD137抗体的杂交瘤或细胞培养上清液。简而言之，上清液用DPBS(Gibco，目录号14190-136)平衡5CV，并且在环境温度和3分钟停留时间下经由注射器/输注泵(Legato200，KDS)装载。用5CV的DPBS洗涤该柱，并且用4CV的pH 2.8洗脱缓冲液(FisherScientific，目录号PI21004)进行洗脱。对洗脱液进行分级，并且用1M Tris-HCL(pH 8.5)(Fisher Scientific，目录号50-843-270)中和级分，并通过A280(DropSense96，Trinean)进行测定。汇集峰级分，并且将缓冲液交换到DPBS中。将离心过滤器(EMD Millipore，目录号UFC803024)在DPBS以4,000x g平衡2分钟。装载纯化的样品，加入DPBS，并且将样品以4,000x g旋转5-10分钟，直到总DPBS体积达到≥6DV。通过A280分析最终池。
描述了分子生物学中的标准方法。参见例如Maniatis等人(1982)《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州；Sambrook和Russell(2001)《分子克隆(Molecular Cloning)》、第3版、冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州；Wu(1993)《重组RNA(Recombinant DNA)》，第217卷，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.)。标准方法也出现在Ausbel等人(2001)《分子生物学中的当前方案》，第1-4卷，约翰·威利父子公司纽约州，纽约市，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
表达人PD-L1和CD137的稳定细胞系是通过使用基于电穿孔的转染或基于脂质的转染，用表达智人靶蛋白的基于pcDNA3.1的质粒转染选定的宿主细胞(即CHO-K1或HEK293)而产生的。使用遗霉素或嘌呤霉素来选择整合的细胞。在抗生素选择7-10天后，通过FACS或使用标记的抗体的连续稀释来分离稳定的克隆。在扩增后，通过流式细胞术进一步确认稳定克隆的靶蛋白表达。使用基于脂质的转染分别在HEK293T细胞中瞬时表达小鼠和食蟹猴靶标。
用于杂交瘤克隆的重链和轻链可变区的序列如下所述确定。使用来自Qiagen(Germantown，MD，USA)的RNeasy Plus Mini试剂盒从1-2x106个杂交瘤细胞中提取总RNA。通过使用来自Takara(Mountainview，美国加利福尼亚州)的SMARTer RACE 5'/3'试剂盒进行5'RACE反应来产生CDNA。使用来自NEB(美国马萨诸塞州伊普斯威奇市(Ipswich，MA,美国))的Q5高保真DNA聚合酶进行PCR，使用Takara通用引物混合物结合适当免疫球蛋白的3'小鼠恒定区的基因特异性引物从重链和轻链扩增可变区。将重链和轻链的扩增的可变区在2％琼脂糖凝胶上电泳，切下合适的条带，然后使用来自Qiagen的Mini Elute凝胶提取试剂盒对凝胶进行纯化。纯化的PCR产物使用来自Invitrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)的Zero Blunt PCR克隆试剂盒来克隆，转化到来自Takara的Stellar感受态大肠杆菌细胞中，并铺在LB琼脂+50ug/ml卡那霉素板上。由GeneWiz(美国新泽西州南普莱恩菲尔德)进行直接菌落Sanger测序。使用IMGT V-QUEST分析所得的多核苷酸序列，以鉴定生产性重排并分析经翻译的蛋白质序列。CDR确定基于Kabat编号。
将所选的VH或VL链进行PCR扩增并克隆到基于pcDNA3.4的表达载体中，所述表达载体含有来自人IgG1(Uniprot P01857)或人κ轻链(UniProt P01834)的恒定区。按照提供商的Expi293表达***方案，将配对的表达重链和轻链的质粒转染到Expi293细胞(ThermoFisher Scientific)中。转染后5天，通过离心来收集培养上清液。使用蛋白A柱通过1步亲和纯化来纯化表达的抗体，并将缓冲液交换至PBS pH 7.2。
用于流式细胞术的方法，包括荧光活化细胞分选检测***是可用的。参见例如Owens等人(1994)《用于临床实验室实践的流式细胞术原则(Flow CytometryPrinciples for Clinical Laboratory Practice)》，约翰·威利父子公司，新泽西州霍博肯(Hoboken,N.J.)；Givan(2001)《流式细胞术(Flow Cytometry)》、第2版；Wiley-Liss，新泽西州霍博肯；Shapiro(2003)《实用流式细胞术(Practical Flow Cytometry)》，约翰·威利父子公司，新泽西州霍博肯。适用于修饰核酸的荧光试剂，包括核酸引物和探针、多肽和抗体，例如用作诊断试剂，是可用的。《分子探针(Molecular Probes)》(2003)Catalogue，Molecular Probes公司，Eugene，Oreg.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue，密苏里州圣路易斯市。
用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的。参见例如Coligan等人(2001)《免疫学中的当前方案》，第4卷，John Wiley公司，纽约州。适合于表征具有特定作用机制的抗体的标准抗体功能表征方法也是本领域技术人员熟知的。
确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、CDR注释、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可用的。
基于US10,759,856(其中VH SEQ ID NO:24和VL SEQ ID NO:25)中公开的公开可获得的信息来制备基于抗PD-L1抗体(阿维鲁单抗)的内部抗PD-L1抗体，本文中称为“阿维鲁单抗-NR”(PC1)。PC1抗体用于建立用于评估和表征本文公开的抗PD-L1特异性抗体的功能测定。
基于US 7,288,638(其中VH SEQ ID NO:3和VL SEQ ID NO:6)中公开的公开可获得的信息来制备基于抗CD137抗体(乌瑞芦单抗)的内部抗CD137抗体，本文称为“乌瑞芦单抗-NR”(PC2)。基于US 8,337,850(其中VH SEQ ID NO:43和VL SEQ ID NO:45)中公开的公开可获得的信息来制备第二内部CD137反应性抗体(乌托鲁单抗)，在本文中称为“乌托鲁单抗-NR”(PC3)。PC2和PC3抗体用于确认实施例中使用的细胞系中CD137的表达，并且建立用于评估和表征本文公开的抗CD137特异性抗体的结合和功能测定。本申请中的实施例18和22说明，所公开的双特异性和三特异性与乌瑞芦单抗-NR和乌托鲁单抗-NR相比诱导更强的CD137信号传导和T细胞活化。
本文所用的参考序列示于表9中。
表9：参考序列
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实施例1：产生结合PD-L1的结合蛋白
通过免疫人Ig转基因小鼠、表达人抗体VH和VL基因的Trianni小(参见例如WO2013/063391、小鼠)来产生完全人抗人PD-L1抗体。
基于尾部或脚垫注射，通过经由腹膜内(IP)、皮下(SC)注射重组人PD-L1蛋白来免疫上述免疫-TRIANNI小鼠。
通过眶后出血来监测免疫应答。通过ELISA、流式细胞术(FACS)或成像来筛选血浆(如下所述)。具有足够抗PD-L1滴度的小鼠用于融合。在处死和移除脾脏和***之前，在尾根、足垫处或用免疫原静脉内强化小鼠。
产生抗PD-L1抗体的小鼠的选择-为了选择产生结合PD-L1的抗体的小鼠，通过ELISA、FACS或成像来筛选来自免疫小鼠的血清以用于结合至人PD-L1蛋白，表达PD-L1蛋白的细胞(用PD-L1基因转染的HEK293T)而不是不表达PD-L1的对照细胞(HEK293T细胞)。
对于ELISA，简单地说，将包被有重组人PD-L1(AcroBiosystems，目录号：PD1-H5229)的ELISA板与来自免疫小鼠的血清稀释液在室温下一起温育1小时，洗涤测定板，并在室温下温育1小时后用HRP标记的抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号：109-035-088)检测特异性抗体结合，洗涤，然后用ABTS底物(Moss，目录号：ABTS-1000)在室温下温育30分钟。使用ELISA板读取器(Biotek)来读取板。
对于FACS，简单地说，将PD-L1-HEK293T细胞或亲代HEK293T细胞与来自免疫小鼠的血清稀释液在4℃下一起温育2小时。将细胞用2％PFA(Alfa Aesar，目录号：J61899)在4℃下固定15分钟，然后洗涤。在4℃下温育1小时后，用Alexa 647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(ThemoFisher Scientific，目录号：A-21445)检测特异性抗体结合。在流式细胞术仪器(Intellicyte，IQue plus，Sartorius)上进行流式细胞术分析。
另外，通过成像来测试小鼠血清。简单地说，将PD-L1-HEK293T细胞与来自免疫小鼠的血清稀释液一起温育。将细胞洗涤，用多聚甲醛固定，洗涤，用二级Alexa488山羊抗小鼠抗体和Hoechst(Invitrogen)来检测特异性抗体结合。在成像机(Cytation 5，Biotek)上扫描和分析板。
产生针对PD-L1的抗体的杂交瘤的产生-为了产生产生本发明的人抗体的杂交瘤，从免疫小鼠中分离脾细胞和***细胞，并将其融合到适当的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。对所得的杂交瘤进行抗原特异性抗体的产生筛选。例如，通过电融合将来自免疫小鼠的脾细胞、***细胞的单细胞悬浮液与等数量的Sp2/0非分泌小鼠IgG骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将细胞铺板在平底96孔组织培养板中，然后在选择培养基(HAT培养基)中温育约一周，然后切换到杂交瘤培养基。在细胞铺板后约10-14天，如上所述通过ELISA、成像或FACS筛选来自各个孔的上清液。将分泌抗体的杂交瘤转移到24孔板中，再次筛选，并且如果抗PD-L1仍然呈阳性，则通过使用单细胞分选器进行分选来亚克隆阳性杂交瘤。如上所述，通过ELISA、成像或FACS来再次筛选亚克隆。然后将稳定的亚克隆在体外培养以产生少量抗体用于纯化和表征。
实施例2：结合PD-L1的mAb与人、小鼠和食蟹猴PD-L1蛋白的结合特异性
