CN103937748B

CN103937748B - 可稳定表达人tmprss2蛋白的单细胞自悬浮生长mdck细胞株及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN103937748B
Application number: CN201410130367.5A
Authority: CN
Inventors: 冯磊; 吴培培; 褚轩; 王伟峰; 华涛; 陈丽; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CN103937748A

Abstract

本发明涉及一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长的MDCK细胞株，构建方法以及其在培养禽流感病毒中的应用。本发明属于生物技术领域。本发明公开了一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株，命名为MDCK‑Sus‑TMPRSS2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其细胞株的保藏号为：CGMCC No.8851。同时本发明提供了这一细胞株的构建方法，以及其在禽流感病毒增殖培养中的应用方式。从而实现了禽流感病毒增殖培养中无需添加TPCK处理的胰蛋白酶，从而有效解决了外源蛋白酶对宿主细胞生长的不可逆影响，显著提高了禽流感病毒的增殖效率。

Description

可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种单细胞自悬浮生长MDCK细胞株及其应用，特别涉及一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长的MDCK细胞株，构建方法以及其在培养禽流感病毒中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

目前采用连续传代细胞系替代SPF鸡胚在生物反应器中进行禽流感病毒的大规模增殖制备是科研单位或兽用疫苗生产企业竞相开展的研究热点。

禽流感病毒粒子表面的HA蛋白与宿主细胞上病毒受体结合的先决条件是HA蛋白在其碱性氨基酸（Lys或Arg）位点进行有效裂解，形成HA1蛋白和HA2蛋白，这二者之间由二硫键连接。HA1蛋白负责识别宿主细胞膜上的糖链受体，HA2蛋白的N端有一段融合肽负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，在H⁺攻击下由病毒的M2蛋白形成离子通道帮助病毒遗传物质向胞内释放，继而进入细胞核完成逆转录、复制、翻译表达等后续过程。禽流感病毒能够在SPF鸡胚中增殖的一个重要原因就是鸡胚尿囊液中含有大量的蛋白酶，能够对病毒粒子表面的HA蛋白进行裂解。而流感病毒在体外培养的动物细胞，如MDCK细胞、Vero细胞中增殖一般都需要在病毒增殖过程中添加经TPCK处理的胰蛋白酶。这种蛋白酶弱化了胰凝乳蛋白酶的活性，而增强了对碱性氨基酸（如Arg、lys）位点的裂解能力，从而能够保证禽流感病毒HA蛋白的正确裂解。

但是外源蛋白酶的添加对宿主细胞的生长状态造成的影响是不可逆的，特别是种毒连续传代后的蛋白酶积累对宿主细胞生理状态影响极为严重，进而影响禽流感病毒的增殖效率。

发明目的

本发明公开了一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株及其构建方法，以及这一细胞株在禽流感病毒增殖培养中的应用。

本发明具体公开了以下技术方案：

本发明公开了一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株，命名为MDCK-Sus-TMPRSS2，分类命名为重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其细胞株的保藏号为：CGMCC No.8851。保藏日期为2014年3月6日。

这里TMPRSS2是指Ⅱ型跨膜型丝氨酸蛋白酶（typeⅡ transmembrane proteaseserines, TMPRSS2）是新近发现的一类特殊蛋白酶，该蛋白从N端往C端依次是胞内结构域（cyto.D）、跨膜结构域(TM)、主干区（低密度脂蛋白A类受体区LDLRA、富含半胱氨酸的清道夫受体区SRCR、原结构域Pro）、消化结构域(catalytic domain)。其中跨膜区结合于细胞膜上，主干区和消化结构域则表达定位于细胞膜的外侧，具有蛋白消化酶解的功能。其蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

同时，本发明还进一步公开所述MDCK-Sus-TMPRSS2为适应于全悬浮生长的细胞株。这一技术特征主要是区别于传统的贴壁生长的MDCK细胞。

同时，在本申请中，我们还进一步公开了单细胞自悬浮生长MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）单细胞悬浮生长MDCK细胞的悬浮转染过程

接种初始细胞密度为5×10⁵cells/ml的MDCK-Sus细胞系于50mlTPP培养管中，悬浮培养过夜后用于质粒转染，转染前将悬浮培养用培养基更换为Opti-MEM培养基孵育10分钟；

