CN114315826B - 一种吡啶并嘧啶类化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种吡啶并嘧啶类化合物及其应用，属于生物医药技术领域。本发明公开的吡啶并嘧啶类化合物，是一类新的能够作为PI3Kδ抑制剂的化合物，通过对PI3Kδ激酶活性及PI3Kδ激酶的选择性活性测定，证实本发明公开的化合物对PI3Kδ激酶活性具有明显的抑制作用，对PI3Kδ的活性具有明显的选择性作用。通过对白血病细胞系的体外细胞增殖测定，显示本发明公开的化合物对白血病细胞具有不同的抑制作用。本发明公开的化合物或其药学上可接受的盐、氘代物、水合物、溶剂合物、化学保护形式的前药或其组合，这些化合物可以作为PI3Kδ抑制剂，在治疗和/或预防炎性病或肿瘤中发挥作用。

Description

一种吡啶并嘧啶类化合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种吡啶并嘧啶类化合物及其应用。

背景技术

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一种脂激酶家族成员，是PI3K/AKT/mTOR信号通路的重要组成部分。PI3K按结构与功能的不同可分为3类。其中研究最广泛的为I类PI3K，该类PI3K为异源二聚体，由一个调节亚基和一个催化亚基组成。调节亚基含有SH2和SH3结构域，与含有相应结合位点的靶蛋白相作用，该亚基通常称为p85。催化亚基有4种，即p110α，p110β，p110δ，p110γ(其中p110α，p110β，p110δ属于RTK家族，p110γ属于GPCR家族)。PI3K根据其催化亚基的不同可分为PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kδ和PI3Kγ。其中PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kγ广泛分布于各种细胞中，而PI3Kδ主要存在于白细胞。随着对PI3K的组织分布及功能的不断认识，针对p110δ亚型开发高选择性的PI3Kδ抑制剂得到关注。PI3Kδ抑制剂将在众多血液瘤(如CLL,ALL,MCL,FL,NHL,MM,BCL,以及DLBCL)中发挥重要治疗作用；PI3Kδ抑制剂也有望在自身免疫性疾病如类风湿关节炎RA，多发性硬化症MS，红斑狼疮SLE的治疗中发挥作用；此外，一些其他疾病如过敏性疾病，气道疾病如哮喘等，也有可能通过PI3Kδ抑制剂来改善。因此开发PI3Kδ抑制剂前景看好。

idelalisib(GS-1101)是第一个被广泛报道的PI3Kδ抑制剂，2013年9月idelalisib被FDA授予突破性疗法认定，2014年idelalisib被FDA批准用于CLL,滤泡淋巴瘤(FL)和小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)的血液瘤的治疗。除此之外，duvelisib(IPI-145,INK-1197)，GS-9820(CAL-120)，GSK-2269557，XL-499，TGR-1202(RP5264)，AMG-319,等处于临床研究阶段。另外，一些专利(如WO2010055846,WO2013057711,WO2013088404)也报道了许多体外活性较好的PI3Kδ抑制剂。目前PI3Kδ抑制剂的价值并未被完全开发，适应症较为狭窄，而且被批准的PI3Kδ抑制剂idelalisib毒性较大，伴有黑框标记。因此仍然需要开发新的PI3Kδ抑制剂，以扩展它的临床适应症，并降低毒性。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种吡啶并嘧啶类化合物及其应用，以抑制PI3Kδ激酶的活性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种吡啶并嘧啶类化合物，该化合物结构式如下：

R²为氢、氰基、硝基、三氟甲基或烷氧羰基；

R³为C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、羟基取代的C₁-C₆烷基、C₅-C₆饱和单杂环环烷基、芳基或杂芳基。

优选地，该化合物结构式如下：

其中，Z为NH；

W为CH₂、羰基或磺酰基；

R¹为甲氧基；

R²为氰基或三氟甲基；

R³为C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、羟基取代的C₁-C₆烷基、C₅-C₆饱和单杂环环烷基、芳基或杂芳基。

进一步优选地，R³为C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、羟基取代的C₁-C₆烷基、C₅-C₆饱和单杂环环烷基、硝基苯基、呋喃基或吡唑基。