通过ELISA来评估所公开的抗PD-L1抗体(1923Ab2和1923Ab3)对不同种类的PD-L1蛋白的结合特异性。简言之，将人重组PD-L1蛋白(Acro Biosystems，目录号：PD1-H5229)、食蟹猴PD-L1蛋白(Acro Biosystems，目录号：PD1-C52H4)和小鼠PD-L1蛋白(AcroBiosystems，目录号：PD1-M5220)直接包被到ELISA板上。然后将1923Ab2和1923Ab3添加到板中，然后通过过氧化物酶AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG、Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch，目录号：115-036-071)或过氧化物酶AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch，目录号：109-036-098)进行检测。在添加ABTS底物(Moss，目录号：ABTS-1000)之后，使用Synergy Neo2多模式读取器(Bioteck，SN#：180213F)来读取ELISA板。
图2A和B显示了所公开的抗PD-L1抗体以剂量依赖性方式与人和食蟹猴PD-L1蛋白的结合活性，但不与小鼠PD-L1结合；同种型对照mIgG或hIgG1不与任何物种PD-L1结合。所公开的抗PD-L1抗体与人、食蟹猴PD-L1蛋白的ELISA结合EC50值在图2A和图2B中提供。
实施例3：重组抗PD-L1对人PD-L1的结合亲和力
用人IgG1或人IgG1变体的恒定区从Expi293来表达和纯化重组抗PD-L1抗体。使用免疫荧光成像测定来评估抗PD-L1抗体的结合亲和力。
在HEK293T-PD-L1细胞上测试了抗PD-L1抗体的细胞结合亲和力。将细胞铺板在含有具有10％ FBS的DMEM的完全培养基中，然后在37℃下温育过夜。抗PD-L1抗体被连续稀释并加入到测定板中，在4℃下温育2小时，然后在室温下固定细胞15分钟。用PBS洗涤固定的细胞三次，然后用Alexa 488山羊抗人IgG(H+L)二级抗体(Invitrogen，目录号：A-11013)在室温下染色1小时以用于检测。通过对细胞进行成像并使用Cytation(Biotek、VT)定量荧光强度来评估结合信号。
结合结果显示，1923Ab3表现出与在细胞表面上表达的PD-L1的强结合。1923Ab3的结合亲和力类似于参考抗体阿替利珠单抗(Roche)。1923Ab3和阿替利珠单抗与人PD-L1的结合EC50分别被确定为0.18nM和0.21nM(参见图3)。
实施例4：PD-L1抗体对PD-1/PD-L1相互作用的影响
PD-L1抗体对PD-1和PD-L1的相互作用的影响通过由Promega(美国麦迪逊(Madison、USA))开发的PD-1/PD-L1抑制生物测定来确定。该测定是基于荧光素酶细胞的测定，其由两种基因工程改造的细胞系组成：PD-1效应细胞，其是在细胞表面上表达人PD-1的Jurkat T细胞和由NFAT应答元件(NFAT-RE)驱动的稳定整合的荧光素酶报告基因，以及人工APC细胞，其是表达细胞表面人PD-L1的CHO-K1细胞和被设计成以抗原非依赖性方式激活同源TCR的工程改造细胞表面蛋白。当这两种细胞类型共培养时，PD-1/PD-L1相互作用抑制TCR信号传导，导致发光信号的减少。添加阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗体去除抑制信号，导致TCR的激活，并且增加发光。
根据制造商的方案使用含有10％热灭活胎牛血清(Sigma，目录号：17H165)的Ham的F-12K培养基(ThermoFisher，目录号：21127022)来培养人工APC CHO-K1细胞(Promega，目录号：J109A)。将这些人工APC细胞铺在384孔白色TC处理的板(Corning，目录号：3570)中。将板在37℃、5％ CO2下温育16小时。去除上清液并且添加连续稀释的抗体。根据制造商的方案使用含有10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640(ThermoFisher，目录号：11875-085)来培养PD-1效应细胞(Promega，目录号：J115A)。将效应细胞添加到含有人工APC细胞和抗体的白色384孔板中。将板在37℃、5％ CO2下温育6小时。在平衡至室温后，将One-Glo荧光素酶试剂(Promega，目录号：E6130)添加到每个孔中。然后将板在室温下温育5分钟，并且使用Synergy Neo2板读取器(Biotek)来测量发光。使用GraphPad Prism软件分析数据。
图4显示，1923Ab2和1923Ab3抗体两者均有效地抑制PD1/PD-L1相互作用，这导致测定中发光信号的恢复。将1923Ab2、1923Ab3和阿替利珠单抗对PD1/PD-L1阻断的IC50分别确定为0.90nM、0.43nM和0.29-0.31nM。
实施例5：产生结合CD137的结合蛋白
通过免疫人Ig转基因小鼠、表达人抗体VH和VL基因的Trianni小(参见例如WO2013/063391，小鼠)来产生完全人抗人CD137抗体。
通过注射免疫原对上述免疫-TRIANNI小时进行免疫，所述免疫原包括用人CD137基因和重组人CD137 ECD蛋白稳定转染的HEK293细胞。经由腹膜内(IP)、皮下(SC)、尾根或足垫注射对TRIANI小鼠进行免疫。
通过眶后出血来监测免疫应答。通过ELISA、流式细胞术(FACS)或成像来筛选血浆(如下所述)。具有足够抗CD137滴度的小鼠用于融合。在处死和移除脾和***之前，用免疫原在尾根或足垫处腹膜内强化小鼠。
产生抗CD137抗体的小鼠的选择-为了选择产生结合CD137的抗体的小鼠，通过ELISA、FACS或成像来筛选来自免疫小鼠的血清以用于结合至人CD137蛋白，表达CD137蛋白的细胞(用CD137基因转染的HEK293T)而不是不表达CD137的对照细胞(HEK293T细胞)。
对于ELISA，简单地说，将包被有重组人CD137(R&D、目录号：9220-4B)的ELISA板与来自免疫小鼠的血清稀释液在室温下一起温育1小时，洗涤测定板，并在室温下温育1小时后用HRP标记的抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号：109-035-088)检测特异性抗体结合，洗涤，然后用ABTS底物(Moss，目录号：ABTS-1000)在室温下温育30分钟。使用ELISA板读取器(Biotek)来读取板。
对于FACS，简单地说，将CD137-HEK293T细胞或亲代HEK293T细胞与来自免疫小鼠的血清稀释液在4℃下一起温育2小时。将细胞用2％PFA(Alfa Aesar，目录号：J61899)在4℃下固定15分钟，然后洗涤。在4℃下温育1小时后，用Alexa 647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(ThemoFisher Scientific，目录号：A-21445)检测特异性抗体结合。在流式细胞术仪器(Intellicyte，IQue plus，Sartorius)上进行流式细胞术分析。
另外，通过成像来测试小鼠血清。简单地说，将CD137-HEK293T细胞与来自免疫小鼠的血清稀释液一起温育。将细胞洗涤，用多聚甲醛固定，洗涤，用二级Alexa488山羊抗小鼠抗体和Hoechst(Invitrogen)来检测特异性抗体结合。在成像机(Cytation 5，Biotek)上扫描和分析板。
产生针对CD137的抗体的杂交瘤的产生-为了产生产生本发明的人抗体的杂交瘤，从免疫小鼠中分离脾细胞和***细胞，并将其融合到适当的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。对所得的杂交瘤进行抗原特异性抗体的产生筛选。例如，通过电融合将来自免疫小鼠的脾细胞、***细胞的单细胞悬浮液与等数量的Sp2/0非分泌小鼠IgG骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将细胞铺板在平底96孔组织培养板中，然后在选择培养基(HAT培养基)中温育约一周，然后切换到杂交瘤培养基。在细胞铺板后约10-14天，如上所述通过成像或FACS筛选来自各个孔的上清液。将分泌抗体的杂交瘤转移到24孔板中，再次筛选，并且如果抗CD137仍然呈阳性，则通过使用单细胞分选器进行分选来亚克隆阳性杂交瘤。如上所述，通过成像或FACS来再次筛选亚克隆。然后将稳定的亚克隆在体外培养以产生少量抗体用于纯化和表征。
实施例6：重组抗CD137抗体对人、小鼠和食蟹猴CD137的结合亲和力
使用用人、小鼠或食蟹猴CD137表达构建体稳定转染的HEK293T细胞，用免疫荧光成像测定来分析抗CD137 mAb的结合亲和力。这些细胞系在细胞表面表达CD137蛋白的物种特异性形式。将细胞铺板在含有具有10％ FBS的DMEM的完全培养基中，然后在37℃下温育过夜。在4℃下用抗CD137的系列稀释液对细胞染色2小时，然后在室温下固定细胞15分钟。固定的细胞用PBS洗涤三次，然后用Alexa 488山羊抗人IgG(H+L)二级抗体(Invitrogen，目录号：A-11013)在室温下染色1小时用于检测。通过对细胞成像并使用Biotek Cytation量化荧光强度来评估结合信号。
结果显示，1923Ab4(图5A)、1923Ab5(图5B)和1923Ab6(图5C)抗体有效地与细胞表面的人和食蟹猴CD137结合。然而，它们都没有显示出与小鼠CD137的结合。1923Ab4、1923Ab5和1923Ab6与人CD137的结合EC50分别被确定为0.29nM、1.62nM和10.5nM。1923Ab4、1923Ab5和1923Ab6与食蟹猴CD137的结合EC50分别被确定为0.22nM、2.77nM和4.23nM。
还进行了该实验以比较1923Ab4、1923Ab5和1923Ab6抗体与参考抗体的结合亲和力，所述参考抗体包括PC2乌瑞芦单抗-NR(BMS)和PC3乌托鲁单抗-NR(辉瑞)。1923Ab4抗体显示了乌瑞芦单抗-NR和乌托鲁单抗-NR与人CD137相似的结合亲和力(图6)。与参考抗体相比，1923Ab5和1923Ab6抗体显示出较弱的结合。
实施例7：CD137配体竞争
为了评估所公开的抗CD137抗体阻断CD137配体与CD137结合的能力，通过生物层干涉测量法(Gator Bio，CA)测试了所公开的抗体1923Ab4、1923Ab5和1923Ab6以及两种参考抗体PC2乌瑞芦单抗-NR和PC3乌托鲁单抗-NR。据报道，乌瑞芦单抗-NR和乌托鲁单抗-NR分别是非配体和配体封闭抗体。
简而言之，首先将链霉亲和素探针(Probe Life，目录号：PL168-1600002)加载到含有测定缓冲液(含有0.02％ Tween20和0.05％叠氮化钠的PBS)的96孔板中持续30秒(基线步骤)。然后将探针加载到含有CD137L His-Avi-Tag蛋白(BPS Bioscience，目录号：100238；10ug/ml)的96孔中持续180秒(加载步骤，以捕获生物素-CD137L)，随后是30秒的基线步骤。之后，允许装载CD137L的探针结合CD137蛋白(R&D，目录号：9220-4B；10ug/ml)持续180秒，随后与浓度为10ug/ml的公开的抗体或参考抗体缔合180秒。