以10ml细胞悬液为一个转染单位，将100ulPEI试剂加入至1ml的Opti-MEM中混匀，将10～200ug pIRES-TMPRSS2质粒载体加入至1ml的Opti-MEM中混匀，分别在室温下孵育5分钟；

孵育完成后将上述两个混合液采用逐滴加入的方式混匀，在室温下孵育15分钟，形成PEI-DNA转染复合物；

采用逐滴加入的方式将PEI-DNA转染复合物加入至10倍体积的MDCK-Sus细胞悬液中，边滴入边振荡混匀，于室温中孵育15分钟，每间隔3分钟混匀一次；

孵育结束后，将孵育后的混合物放置于摇床上培养，转速55～120rpm；

8小时后，以1000rpm离心10分钟，将含有剩余转染复合物的培养上清去除；

添加MDCK-Sus细胞株的正常悬浮培养培养基继续振荡悬浮培养；

2）受转染的阳性悬浮细胞克隆的筛选

转染后18～24小时的MDCK-Sus细胞株经离心回收按照1:2～1:12的比例重新分散至15ml新鲜悬浮培养液中培养，37℃，5%CO₂，转速为100～200rpm，通过G418进行筛选，获得能够在G418筛选抗性中稳定持续悬浮生长的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆。

具体来说，这一筛选过程为，转染后18～24小时的MDCK-Sus细胞系经离心回收按照1:2～1:12的比例重新分散至15ml新鲜悬浮培养液中培养，37℃，5% CO2，转速为100～200rpm，悬浮培养液中G418的工作浓度为400ug/ml，细胞初始密度大致为3～5×105cells/ml。按照5天换一次液的频率进行G418持续筛选，第一轮筛选时间大致为4～6周。选择能够在有G418筛选压力下持续增殖的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆继续悬浮培养传代。该传代操作以离心去除培养上清并重悬细胞沉淀来实现。第二轮筛选中将G418筛选工作浓度提高至600ug/ml继续加压筛选。最终获得能够在G418筛选抗性中稳定持续悬浮生长的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆，并建系保藏。

同时，本发明进一步公开了一种细胞培养物，所述细胞培养物含有重组的MDCK-Sus-TMPRSS2细胞。

进一步，我们还公开了所述单细胞自悬浮生长MDCK细胞株或含有重组的MDCK-Sus-TMPRSS2细胞的细胞培养物在禽流感病毒增殖培养中的用途。

同时，我们进一步公开了本发明中公开的细胞培养物不含有血清。

更进一步地，我们还公开了所述禽流感病毒增殖培养过程中，细胞培养物中不含有TPCK处理的胰蛋白酶。

基于前述公开技术方案，本发明还进一步公开了单细胞自悬浮生长MDCK细胞株进行禽流感病毒生物反应器大规模增殖的方法，包括以下步骤：

1）将重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞在生物反应器中进行分批与补料联合式全悬浮培养，得到MDCK-Sus-TMPRSS2细胞培养液，

2）当MDCK-Sus-TMPRSS2细胞培养液中的细胞密度达到4×10⁶cells/ml时，按照MOI 为0.0001～1的比例接入禽流感病毒以及病毒增殖维持液；

3）病毒增殖过程中设定pH6.8～7.2，DO（溶氧） 15～35%，温度28～37℃，培养3天后即可收获子代流感病毒。

进一步地，我们公开了所述病毒增殖维持液组分如下所示：

本发明的第一方面，首次建立了能够稳定表达人TMPRSS2蛋白并可以单细胞自悬浮生长的MDCK重组细胞株。所述重组细胞株为MDCK-Sus-TMPRSS2，保藏号为：CGMCCNo.8851。采用稳定转染含有人TMPRSS2蛋白表达盒元件的真核表达载体进入MDCK-Sus细胞株中，并经过反复抗性筛选后获得稳定表达该蛋白的重组细胞克隆。