使用由制造商(Gator Bio，CA)提供的软件来处理数据。1923Ab5、1923Ab6和乌瑞芦单抗-NR结合到装载在探针上的CD137/CD137L复合物上。然而，1923Ab4和乌托鲁单抗-NR未显示与装载探针上的CD137/CD137L复合物的结合。这些结果表明1923Ab4和乌托鲁单抗-NR具有配体阻断活性。1923Ab5、1923Ab6和乌瑞芦单抗-NR与CD137的不位于配体结合位点中的区域结合(图7)。
实施例8：在NFκB荧光素酶报告基因测定中抗CD137抗体的交联依赖性激动活性
使用NFκB荧光素酶报告基因测定来评估抗体的激动剂活性。使用用人CD137表达质粒和NFκB荧光素酶报告质粒稳定转染的293T细胞来测量抗CD137抗体的激动活性。这些报告细胞(HEK-CD137报告细胞)用抗CD137抗体或含有测试的抗CD137抗体和3:1比率的交联抗体(抗人Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch Lab，目录号：109-005-098)的混合物刺激，并在37℃下用5％ CO2温育16小时。加入ONE-GloTM荧光素酶试剂(Promega，目录号：E6130)，并且将板在室温下温育10分钟。通过Synergy Neo2板读取器(Biotek)来测量发光信号，并通过GraphPad Prism分析数据。
已经报道用作对照抗体的PC3乌托鲁单抗-NR是针对CD137信号传导的交联依赖性激动性抗体。如图8所示，与同种型对照相比，所有测试的抗体在不存在交联抗体的情况下都显示出非常小的激动活性。然而，除了同种型对照之外，所有测试的抗体都通过抗人Fcγ强烈活化的NFκB荧光素酶基因表达交联。结果表明，1923Ab4、1923Ab5和1923Ab6抗体的激动活性是交联依赖性的。
实施例9：在人原代T细胞活化测定中抗CD137抗体的交联依赖性激动活性
在T细胞活化测定中进一步证实抗体的激动剂活性。人PBMC由健康供体制备。这些人PBMC在补充有10％ FBS和0.5μg/ml小鼠抗hCD3克隆OKT3(Biolegend，目录号：317325)的RPMI1640培养基中以1x 106个细胞/mL的密度培养。添加抗CD137抗体或含有测试的抗CD137抗体和3:1比率的交联抗体的混合物以刺激T细胞。将板在37℃下用5％ CO2温育3天。在温育72小时后，使用上清液以通过AlphaLISA(PerkinElmer，目录号：AL217C/F)使用根据制造商的说明的方案来测量分泌的IFNγ。
据报道，用作阳性对照抗体的PC3乌托鲁单抗-NR是针对T细胞活化的交联依赖性激动性抗体。如图9所示，与同种型对照相比，用所公开的抗体处理的PBMC在不存在交联抗体的情况下不增加IFNγ的产生。然而，除了同种型对照之外，通过抗人Fcγ交联的所有测试的抗体都强烈地刺激IFNγ的产生。该结果表明，1923Ab4、1923Ab5和1923Ab6抗体以交联依赖性方式激活T细胞。
实施例10：在人CD137上1923Ab4的结合表位区的鉴定
CD137的胞外区包含四个富含半胱氨酸的结构域(CRD1-4)，其在物种中是保守的。为了鉴定与1923Ab4抗体结合需要哪个CRD结构域，通过将单独的人CRD结构域与小鼠对应物交换来制备人/小鼠杂交CD137表达构建体(图10A)。实施例6显示1923Ab4与人CD137结合，但不与细胞表面上的小鼠CD137结合。
通过基于流式细胞术的结合测定来分析抗CD137 1923Ab4与用人CD137(WT)或人/小鼠杂交CD137表达构建体(msCRD1-4)瞬时转染的HEK293T细胞的结合。将细胞在4℃下用1923Ab4染色2小时，然后在室温下固定细胞15分钟。固定的细胞用PBS洗涤三次，然后用Alexa 488山羊抗人IgG抗体(Invitrogen，目录号：A-11013)在室温下染色1小时用于检测。通过使用iQue Screener PLUS(Sartorius，MI)定量荧光强度来评估结合信号。
PC2乌瑞芦单抗-NR和PC3乌托鲁单抗-NR均结合至人CD137，但不结合至小鼠CD137。PC2和PC3与人CD137的结合分别通过CRD1和CRD3/4结构域进行。在此结合实验中，PC2仅在人CRD1结构域交换到小鼠CRD1结构域时丧失与CD137的结合，而PC3在人CRD3或CRD4结构域交换到小鼠对应物时丧失与CD137的结合(图10B-F)。所公开的抗体1923Ab4显示与用msCRD2、msCRD3和msCRD4表达构建体转染的细胞的结合降低(图10B-F)。这一结果表明1923Ab4通过CRD2、CRD3和CRD4区域与人CD137结合。
在图11A中，人和小鼠CRD4区域的序列比对揭示5个不同的差异。通过将人氨基酸序列改变成小鼠氨基酸序列来制备另外的表达构建体(M1至M5)。例如，通过定点诱变将M1区域中的人“CF”序列突变为小鼠“SL”序列。
通过基于流式细胞术的结合测定来分析抗CD137 1923Ab4与用人CD137(WT)或突变的CD137表达构建体(M1-M5)瞬时转染的HEK293T细胞的结合。将细胞在4℃下用1923Ab4染色2小时，然后在室温下固定细胞15分钟。固定的细胞用PBS洗涤三次，然后在室温下用Alexa 488山羊抗人IgG抗体(Invitrogen，目录号：A-11013)染色1小时用于检测。通过使用iQue Screener PLUS(Sartorius，MI)定量荧光强度来评估结合信号。
在图11D中，PC2乌瑞芦单抗-NR用作表达对照，其结合表位被映射到CRD1结构域(Chin、SM等人，《自然通讯(Nat Commun)》，2018年11月8日；9(1):4679)。将“KRGI”(SEQ IDNO:81)的人氨基酸序列改变为CD137的CRD4结构域的M2区域中的“NGTGV”(SEQ ID NO:77)的小鼠氨基酸序列极大地降低了其与所公开的抗体1923Ab4的结合。M1、M3、M4和M5上的诱变不会改变1923Ab4与在细胞表面上表达的CD137蛋白的结合活性(图11B、11C和11E-G)。
实施例11：使用HDX质谱法的在人CD137上1923Ab4的表位映射
使用结构域交换和诱变研究，显示1923Ab4通过CRD2、CRD3和CRD4结构域与人CD137结合(实施例10)。为了进一步确定1923Ab4与人CD137的结合位点，采用了氢氘交换(HDX)质谱法。由抗体结合的人CD137的区域(其被定义为表位)被保护免受氢/氘交换。由LC-MS揭示了消化的肽的质量差异。
重组CD137首先在单独或与1923Ab4抗体复合的氘氧化物中温育。氘交换在20℃下进行0秒、15秒、60秒、600秒或3600秒。通过低pH猝灭交换反应，并且用胃蛋白酶/脯氨酰内肽酶/XIII来消化蛋白质。CD137的消化肽的氘水平通过LC-MS上的质量转移进行监测。
在序列AA46-51(KGVFRT；SEQ ID NO:78)、AA65-90(CTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELT；SEQ ID NO:79)和AA104-107(DQKR；SEQ ID NO:80)处，重组CD137在结合至1923Ab4抗体时显示出氘摄取的显著降低(在图12中描绘为阴影条的区域)。该数据与实施例10中所示的结构域交换实验一致。重组CD137在序列AA46-51(KGVFRT；SEQ ID NO:78)、AA65-90(CTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELT；SEQ ID NO:79)和AA104-107(DQKR；SEQ ID NO:80)处显示出在结合至1923Ab4抗体时氘摄取的显著降低。描绘为阴影条的表位作图结果汇总于图12中。此数据与实施例10中所示的结构域交换实验一致
实施例12：结合PD-L1或CD137的scFv的制备
使用图1A中所示的针对PD-L1的全人单克隆抗体的可变区来制备具有(N)-VL-接头-VH-(C)或(N)-VH-接头-VL-(C)的结构的结合PD-L1的scFv。
使用图1B和图1C中所示的针对CD137的全人单克隆抗体的可变区来制备具有(N)-VL-接头-VH-(C)或(N)-VH-接头-VL-(C)的结构的结合CD137的scFv，其中在重链可变区的44的位置处的氨基酸残基“G”可以被“C”取代，并且在轻链可变区的100的位置处的氨基酸残基“G”可以被“C”取代。scFv中从“G”到“C”的此类氨基酸取代可以提高scFv作为双特异性抗体或三特异性抗体的一个靶特异性部分的稳定性。
实施例13：PD-L1/CD137双特异性的分子设计和产生
作为结合PD-L1的结合蛋白的代表性实例，制备了对称双特异性(PD-L1x CD137)，其特征在于图13J中所描绘的分子形式，所述分子形式包含图13和图14中概述的亚基/组分：
1923Ab18
1.重链：SEQ ID NO:50，其包含以下组分：抗PD-L1抗体的重链、接头和抗CD137scFv(具有CC的VH-VL)(N→C)；以及
2.轻链：SEQ ID NO:40，其包含抗PD-L1抗体轻链。
将具有编码1923Ab18的重链组分(SEQ ID NO:50)的多核苷酸序列的DNA区段1***到表达载体中，并且将具有编码1923Ab18的轻链(SEQ ID NO:40)的多核苷酸序列的DNA区段2***到表达载体中。
构建的表达载体在Expi293细胞(ThermoFisher)中瞬时表达，在Expi293表达培养基中在37℃的条件下在CO2培养箱中培养5天。双特异性抗体通过重组蛋白A亲和色谱法(Hitrap Mabselect SuRe，GE)从细胞培养上清液纯化，并且如果需要，通过离子交换色谱法或凝胶过滤色谱法进行第二步纯化。使用SE-HPLC柱(TOSO，G3000SWXL)和CE-SDS(SCIEX，PA800Plus)进行SDS-PAGE(BiRad)、尺寸排阻HPLC(Agilent，1100系列)分析，以检测和确认双特异性抗体的大小和纯度。将纯化的蛋白质缓冲液交换到所需的缓冲液中，并且使用Amicon Ultra 15 30K装置通过超滤浓缩，并且使用dropsense(Unchained Lab)来估计蛋白质浓度。瞬时转染可以用于双载体***中或与在一个单一载体中包含重链和轻链组分两者的单一载体***一起使用。可替代地，可以从稳定的CHO表达细胞系的上清液中纯化双特异性抗体。
实施例14：不对称PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的分子设计和产生
作为结合PD-L1的不对称结合蛋白的代表性实例，制备了三特异性(PD-L1 xCD137 x TGFβRII)，其特征在于图13C中所描绘的分子形式，所述分子形式包含图13和14中概述的亚基/组分：
1923Ab9
1.重链(杵)：SEQ ID NO:41，其包含以下组分：抗PD-L1抗体的重链、接头和抗CD137 scFv(具有CC的VH-VL)(N→C)；
2.重链(臼)：SEQ ID NO:42，其包含抗PD-L1抗体组分(N→C)的重链；以及
3.轻链：SEQ ID NO:39，其包含抗PD-L1抗体轻链。
将具有编码1923Ab9(SEQ ID NO:41)的重链(杵)组分的多核苷酸序列的DNA区段1***到表达载体中，将具有编码1923Ab9(SEQ ID NO:42)的重链(臼)组分的多核苷酸序列的DNA区段2***到表达载体中，并且将具有编码1923Ab9(SEQ ID NO:39)的轻链的多核苷酸序列的DNA区段3***到表达载体中。
构建的表达载体在Expi293细胞(ThermoFisher)中瞬时表达，在Expi293表达培养基中在37℃的条件下在CO2培养箱中培养5天。双特异性抗体通过重组蛋白A亲和色谱法(Hitrap Mabselect SuRe，GE)从细胞培养上清液纯化，并且如果需要，通过离子交换色谱法或凝胶过滤色谱法进行第二步纯化。使用SE-HPLC柱(TOSO，G3000SWXL)和CE-SDS(SCIEX，PA800Plus)进行SDS-PAGE(BioRad)、尺寸排阻HPLC(Agilent，1100系列)分析，以检测和确认三特异性抗体的大小和纯度。将纯化的蛋白质缓冲液交换到所需的缓冲液中，并且使用Amicon Ultra 15 30K装置通过超滤浓缩，并且使用dropsense(Unchained Lab)来估计蛋白质浓度。瞬时转染可以用于三载体***中或与在一个单一载体中包含重链和轻链组分两者的单一载体***一起使用。可替代地，可以从稳定的CHO表达细胞系的上清液中纯化双特异性抗体。
实施例15：PD-L1/TGFβ/CD137三特异性的分子设计和产生
作为结合PD-L1的对称结合蛋白的代表性实例，制备了三特异性(PD-L1x CD137 xTGFβRII，1923Ab17)，其特征在于图13I中描绘的分子形式，所述分子形式包含图13和图14中概述的亚基/组分：
1923Ab17
1.重链：SEQ ID NO:50，其包含所述组分、抗PD-L1抗体的重链、接头和抗CD137scFv(具有CC的VH-VL)(N→C)；以及
2.轻链：SEQ ID NO:39，其包含所述组分、抗PD-L1抗体的轻链、接头和TGFβRIIECD。
将具有编码1923Ab17(SEQ ID NO:50)的重链组分的多核苷酸序列的DNA区段(1)***到表达载体中，并且将具有编码1923Ab17(SEQ ID NO:39)的轻链组分的多核苷酸序列的DNA区段(2)***到表达载体中。
构建的表达载体在Expi293细胞(ThermoFisher)中瞬时表达，在Expi293表达培养基中在37℃的条件下在CO2培养箱中培养5天。如果有必要，通过重组蛋白A亲和色谱法(Hitrap Mabselect SuRe，GE)从细胞培养上清液纯化三特异性抗体，并且通过离子交换色谱法或凝胶过滤色谱法进行第二步纯化。使用SE-HPLC柱(TOSO，G3000SWXL)和CE-SDS(SCIEX，PA800Plus)进行SDS-PAGE(BioRad)、尺寸排阻HPLC(Agilent，1100系列)分析，以检测和确认三特异性抗体的大小和纯度。将纯化的蛋白质缓冲液交换到所需的缓冲液中，并且使用Amicon Ultra 15 30K装置通过超滤浓缩，并且使用dropsense(Unchained Lab)来估计蛋白质浓度。瞬时转染可以用于双载体***中或与在一个单一载体中包含重链和轻链组分两者的单一载体***一起使用。可替代地，可以从稳定的CHO表达细胞系的上清液中纯化双特异性抗体。
实施例16：结合PD-L1的双特异性和三特异性的表征：与CD137的结合
如实施例13至15中所述生成、产生和纯化双特异性抗体和三特异性抗体。为了检查这些抗体与CD137的结合活性，使用用人CD137表达构建体稳定转染的HEK293T细胞进行免疫荧光成像测定。该细胞系在细胞表面上表达人CD137蛋白。将细胞铺板在含有具有10％FBS的DMEM的完全培养基中，然后在37℃下温育过夜。将细胞在4℃下用这些抗体染色2小时，然后在室温下固定细胞15分钟。固定的细胞用PBS洗涤三次，然后用Alexa 488山羊抗人IgG(H+L)二级抗体(Invitrogen，目录号：A-11013)在室温下染色1小时用于检测。结合信号通过对细胞成像并使用Cytation 5(Biotek，VT)定量荧光强度来评估。
在图16A中，与1923Ab4相比，所有公开的双特异性抗体和三特异性抗体，包括1923Ab7、1923Ab8、1923Ab 9、1923Ab10和1923Ab11，在细胞表面上类似地与人CD137结合。该结果表明抗CD137的ScFv形式保留了与CD137的结合活性。
我们还使用1923Ab3作为ScFv形式来产生三特异性抗体。在图16B中，1923Ab7和1923Ab16两者都与通过流式细胞术测量的细胞表面上的人PD-L1类似地结合。该结果表明，1923Ab3和1923Ab4两者都可以用作所公开的双特异性抗体和三特异性抗体中的ScFv形式。
实施例17：结合PD-L1的双特异性和三特异性的表征：CD137信号传导
通过使用NFκB荧光素酶报告基因测定测量对CD137信号传导的激动剂活性来进一步评估这些抗体。使用用人CD137表达质粒和NFκB荧光素酶报告质粒稳定转染的293T细胞作为报告细胞。将这些报告细胞与表达PD-L1的293T细胞共培养，并且用抗体刺激，并且在37℃下用5％ CO2温育16小时。添加ONE-GloTM荧光素酶试剂(Promega，目录号：E6130)，并且将板在室温下温育10分钟。通过Synergy Neo2板读取器(Biotek，VT)测量发光信号，并且通过GraphPad Prism分析数据。CD137信号传导的激活导致发光信号的增加。
在图17A中，与同种型对照抗体相比，包括1923Ab7、1923Ab8、1923Ab9、1923Ab10和1923Ab11在内的所有公开的抗体都激活了CD137信号传导。与1923Ab9和1923Ab10相比，1923Ab7、1923Ab8和1923Ab11表现出更强的激动活性(图17A)。结果表明抗CD137的二价结合比抗CD137的单价结合诱导更强的CD137信号传导。
我们还使用1923Ab3作为ScFv形式来产生三特异性抗体。还使用表达重组CD137和NFκB荧光素酶报告基因的Jurkat T CD137报告细胞比较了这些抗体对CD137信号传导的激动活性。简而言之，Jurkat T NFkB报告细胞系用于测量CD137信号传导的活性，并且表达PD-L1的HEK293T细胞用作靶细胞以提供PD-L1。在图17B中，1923Ab7和1923Ab16两者都显示出与由Jurkat T CD137报告细胞测量的CD137信号传导相似的激动活性。1923Ab16与人PD-L1有效结合以激活CD137信号传导。
实施例18：双特异性和三特异性的表征-CD137信号传导的PD-L1依赖性激活
评价所公开的抗体诱导PD-L1依赖性CD137激动的能力。图18展示了1923Ab7、1923Ab8、1923Ab17和1923Ab18在存在靶细胞的情况下(18A)或在不存在靶细胞的情况下(18B)使用Jurkat T CD137报告细胞诱导CD137信号传导的能力。简而言之，表达CD137的Jurkat T NFkB报告细胞系用于测量CD137信号传导的活性，并且表达PD-L1的HEK293T细胞用作靶细胞以提供PD-L1。当报告细胞与靶细胞共培养时，所公开的抗体包括1923Ab7、1923Ab8、1923Ab17、1923Ab18和乌瑞芦单抗-NR显示出CD137信号传导的激活(图18A)。然而，除了乌瑞芦单抗-NR之外，没有一种公开的抗体在不存在靶细胞的情况下诱导CD137信号传导(图18B)。乌瑞芦单抗是由Bristol Myers Squibb开发的交联非依赖性抗体。这种抗体显示出临床疗效，但其开发受到肝毒性的限制。图18A、1923Ab7、1923Ab8、1923Ab17和1923Ab18显示了比乌瑞芦单抗更强的PD-L1依赖性CD137信号传导的诱导(Emax)。
实施例19：双特异性和三特异性的表征-抗CD137的scFv的位置
为了通过在所公开的双特异性抗体和三特异性抗体中的不同位置中融合抗CD137的ScFv来检查对CD137激动作用的影响，在存在或不存在表达PDL1的细胞的情况下使用Jurkat T CD137报告细胞。测试抗体的结构在图13和图14中示出。1923Ab19含有在抗体轻链的C末端处融合的1923Ab4的ScFv形式。1923Ab12和1923Ab13含有分别在抗体轻链和重链的N末端处融合的1923Ab4的ScFv形式。1923Ab17和1923Ab7是对照三特异性抗体。图19A证实，双特异性Ab 1923Ab19仅可以在存在表达PDL1的细胞的情况下诱导CD137信号传导。类似地，n1923Ab12和1923Ab13还以PD-L1依赖性方式诱导CD137信号传导(图19B)。
实施例20：双特异性和三特异性的表征-阻断PD-1/PD-L1相互作用
为了检查PDL1结合臂在双特异性抗体和三特异性抗体中阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用的作用，使用由Promega(Madison，USA)开发的PD-1/PD-L1抑制生物测定，如实施例4中所述。图20证明了包括1923Ab3、1923Ab7、1923Ab8、1923Ab17和1923Ab18在内的所有公开的抗体有效地阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用。阻断活性等同于临床批准的抗PD-L1抗体，如PC1阿维鲁单抗-NR和阿替利珠单抗。
实施例21：三特异性的表征-TGFβ活性的阻断
更高水平的转化生长因子β(TGFβ)与免疫逃逸、疗法抗性(化学疗法、放射、检查点抑制剂)和晚期恶性肿瘤中的不良结果相关。通过螯合肿瘤微环境(TME)中的TGFβ来抑制TGFβ信号传导导致非免疫细胞的表型变化和增强的免疫细胞的活化。因此，TGFβ的阻断为我们公开的双特异性抗体提供了完全接合免疫***的益处。为此，我们产生了三特异性抗体，例如1923Ab7和1923Ab17。使用TGF/SMAD信号传导通路SBE报告子-HEK293细胞系(BPSBioscience，CA)来检查这些抗体的TGFβ阻断活性。图21证实了1923Ab7和1923Ab17两者都有效地阻断TGFβ诱导的信号传导，其中IC50值分别为3.6pM和2.8pM。
实施例22：双特异性和三特异性的表征-使用人PBMC的T细胞活化
为了测量T细胞活化，使用由健康供体制备的人PBMC。这些人PBMC在补充有10％FBS和0.5μg/ml小鼠抗hCD3克隆OKT3(Biolegend，目录号：317325)的RPMI1640培养基中以1x 106个细胞/mL的密度培养。添加所公开的抗体以刺激T细胞。将板在37℃下用5％ CO2温育3天。在温育72小时后，使用上清液以通过AlphaLISA(PerkinElmer，目录号：AL217C/F)使用根据制造商的说明的方案来测量分泌的IFNγ。
如图22A所示，当用CD3共处理时，双特异性Ab 1923Ab8诱导与用单克隆抗CD137Ab 1923Ab4+Fc-交联剂或单独的PC2乌瑞芦单抗-NR处理的PBMC等效的强T细胞活化。实施例18中的先前数据证实了1923Ab8的活性是PDL-1依赖性的。由于已经报道了在PBMC和活化的T细胞中抗原呈递细胞上PDL1的表达，因此这些数据表明双特异性Ab可能能够结合至免疫细胞上的PDL1，并且活化肿瘤微环境和引流***中存在肿瘤抗原经历的T细胞的T细胞。