本发明的第二方面，提供了构建MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株的方法。在实施方案中，将人的TMPRSS2蛋白的开放式阅读框（ORF）序列连接入真核表达载体，将该真核表达载体转染至MDCK-Sus细胞中。该转染过程是悬浮细胞的转染过程，有别于传统的贴壁细胞转染程序。表达载体导入MDCK-Sus细胞中后，利用该表达载体上的新霉素抗性（neo^r）经G418抗性筛选及加压筛选，获得能够稳定表达人TMPRSS2蛋白的重组MDCK细胞克隆。经RT-PCR检测其mRNA水平，western blot检测其蛋白表达水平都显示该重组细胞克隆稳定获得了人TMPRSS2蛋白的编码基因并顺利表达，采用间接免疫荧光方法检测该重组细胞克隆能够稳定表达人TMPRSS2蛋白，且该蛋白的表达定位于细胞膜。

本发明的第三个方面，利用本专利发明的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞株在生物反应器中进行了多株H9亚型禽流感病毒的增殖，这其中包括了该重组细胞株悬浮培养所采用的培养液，培养程序，H9亚型禽流感病毒增殖采用的病毒增殖维持液，接毒剂量，收毒程序等内容。

附图说明

细胞株的保藏号为：CGMCC No.8851。保藏日期为2014年3月6日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

图1 为MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株与母本MDCK-Sus细胞的RT-PCR鉴定结果图；

其中：M：DL2000 marker

1：MDCK-Sus细胞对照

2：MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株。

图2为 MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株与母本MDCK-Sus细胞western blot鉴定结果图；

其中M：蛋白marker

1：MDCK-Sus细胞对照

2：MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株。

图3A MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株间接免疫荧光检测结果

可检测出重组细胞株有特异性荧光；

图3B 母本MDCK-Sus细胞间接免疫荧光检测结果

无特异性荧光检出

图4 为MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株与母本MDCK-Sus细胞悬浮生长曲线图；

其中：

■ 代表MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株，◆代表MDCK-Sus细胞株。

图5 为MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株在3L反应器中悬浮培养生长曲线图。

具体实施方式

实施例1 pIRES -TMPRSS2表达载体的构建

1.1试剂

含有人TMPRSS2蛋白ORF的质粒载体购自北京义翘神州生物技术有限公司（货号：HG13070-G）。Trizol、MMLV逆转录***、pMD19-T载体、oligo dT、各种限制性内切酶、ExTaq酶、T4DNA连接酶等分子生物学材料均购自TAKARA公司，pIRES质粒由国家兽用生物制品工程技术研究中心保存。胶回收试剂盒、质粒小提及大提试剂盒均购自Qiagen公司。

1.2引物合成：用于扩增人TMPRSS2蛋白ORF序列的引物由上海生工合成。

p1：GCCGCTAGCTAATACGACTCACTATAGGG（划线处为NheⅠ酶切位点）

p2：GCCTCTAGATAGAAGGCACAGTCGAGG（划线处为XbaⅠ酶切位点）

1.3 pIRES -TMPRSS2表达载体的构建及大提

采用上述引物，以北京义翘神州生物技术有限公司质粒载体（货号：HG13070-G）为模板，经PCR反应扩增出人TMPRSS2的完整ORF片段，PCR反应条件如下表所示。将该目的片段连接至pMD19-T载体上，测序结果在genebank上进行序列比对，扩增片段与人TMPRSS2蛋白的编码序列一致;

PCR反应组分：	体积（ul）
		质粒模版	1
P1	1
		P2	1
10×Buffer	5
		dNTP	2
Ex-Taq	1
			39
反应程序：
		95℃	5分钟
30个循环 95℃	30秒
		56℃	30秒
72℃	90秒
		72℃	10分钟

。采用NheⅠ/XbaⅠ双酶切处理PCR扩增的目的片段以及pIRES质粒，将目的片段及pIRES质粒的骨架片段进行胶回收，定量后进行核酸连接操作，转化至DH5α中，挑选阳性菌落并大量扩增，质粒抽提后酶切验证重组真核表达载体pIRES-TMPRSS2。经Qiagen公司质粒大提试剂盒抽提获得质量较高的转染用质粒。

1.4结果

本试验利用两个酶切位点将目的片段连入了真核表达载体中，获得了pIRES-TMPRSS2真核表达载体用于后续转染试验。使用NheⅠ/XbaⅠ双酶切pIRES-TMPRSS2载体鉴定结果显示目的片段连接正确。经质粒大提获得质量较高的质粒，OD260/OD280的值为1.81，用于后续质粒转染试验。