图22B证实了三特异性1923Ab7和双特异性1923Ab8两者均诱导强的T细胞活化。然而，含有抗PDL1和TGFbRII的双特异性Ab 1923Ab20未显示T细胞活化。阻断PD1途径和激活CD137均可以激活T细胞。结果说明，检测到的T细胞活化是由于CD137信号传导的活化而不是PD-1/PD-L1相互作用的抑制。
实施例23：双特异性和三特异性的表征-T细胞介导的细胞毒性和CD8T细胞活化
为了检查T细胞介导的对表达PD-L1的肿瘤细胞的细胞毒性作用，使用了表达GFP的NUGC-4胃肿瘤细胞。简而言之，用IFNγ预处理NUGC4GFP细胞48小时以诱导PD-L1表达。在预处理后，洗涤细胞并与用小鼠抗hCD3克隆OKT3(Biolegend、目录号：317325)和公开的双特异性抗体或三特异性抗体刺激的CD8 T细胞共培养72小时。使用Cytation(Biotek，VT)来测量绿色荧光信号。通过下式来计算杀伤百分比：
杀伤％＝(无抗体的GFP信号-用抗体处理的GFP信号)/无抗体的GFP信号*100％。
图23A证实了1923Ab17和1923Ab18诱导强T细胞介导的细胞毒性。在与用1923Ab17或1923Ab18刺激的CD8 T细胞温育72小时后，约50％的肿瘤细胞被杀死。来自相同实验的培养基用于测量IFNγ的量作为T细胞活化的指示。图23B证实了，与同种型对照处理相比，1923Ab17和1923Ab18处理两者都诱导强的T细胞活化。这些结果表明，1923Ab17和1923Ab18不仅激活CD8 T细胞，而且还诱导CD8 T细胞介导的杀伤。
实施例24：双特异性和三特异性的表征-在CMV再调用测定中使用PBMC的抗原特异性T细胞活化
为了检查所公开的双特异性抗体和三特异性抗体的抗原特异性T细胞活化，使用由健康供体制备的人PBMC。CMV裂解物购自Microbix Biosystems(目录号：EL-01-02-001.0)。使用用CMV裂解物和抗体刺激的人PBMC进行CMV再调用测定持续5天。将板在37℃下用5％ CO2温育。在温育5天后，收集上清液，并且使用根据制造商的说明的方案通过AlphaLISA(PerkinElmer，目录号：AL217C/F)来测量IFNγ。IFNγ的量与T细胞活化成正比。
图24证实了所有公开的抗体都激活抗原特异性T细胞活化。其中，1923Ab7和1923Ab17在体外诱导最强的T细胞活化。该结果表明，三特异性抗体激活比双特异性抗体或“PC2乌瑞芦单抗-NR+1923Ab3”或“PC2乌瑞芦单抗-NR+1923Ab20”的组合处理更强的抗原特异性T细胞活化。
实施例25：1923Ab17和1923Ab18与人P-L1和人CD137的结合动力学
为了评估包括1923Ab3、1923Ab4、1923Ab17和1923Ab18在内的所公开的抗体结合人PD-L1和CD137的能力，用Biacore3000测试了结合动力学实验。简言之，CM5传感器芯片(GE Healthcare，目录号BR-1000-12)按照流动池2上的应用向导经由胺偶联化学与抗人IgG抗体(GE Healthcare，目录号BR-1008-39)一起固定。流动池1保持未修改以充当用于减去***仪器噪声和漂移的参考池。用双空白(Fc1和空白分析物缓冲液)运行Fc2-1检测，将抗体样品在HBS-EP(GE Healthcare，目录号BR-1003-69)中稀释至1ug/ml，并且以10ul/ml的流速注射用于1分钟捕获。将抗原人PD-L1(Acro Biosystems，目录号PD1-H5229)和CD137(Sino Biological，目录号10041-H08H)以1:4稀释从PD-L1的10nM稀释至CD137的80nM，以50ul/min注射在HBS-EP中的5点至0nM持续2分钟，随后进行6分钟解离。
在BIAEvalution软件中通过与质量转移模型1:1结合来分析数据。报告了平衡解离常数(KD)。结果汇总于表10和表11中。
表10：与人PD-L1的结合
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1923Ab3 8.14E+05 2.40E-03 2.95E-09
1923Ab17 1.20E+06 2.67E-03 2.22E-09
1923Ab18 6.59E+05 2.30E-03 3.49E-09
表11：与人CD137的结合
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1923Ab4 3.05E+06 2.19E-02 7.18E-09
1923Ab17 2.50E+06 4.83E-02 1.93E-08
1923Ab18 1.70E+06 3.80E-02 2.23E-08
实施例26：MC38-hPD-L1小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤效应和肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)分析
使6-8周龄的体重在16-20g之间的雌性B-hPD-L1/h4-1BB小鼠(Biocytogen)在研究入选前适应7天。在整个研究期期间，小鼠可以自由获得高压灭菌的干颗粒食物和水，并且以12小时的光/暗循环在20-26℃下在40-70％的相对湿度下饲养。MC38鼠结肠癌细胞系被基因修饰以过表达人PD-L1而不是小鼠PD-L1。在补充有10％热灭活FBS的DMEM中在37℃下在5％的气氛中将细胞在体外维持为单层培养物。收获细胞，并且将在100μlPBS中的5 x105个细胞皮下植入到右前侧中用于肿瘤发育。在第7天，携带肿瘤的小鼠将被随机招募到平均肿瘤大小为约100-150mm3的2个研究组中。每组由5只小鼠组成。将使用卡尺在二维中每周测量肿瘤大小两次，并且使用下式以mm3表示体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长维度和短维度。治疗在第7、11、14和18天开始，其中腹膜内注射5mg/kg1923Ab18或PBS作为阴性对照。研究在第21天终止。进行终末出血以制备用于AST测量的血清。收获肿瘤并且储存在组织储存缓冲液中用于TIL分析。
图25显示了两个治疗组的肿瘤生长曲线。1923Ab18与媒介物对照相比显著地抑制肿瘤生长。它达到78％的肿瘤生长抑制。
为了确定1923Ab18抗体对肿瘤微环境中的免疫细胞的影响，在上述研究中收获肿瘤样品。通过测量CD3+/CD45+肿瘤浸润性淋巴细胞的量来确定免疫细胞的总体浸润。如图26A所示、1923Ab18显著地增加了CD3+免疫细胞向肿瘤微环境中的浸润。将CD3+细胞进一步分成CD4+或CD8+TIL。图26B和C证实了1923Ab18显著地诱导CD8+细胞的浸润，但不诱导CD4+细胞的浸润。通过测量CD25+FOXP3+CD3+肿瘤浸润淋巴细胞的量来确定肿瘤微环境中Treg细胞的水平。如图26D所示、1923Ab18显著地降低了肿瘤微环境中Treg的水平。因此，CD8/Treg比率在用1923Ab18处理的小鼠的肿瘤微环境中显著增加(图26E)。
除非另有说明，否则说明书和权利要求书中使用的表达成分的量、性质如分子量、反应条件等的所有数字应当被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非相反指示，否则说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数是近似值，其可以根据由本公开试图获得的期望性质而变化。至少，并且不试图将等同原则的应用限制到权利要求的范围，每个数字参数至少应当基于所报告的有效数字的数量并通过应用普通舍入技术来解释。
尽管阐述本公开的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是尽可能精确地报告特定实施例中阐述的数值。然而，任何数值固有地包含一定误差，所述误差必然由在其相应测试测量中发现的标准偏差引起。
在描述本公开的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种”、“一个/一种”、“该/所述”和类似的指代物应当被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。本文对数值范围的列举仅仅是旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都被并入到说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅是为了更好地说明本公开，而不是对以其他方式要求保护的本公开的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对实施本公开至关重要的任何未要求保护的要素。
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应当理解，本文公开的本公开的实施方案说明了本公开的原理。可以采用的其他修改在本公开的范围内。因此，作为实例但不限于，可以根据本文的教导利用本公开的替代配置。因此，本公开不限于正如所示和所述的内容。
虽然已经在本文中通过参考各种具体材料、程序和实施例描述和说明了本公开，但是应当理解，本公开不限于为此目的选择的材料和程序的特定组合。如本领域技术人员所理解的，可以隐含此类细节的许多变化。旨在将说明书和实施例仅视为示例性的，其中本公开的真实范围和精神由所附权利要求指示。本申请中提及的所有参考文献、专利和专利申请通过引用以其整体并入本文。

Claims (105)

1.一种结合PD-L1和TGFβ或PD-L1和CD137的结合蛋白，其包含：
(a)抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合PD-L1的第二抗原结合位点；
(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ或CD137的第三抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中
所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10；或
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ IDNO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:15。
3.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列；和如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4中所示的轻链可变区序列。
4.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
(i)如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列；或
(ii)如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
5.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
(i)如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列，
如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列，
如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列，和
如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列；或
(ii)如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列，
如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列，
如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列，和
如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
6.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
如SEQ ID NO:45中所示的重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的轻链序列。
7.根据权利要求1至6所述的结合蛋白，其具有一个第一结合模块。
8.根据权利要求1至6所述的结合蛋白，其具有两个第一结合模块。
9.根据前述权利要求所述的结合蛋白，其中所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端、所述抗体支架模块重链序列的所述N末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述N末端，或其组合，并且其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块直接或通过链间接头彼此共价连接。
10.根据权利要求9所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块通过具有如SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59中所示的序列的链间接头彼此共价连接。
11.根据权利要求9所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
12.根据权利要求9所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
13.根据权利要求1至6和8至12中任一项所述的结合蛋白，其中当存在多于一个第一结合模块时，每个第一结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或所述抗体支架模块序列的不同端。
14.根据前述权利要求所述的结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点结合TGFβ。
15.根据权利要求14所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块包含TGFβRII的胞外结构域。
16.根据权利要求15所述的结合蛋白，其中所述TGFβRII的胞外结构域包含如SEQ IDNO:67中所示的序列。
17.根据权利要求14至16所述的结合蛋白，其具有两个第一结合模块。
18.根据权利要求17所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:51中所示的序列；并且其中所述抗体支架模块的所述轻链序列包含如SEQ ID NO:40中所示的序列。
19.根据权利要求1至13中任一项所述的结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点结合CD137。
20.根据权利要求19所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块是scFv，所述scFv包含重链可变区序列和轻链可变序列，其中所述序列直接或通过scFv融合接头彼此共价连接。
21.根据权利要求19所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56中所示的序列。
22.根据权利要求19所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块从N末端至C末端包含：
(1)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:22和CDR3：SEQ ID NO:23；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:24、CDR2：SEQ ID NO:25和CDR3：SEQ ID NO:26；
(2)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:27、CDR2：SEQ ID NO:28和CDR3：SEQ ID NO:29；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:30、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:31；或
(3)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:32、CDR2：SEQ ID NO:33和CDR3：SEQ ID NO:34；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:35、CDR2：SEQ ID NO:36和CDR3：SEQ ID NO:37。
23.根据权利要求19所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块从N末端至C末端包含：
(1)如SEQ ID NO:16中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列；
(2)如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列；或
(3)如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列。
24.根据权利要求19至23所述的结合蛋白，其具有两个第一结合模块。
25.根据权利要求24所述的结合蛋白，其中：
(1)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:38中所示的序列；并且其中所述抗体支架模块的所述轻链序列包含如SEQ ID NO:40中所示的序列；
(2)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:44中所示的序列；并且其中所述抗体支架模块的所述轻链序列包含如SEQ ID NO:40中所示的序列；
(3)所述抗体支架模块的所述重链序列包含如SEQ ID NO:45中所示的序列；并且其中所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:46中所示的序列；
(4)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:47中所示的序列；并且其中所述抗体支架模块的所述轻链序列包含如SEQ ID NO:40中所示的序列；
(5)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:50中所示的序列；并且其中所述抗体支架模块的所述轻链序列包含如SEQ ID NO:40中所示的序列。
26.一种结合PD-L1、TGFβ和CD137的结合蛋白，其包含：
(a)抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合PD-L1的第一抗原结合位点和结合PD-L1的第二抗原结合位点；
(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ的第三抗原结合位点；以及
(c)至少一个第二结合模块，所述至少一个第二结合模块包含结合CD137的第四抗原结合位点。
27.根据权利要求26所述的结合蛋白，其中
所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10；或
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ IDNO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:15。
28.根据权利要求26所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列；和如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4中所示的轻链可变区序列。
29.根据权利要求26所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
(i)如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列；
(ii)如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
30.根据权利要求26所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
(i)如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列，
如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列，
如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列，和
如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列；或
(ii)如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列，
如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列，
如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列，和
如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
31.根据权利要求26所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
如SEQ ID NO:45中所示的重链序列和如SEQ ID NO:40中所示的轻链序列。
32.根据权利要求26至31所述的结合蛋白，其具有一个第一结合模块。
33.根据权利要求26至31所述的结合蛋白，其具有两个第一结合模块。