实施例2 重组MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞克隆的构建筛选

2.1材料：

试剂：DMEM、G418、Opti-MEM、PEI（25kD线性）试剂购自Invitrogen公司。兔抗人TMPRSS2蛋白的一抗购自Santa Cruz生物技术公司，FITC标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗兔IgG购自杭州联科生物技术公司。Trizol、MMLV逆转录***、oligo dT、ExTaq酶等分子生物学试剂均购自TAKARA公司。

生物材料：MDCK-Sus细胞株由国家兽用生物制品工程技术研究中心自行驯化扩增建系，该细胞株的单细胞自悬浮生长用的培养基由国家兽用生物制品工程技术研究中心自行开发配制，以DMEM/F12（1:1）培养基为基础培养基，添加若干营养成分，经0.22um过滤，置于4℃避光保存。营养成分如下表所示：

以上各成分购自sigma公司，按产品说明要求配制。经0.22um过滤，置于4℃避光保存。

2.2 G418作用浓度的筛选

MDCK-Sus细胞接种于50mlTPP培养管中，其中培养体积为10ml，初始细胞密度为5×10⁵cells/ml。在不同的培养管中加入不同浓度的G148，浓度为100、200、300、400、500、600、700、800ug/ml，置于37℃，5%CO₂，转速为100～250rpm的培养摇床上进行悬浮培养，每日取样观察并测定细胞存活率，培养6-12天，记录细胞死亡情况，确定G418的最小有效工作浓度。

2.3 阳离子聚合物介导的悬浮细胞转染

接种初始细胞密度为5×10⁵cells/ml的MDCK-Sus细胞株于50mlTPP培养管中，悬浮培养过夜后用于质粒转染，转染前将悬浮培养用培养基更换为Opti-MEM培养基孵育10分钟。以10ml细胞悬液为一个转染单位，将100ulPEI试剂加入至1ml的Opti-MEM中混匀，将10～200ug pIRES-TMPRSS2质粒载体加入至1ml的Opti-MEM中混匀，分别在室温下孵育5分钟。孵育完成后将上述两个混合液采用逐滴加入的方式混匀，在室温下孵育15分钟，形成PEI-DNA转染复合物。采用逐滴加入的方式将上述1ml转染复合物加入至10ml的MDCK-Sus细胞悬液中，边滴入边振荡混匀，于室温中孵育15分钟，每间隔3分钟混匀一次。孵育结束后将转染完毕的细胞放置于正常悬浮培养的摇床上，其余培养条件同正常培养，仅改变培养转速为55～120rpm。转染后8小时，以1000rpm离心10分钟，将含有剩余转染复合物的培养上清去除，更换成MDCK-Sus细胞株的正常悬浮培养培养基继续振荡悬浮培养。

2.4 MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆的筛选：

转染后18～24小时的MDCK-Sus细胞株经离心回收按照1:2～1:12的比例重新分散至15ml新鲜悬浮培养液中培养，37℃，5%CO₂，转速为100～200rpm，悬浮培养液中G418的工作浓度为400ug/ml，细胞初始密度大致为3～5×10⁵cells/ml。按照5天换一次液的频率进行G418持续筛选，第一轮筛选时间大致为4～6周。选择能够在有G418筛选压力下持续增殖的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆继续悬浮培养传代。该传代操作以离心去除培养上清并重悬细胞沉淀来实现。第二轮筛选中将G418筛选工作浓度提高至600ug/ml继续加压筛选。最终获得能够在G418筛选抗性中稳定持续悬浮生长的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆。

2.5 RT-PCR、western blot、间接免疫荧光鉴定：

将筛选出来的MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞克隆经离心收集、PBS清洗3遍后按Trizol法从细胞中抽提总RNA，具体如下：按每1～2×10⁷个细胞加入0.5mlTrizol液的比例处理重组细胞克隆，室温静置5分钟后加入0.1ml氯仿，反复剧烈振荡15秒，4℃12000g离心10分钟。小心吸取上层水相于新离心管中，加入0.25ml异丙醇，室温放置10分钟，4℃12000g离心10分钟。离心后弃去上清，加入1ml75%乙醇，温和重悬沉淀，4℃12000g离心10分钟，保留沉淀，以DEPC水溶解抽提出的RNA。上述实验所用的器皿、枪头、水等等均采用DEPC处理并高压，全程戴手套进行操作。逆转录过程如下：抽提的RNA 20ul、oligo dT 3ul、dNTP mix4ul混匀后于65℃作用10分钟，迅速置于冰上并加入下列试剂：MMLV 1ul、5×buffer 8ul、RNA酶抑制剂 1ul、DTT 3ul。37℃作用2～3小时后用于后续PCR操作。以逆转录后的cDNA为模板，进行PCR扩增，具体参数同实施例一中操作。