34.根据权利要求32至33所述的结合蛋白，其中所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端、所述抗体支架模块重链序列的所述N末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述N末端，或其组合，并且其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块直接地或通过第一结合模块链间接头彼此共价连接。
35.根据权利要求34所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块通过第一结合模块链间接头彼此共价连接，并且所述第一结合模块链间接头包含如SEQ IDNO:58或SEQ ID NO:59中所示的序列。
36.根据权利要求34所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
37.根据权利要求34所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
38.根据权利要求26-31和33-37中任一项所述的结合蛋白，其中当存在多于一个第一结合模块时，每个第一结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或所述抗体支架模块序列的不同端。
39.根据权利要求26至38所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块包含TGFβRII的胞外结构域。
40.根据权利要求39所述的结合蛋白，其中所述TGFβRII的胞外结构域包含如SEQ IDNO:67中所示的序列。
41.根据权利要求26至40所述的结合蛋白，其具有一个第二结合模块。
42.根据权利要求26至40所述的结合蛋白，其具有两个第二结合模块。
43.根据权利要求41至42所述的结合蛋白，其中所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端、所述抗体支架模块重链序列的所述N末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述N末端，或其组合，并且其中所述第二结合模块和所述抗体支架模块直接地或通过第二结合模块链间接头彼此共价连接。
44.根据权利要求43所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块和所述抗体支架模块通过第二结合模块链间接头彼此共价连接，并且所述第二结合模块链间接头包含如SEQ IDNO:58或SEQ ID NO:59中所示的序列。
45.根据权利要求43所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
46.根据权利要求45所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
47.根据权利要求43所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
48.根据权利要求47所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
49.根据权利要求25至40和42至44中任一项所述的结合蛋白，其中当存在多于一个第二结合模块时，每个第二结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或所述抗体支架模块序列的不同端。
50.根据权利要求41所述的结合蛋白，其具有一个第二结合模块，并且其中所述一个第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
51.根据权利要求41所述的结合蛋白，其具有一个第二结合模块，并且其中所述一个第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
52.根据权利要求42所述的结合蛋白，其具有两个第二结合模块，并且其中一个第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端，并且另一个第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
53.根据权利要求25至52中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块是scFv。
54.根据权利要求26至53中任一项所述的结合蛋白，
其中所述第二结合模块从N末端至C末端包含：
(1)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:22和CDR3：SEQ ID NO:23；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:24、CDR2：SEQ ID NO:25和CDR3：SEQ ID NO:26；
(2)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:27、CDR2：SEQ ID NO:28和CDR3：SEQ ID NO:29；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:30、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:31；或
(3)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:32、CDR2：SEQ ID NO:33和CDR3：SEQ ID NO:34；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:35、CDR2：SEQ ID NO:36和CDR3：SEQ ID NO:37。
55.根据权利要求54所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块从N末端至C末端包含：
(1)如SEQ ID NO:16中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列；
(2)如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列；或
(3)如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列。
56.根据权利要求54所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块包含如SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56中所示的序列。
57.根据权利要求26至31所述的结合蛋白，其具有两个第一结合模块和两个第二结合模块。
58.根据权利要求57所述的结合蛋白，其中
(1)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第二结合模块包含如SEQ ID NO:38中所示的序列；并且所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:39中所示的序列；
(2)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第二结合模块包含如SEQ ID NO:50中所示的序列；并且所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:39中所示的序列；或
(3)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:51中所示的序列；并且所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第二结合模块包含如SEQ ID NO:52中所示的序列。
59.根据权利要求26至31所述的结合蛋白，其具有两个第一结合模块和一个第二结合模块。
60.根据权利要求59所述的结合蛋白，其中：
(1)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第二结合模块包含如SEQ ID NO:41中所示的序列；
所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:39中所示的序列，
所述抗体支架模块的所述重链序列包含如SEQ ID NO:42中所示的序列；
所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:39中所示的序列；或
(2)所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第二结合模块包含如SEQ ID NO:43中所示的序列；
所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:39中所示的序列，
所述抗体支架模块的所述重链序列包含如SEQ ID NO:42中所示的序列；
所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第一结合模块包含如SEQ ID NO:39中所示的序列。
61.一种结合CD137、TGFβ和PD-L1的结合蛋白，其包含：
(a)抗体支架模块，所述抗体支架模块包含结合CD137的第一抗原结合位点和结合CD137的第二抗原结合位点；
(b)至少一个第一结合模块，所述至少一个第一结合模块包含结合TGFβ的第三抗原结合位点；以及
(c)至少一个第二结合模块，所述至少一个第二结合模块包含结合PD-L1的第四抗原结合位点。
62.根据权利要求61所述的结合蛋白，其中
所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点包含：
(i)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:22和CDR3：SEQ ID NO:23；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:24、CDR2：SEQ ID NO:25和CDR3：SEQ ID NO:26；
(ii)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:27、CDR2：SEQ IDNO:28和CDR3：SEQ ID NO:29；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:30、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:31；或
(iii)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:32、CDR2：SEQ IDNO:33和CDR3：SEQ ID NO:34；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:35、CDR2：SEQ ID NO:36和CDR3：SEQ ID NO:37。
63.根据权利要求61所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列；或
如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列。
64.根据权利要求61所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
(i)如SEQ ID NO:16中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列；
(ii)如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列；或
(ii)如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列。
65.根据权利要求61所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
(i)如SEQ ID NO:16中所示的重链可变区序列，
如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列，
如SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区序列，
如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列；
(ii)如SEQ ID NO:18中所示的重链可变区序列，
如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列，
如SEQ ID NO:19中所示的轻链可变区序列，
如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列；或
(iii)如SEQ ID NO:20中所示的重链可变区序列，
如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64中所示的重链恒定区序列，
如SEQ ID NO:21中所示的轻链可变区序列，
如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中所示的轻链恒定区序列。
66.根据权利要求61所述的结合蛋白，其中
所述抗体支架模块包含：
如SEQ ID NO:75中所示的重链序列和如SEQ ID NO:76中所示的轻链序列。
67.根据权利要求61至66所述的结合蛋白，其具有一个第一结合模块。
68.根据权利要求61至66所述的结合蛋白，其具有两个第一结合模块。
69.根据权利要求67至68所述的结合蛋白，其中所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端、所述抗体支架模块重链序列的所述N末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述N末端，或其组合，并且其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块直接或通过第一结合模块链间接头彼此共价连接。
70.根据权利要求69所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块和所述抗体支架模块通过第一结合模块链间接头彼此共价连接，并且所述第一结合模块链间接头包含如SEQ IDNO:58或SEQ ID NO:59中所示的序列。
71.根据权利要求69所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
72.根据权利要求69所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
73.根据权利要求61至66和68至72中任一项所述的结合蛋白，其中当存在多于一个第一结合模块时，每个第一结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或所述抗体支架模块的不同端。
74.根据权利要求61至73中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块包含TGFβRII的胞外结构域。
75.根据权利要求74所述的结合蛋白，其中所述TGFβRII的胞外结构域包含如SEQ IDNO:67中所示的序列。
76.根据权利要求61至75所述的结合蛋白，其具有一个第二结合模块。
77.根据权利要求61至75所述的结合蛋白，其具有两个第二结合模块。
78.根据权利要求76至77所述的结合蛋白，其中所述抗体支架模块包含重链序列，所述重链序列包含C末端和N末端，并且其中所述抗体支架模块包含轻链序列，所述轻链序列包含C末端和N末端，并且所述第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端、所述抗体支架模块重链序列的所述N末端、所述抗体支架模块轻链序列的所述N末端，或其组合，并且其中所述第二结合模块和所述抗体支架模块直接地或通过第二结合模块链间接头彼此共价连接。
79.根据权利要求78所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块和所述抗体支架模块通过第二结合模块链间接头彼此共价连接，并且所述第二结合模块链间接头包含如SEQ IDNO:58或SEQ ID NO:59中所示的序列。
80.根据权利要求78所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
81.根据权利要求80所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
82.根据权利要求78所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
83.根据权利要求82所述的结合蛋白，其中所述第一结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
84.根据权利要求61至75和77至83中任一项所述的结合蛋白，其中当存在多于一个第二结合模块时，每个第二结合模块共价地连接至不同的抗体支架模块序列或所述抗体支架模块序列的不同端。
85.根据权利要求76所述的结合蛋白，其具有一个第二结合模块，并且其中所述一个第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端。
86.根据权利要求76所述的结合蛋白，其具有一个第二结合模块，并且其中所述一个第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
87.根据权利要求77所述的结合蛋白，其具有两个第二结合模块，并且其中一个第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块重链序列的所述C末端，并且另一个第二结合模块共价地连接至所述抗体支架模块轻链序列的所述C末端。
88.根据前述权利要求所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块是scFv。
89.根据权利要求61至88中任一项所述的结合蛋白，
其中所述第二结合模块从N末端至C末端包含：
(a)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:5、CDR2：SEQ ID NO:6和CDR3：SEQ ID NO:7；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:8、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:10；或
(b)重链可变区序列，所述重链可变区序列包含CDR1：SEQ ID NO:11、CDR2：SEQ ID NO:12和CDR3：SEQ ID NO:13；以及轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含CDR1：SEQ IDNO:14、CDR2：SEQ ID NO:9和CDR3：SEQ ID NO:15。
90.根据权利要求89所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块从N末端至C末端包含：
(1)如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:2中所示的轻链可变区序列；或
(2)如SEQ ID NO:3中所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:4中所示的轻链可变区序列。
91.根据权利要求61至88中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二结合模块包含如SEQID NO:57中所示的序列。
92.根据权利要求61至66中任一项所述的结合蛋白，其具有两个第一结合模块和两个第二结合模块。
93.根据权利要求92所述的结合蛋白，其中：
所述抗体支架模块的所述重链序列和所述第二结合模块包含如SEQ ID NO:48中所示的序列；并且其中所述抗体支架模块的所述轻链序列和所述第一结合模块包含如SEQ IDNO:49中所示的序列。
94.根据前述权利要求所述的结合蛋白，其中所述抗体支架模块进一步包含恒定区。
95.根据权利要求94所述的结合蛋白，其中所述恒定区包含Fc沉默突变。
96.根据权利要求95所述的结合蛋白，其中所述Fc沉默突变是LALA或N297A。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的结合蛋白，其中所述恒定区包含杵臼(KiH)突变。
98.根据权利要求94所述的结合蛋白，其中所述恒定区包含SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64。
99.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求所述的结合蛋白和药学上可接受的载剂。
100.一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据前述权利要求所述的结合蛋白。
101.一种分离的多核苷酸，其包含编码根据前述权利要求所述的结合蛋白的序列。
102.根据权利要求101所述的分离的多核苷酸，其编码如根据前述权利要求中任一项所述的序列。
103.一种载体，其包含根据权利要求101所述的多核苷酸。
104.一种细胞，其包含根据权利要求102所述的多核苷酸和/或根据权利要求103所述的载体。
105.一种用于产生根据前述权利要求所述的结合蛋白的方法，所述方法包括培养根据权利要求104所述的细胞。
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