将筛选出来的MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞克隆经离心收集、PBS清洗3遍后用于western blot检测。以5%的浓缩胶和8%的分离胶进行SDS-PAGE蛋白电泳，采用半干式转膜操作将胶上蛋白转移至PVDF膜上，经BSA封闭后，采用人TMPRSS2蛋白的兔源一抗及HRP标记的羊抗兔二抗孵育转有目的蛋白的PVDF膜，采用显色剂显色鉴定目的蛋白表达情况。

将筛选出来的MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞克隆经离心收集、PBS清洗并采用75%冷丙酮固定于96孔板中，加入人TMPRSS2蛋白的兔源一抗100ul（1:200稀释），于37℃孵育30分钟后去除一抗。使用PBS清洗3遍后，加入FITC标记的羊抗兔二抗100ul（1:500稀释），于37℃孵育30分钟后去除二抗，用PBS清洗3遍后在荧光显微镜下观察重组人TMPRSS2蛋白在MDCK细胞上的表达情况。

上述鉴定试验均以MDCK-Sus细胞为空白对照，按照相同操作步骤进行鉴定。

2.6 结果

2.6.1 G418工作浓度的筛选确定

以在5天内杀死全部MDCK-Sus细胞的浓度为G418筛选工作浓度。根据细胞存活率的测定结果，确定400ug/ml为正常筛选时的工作浓度，在加压筛选中选择600ug/ml。

2.6.2 重组细胞的克隆、筛选及鉴定

转染后的细胞在400ug/ml的G418筛选环境中经过6周的筛选，获得了能够正常持续生长的重组细胞株。将存活的细胞株分散至含有600ug/ml和800ug/ml的G418筛选TPP培养管中继续加压筛选，最终获得能够持续生长的MDCK-Sus-TMPRSS2重组克隆。

参考图1，经RT-PCR检测发现重组MDCK细胞株可扩增出1492bp的条带，图1中序号2所标示，与目的条带大小一致，而母本MDCK-Sus细胞，图1中1所标示的扩增结果为阴性。

参考图2，western blot检测发现重组MDCK细胞株表达了70kDa的目的蛋白，图2中序号2所标示，而母本MDCK-Sus细胞无目的蛋白表达，图2中1所标示。

间接免疫荧光检测出人TMPRSS2蛋白表达于重组细胞的细胞膜表面，可见特异性绿色荧光，如图3A所示，其中白色亮点处为绿色荧光。而母本MDCK-Sus细胞经检测未见特异性绿色荧光，如图3B所示。

实施例3 重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞株的悬浮培养性能测定

3.1 材料与方法

母本MDCK-Sus细胞由国家兽用生物制品工程技术研究中心驯化建系保存。

重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞株如前所述筛选获得，并建系。

悬浮生长用培养基如前所述。

MDCK-Sus细胞和重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞以3×10⁵cells/ml的初始密度接种于250ml的培养摇瓶中，放置于37℃，5%CO₂，转速为180rpm的培养摇床中进行悬浮培养。每24小时取样测定细胞密度和存活率，绘制生长曲线，计算细胞比生长速率。

在3L生物反应器（荷兰Applikon公司产品）中，MDCK-Sus细胞和重组MDCK-Sus- TMPRSS2细胞以3～5×105cells/ml的初始密度接种于1.5L初始培养体积中，设置培养转速 60～180rpm，培养温度37℃，DO为50%，pH为7.1进行初始批式培养，每24小时取样测定细胞密度，计算细胞比生长速率。培养3～5天后视细胞生长程度进行补料培养，补料液组分如下表所示：

原料组分	组分在培养基中的含量
		DMEM / F12（1:1）	28g/L
酵母自水解物	0.01～1g/L
		大豆蛋白水解物	0.01～0.5g/L
还原型谷胱甘肽	0.01～0.5mg/L
		乙醇胺	0.01～0.5ml/L
Pluronic F-68	0.2～1g/L

以上试剂均购自Sigma公司，按照产品说明进行配制，经0.22um过滤，置于4℃避光保存。

3.2 结果

重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞的生长曲线如图4所示。与母本MDCK- Sus细胞比较，重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞的生长速率基本无变化，在250ml摇瓶中培养细胞获得最大的细胞密度为2.7×10⁶cells/ml，平均比生长速率为0.438d^-1，基本与母本细胞没有差异（母本细胞最大细胞密度2.65×10⁶cells/ml，平均比生长速率0.453d^-1），说明经过外源基因转染及筛选操作后获得的重组细胞生长性能没有发生变化。

为了验证该重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞是否具备工业化增殖禽流感病毒的能力，在3L生物反应器中对该重组细胞进行了分批和补料式联合培养，最大细胞密度可达到6.83×10⁶cells/ml（如图5所示），说明该重组细胞株可以进行大规模悬浮培养，有利于禽流感病毒在生物反应器中的大量增殖。

实施例4 重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞株增殖禽流感病毒的能力比较

4.1 试验材料

MDCK-Sus细胞由国家兽用生物制品工程技术研究中心驯化建系保存。

重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞株如前所述筛选获得，并建系。

悬浮生长用培养基、悬浮培养方法如前所述。

禽流感H9N2病毒：A/chicken/Jiangsu/02/09（简称JS02）、A/chicken/Jiangsu/03/11（简称JS03）、A/chicken/JiaXing/02/11（简称JX02）、A/chicken/XiGang/04/01（简称XG04）、A/chicken/HangZhou/03/01（简称HZ03）、A/chicken/HeNan/03/01（简称HN03）由国家兽用生物制品工程技术研究中心分离、鉴定、保藏。

4.2 试验方法

在50mlTPP细胞培养管中，以重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞、母本MDCK-Sus细胞为基质连续传代上述若干禽流感病毒，每种病毒连续传15代，分别在第1、第5、第10、第15代测定增殖病毒的HA效价，判断两种增殖宿主细胞对禽流感病毒的连续传代能力。毒增殖所用的维持液组分如下表所示：

重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞增殖禽流感病毒时在上述病毒增殖维持液中不加入TPCK处理的胰蛋白酶，而MDCK-Sus细胞增殖上述禽流感病毒时在病毒增殖维持液中加入终浓度为0.1～10ug/ml的TPCK处理的胰蛋白酶。其余的病毒增殖条件均保持一致。

MDCK-Sus细胞及重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞分别在1L生物反应器（荷兰Applikon公司产品）中进行禽流感病毒的增殖。以实施例3中细胞悬浮培养的方法将细胞培养到4×10⁶cells/ml时即可进行接种病毒操作。首先采用孔径为12um的不锈钢旋转过滤器进行去除细胞培养上清，PBS缓冲液清洗等操作。清洗完细胞后按照MOI 0.0001～1的比例接入禽流感病毒XG04株（A/chicken/XiGang/04/01），病毒增殖维持液如前所述，病毒增殖过程中设定pH6.8～7.2，DO 15～35%，温度28～37℃。每24小时取样反复3次冻融后以10000rmp×5min离心检测上清中的HA效价，单位为log2/25ul。MDCK-Sus细胞及重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞增殖XG04株的条件仅仅是MDCK-Sus细胞增殖维持液中加入0.1～10ug/ml的TPCK处理的胰蛋白酶，其余增殖条件保持一致。

4.3 试验结果

结果如下表所示，在不使用TPCK处理的胰蛋白酶的条件下，本发明所述的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞可以正常增殖禽流感病毒，且利用该重组细胞进行禽流感病毒传代时可以保持较高的病毒增殖效率，在连续盲传10代后子代病毒的血凝效价仍保持较高的水平。其母本MDCK-Sus细胞在TPCK胰蛋白酶的作用下连续增殖禽流感病毒5代与重组细胞株的增殖结果差异不大，但连续增殖10代后，其子代病毒的血凝效价逐步降低，无法获得理想的增殖效果。

在生物反应器中对禽流感XG04株进行了全悬浮培养增殖比较，结果如下表所示。重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞可以获得最高2¹⁰/25ul的血凝效价，明显高于采用母本MDCK-Sus细胞增殖该病毒的效果。禽流感病毒增殖3～4天即可收毒，增殖时间短，反应器罐上操作方便简单，具有较好的实际应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株及其构建方法

与应用

<130> 20140402

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

atggctttga actcagggtc accaccagct attggacctt actatgaaaa ccatggatac 60

caaccggaaa acccctatcc cgcacagccc actgtggtcc ccactgtcta cgaggtgcat 120

ccggctcagt actacccgtc ccccgtgccc cagtacgccc cgagggtcct gacgcaggct 180

tccaaccccg tcgtctgcac gcagcccaaa tccccatccg ggacagtgtg cacctcaaag 240

actaagaaag cactgtgcat caccttgacc ctggggacct tcctcgtggg agctgcgctg 300

gccgctggcc tactctggaa gttcatgggc agcaagtgct ccaactctgg gatagagtgc 360

gactcctcag gtacctgcat caacccctct aactggtgtg atggcgtgtc acactgcccc 420

ggcggggagg acgagaatcg gtgtgttcgc ctctacggac caaacttcat ccttcaggtg 480

tactcatctc agaggaagtc ctggcaccct gtgtgccaag acgactggaa cgagaactac 540

gggcgggcgg cctgcaggga catgggctat aagaataatt tttactctag ccaaggaata 600

gtggatgaca gcggatccac cagctttatg aaactgaaca caagtgccgg caatgtcgat 660

atctataaaa aactgtacca cagtgatgcc tgttcttcaa aagcagtggt ttctttacgc 720

tgtatagcct gcggggtcaa cttgaactca agccgccaga gcaggattgt gggcggcgag 780

agcgcgctcc cgggggcctg gccctggcag gtcagcctgc acgtccagaa cgtccacgtg 840

tgcggaggct ccatcatcac ccccgagtgg atcgtgacag ccgcccactg cgtggaaaaa 900

cctcttaaca atccatggca ttggacggca tttgcgggga ttttgagaca atctttcatg 960

ttctatggag ccggatacca agtagaaaaa gtgatttctc atccaaatta tgactccaag 1020

accaagaaca atgacattgc gctgatgaag ctgcagaagc ctctgacttt caacgaccta 1080

gtgaaaccag tgtgtctgcc caacccaggc atgatgctgc agccagaaca gctctgctgg 1140

atttccgggt ggggggccac cgaggagaaa gggaagacct cagaagtgct gaacgctgcc 1200

aaggtgcttc tcattgagac acagagatgc aacagcagat atgtctatga caacctgatc 1260

acaccagcca tgatctgtgc cggcttcctg caggggaacg tcgattcttg ccagggtgac 1320

agtggagggc ctctggtcac ttcgaagaac aatatctggt ggctgatagg ggatacaagc 1380

tggggttctg gctgtgccaa agcttacaga ccaggagtgt acgggaatgt gatggtattc 1440

acggactgga tttatcgaca aatgagggca gacggctaa 1479

Claims

1.一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株，命名为MDCK-Sus-TMPRSS2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其细胞株的保藏号为：CGMCCNo.8851。

2.如权利要求1所述的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株，其特征在于：所述MDCK-Sus-TMPRSS2为适应于全悬浮生长的细胞株。

3.一种细胞培养物，其特征是，所述细胞培养物含有权利要求1~2中任意一项所述的MDCK-Sus-TMPRSS2细胞。

4.权利要求1或2中所述的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株或权利要求3中所述的细胞培养物在禽流感病毒增殖培养中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征是，所述细胞培养物中不含有血清。

6.如权利要求4或5所述的用途，其特征是，禽流感病毒增殖培养过程中，细胞培养物中不含有TPCK处理的胰蛋白酶。

7.一种利用权利要求1或2中所述的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株进行禽流感病毒生物反应器大规模增殖的方法，其特征是包括以下步骤：1）将权利要求1或2中所述的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株在生物反应器中进行分批与补料联合式全悬浮培养，得到MDCK-Sus-TMPRSS2细胞培养液，2）当MDCK-Sus-TMPRSS2细胞培养液中的细胞密度达到4×10⁶cells/ml时，按照MOI为0.0001～1的比例接入禽流感病毒以及病毒增殖维持液；3）病毒增殖过程中设定pH6.8～7.2，DO（溶氧）15～35%，温度28～37℃，培养3天后即可收获子代流感病毒，所述病毒增殖维持液组分如下所示，

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