优选地，R³为甲基、乙基、三氟甲基、环己基、环戊基、环丁基、环丙基、羟基甲基、四氢吡喃基、哌啶基、硝基苯基、呋喃基、1-甲基哌啶基、氮杂环丙基或氮杂环丁基。

优选地，所述化合物为以下结构中任意一种：

本发明还公开了上述吡啶并嘧啶类化合物在药学上能够接受的盐。

本发明还公开了上述吡啶并嘧啶类化合物或上述吡啶并嘧啶类化合物在药学上能够接受的盐在制备治疗和/或预防PI3Kδ过度表达所引起的疾病中的应用。

优选地，所述疾病包括类风湿性关节炎、血液肿瘤、淋巴瘤、PI3Kδ过度活化综合症、舍格伦综合征或哮喘。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了吡啶并嘧啶类化合物及其应用，该类化合物是一类新的能够作为PI3Kδ抑制剂的化合物，通过对PI3Kδ激酶活性及PI3Kδ激酶的选择性活性测定，证实本发明公开的化合物对PI3Kδ激酶活性具有明显的抑制作用，对PI3Kδ的活性具有明显的选择性作用。通过对白血病细胞系的体外细胞增殖测定，显示本发明公开的化合物对白血病细胞具有不同的抑制作用。本发明公开的化合物或其药学上可接受的盐、氘代物、水合物、溶剂合物、化学保护形式的前药或其组合，这些化合物可以作为PI3Kδ抑制剂，用于治疗和/或预防包括类风湿性关节炎、血液肿瘤、淋巴瘤、PI3Kδ过度活化综合症、舍格伦综合征或哮喘等疾病。

附图说明

图1为本发明的化合物1、8、9和阳性药idelalisib对SU-DHL-6细胞中AKT和p-AKT⁴⁷³的抑制图；

图2为本发明的化合物24、25、26、DMSO和阳性药idelalisib对SU-DHL-6细胞中AKT和p-AKT⁴⁷³的抑制图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定，除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求中的术语具有下述含义：

“烷基”指饱和的脂族烃基团。包括1至12个碳原子的直链或支链基团。优选含有1至10个碳原子的中等大小烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。

“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟。

“环烷基”指3至8元全碳单环、全碳5元/6元或6元/6元稠和环或多环稠和环(“稠和”环意味着***中的每个环与***中的其它环共享毗邻的一对碳原子)基团，其中一个或多个环具有完全连接的π电子***，环烷基的实例(不局限于)为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、金刚烷、环己二烯、环庚烷和环庚三烯。

“芳基”表示6至10个碳原子的全碳单环或稠合多环基团，具有完全共轭的π电子***。“芳基”包括：苯；萘等，芳基可以是取代的或未取代的。

“杂芳基”表示5至10个环原子的单环或稠合环基团，含有一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子***。杂芳基包括但不限于，吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、异噁唑、噻唑、吡唑、三氮唑、吡啶、吡啶酮、嘧啶、吡嗪、哒嗪、吲哚、吲唑、氮杂吲哚、苯并咪唑、吲哚啉、吲哚酮、喹啉、异喹啉、喹唑啉、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噁唑、噻吩并吡啶、噻吩并嘧啶等。此类基团的优选实施例为吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、异噁唑、噻唑、吡唑、三氮唑、吡啶、吡啶酮、嘧啶、吲唑、吲哚酮、喹啉。

“杂环烷基”表示单环或稠和环基团，在环中具有5到9个环原子，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)p(其中p是0至2的整数)的杂原子，其余环原子是C。这些环可以具有一条或多条双键，但这些环不具有完全共轭的π电子***。杂环烷基包括并不限于四氢吡喃基、吗啉基、吗啉基哌啶基、噻吗啉基、二氧化噻吗啉基、二甲基吗啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、甲基吡咯烷基、四氢吡咯甲基吡咯烷基、二甲基吡咯烷基、二甲氧基吡咯烷基、哌啶基、哌啶酮基、羟基哌啶基、四甲基哌啶基、对哌啶基哌啶基、四甲基哌啶酮基、苯并哌啶基、噻吩并哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基、乙基哌嗪基、哌嗪酮基、苯基哌嗪基、苄基哌嗪基、环丙基甲酰基哌嗪基、叔丁氧羰基哌嗪基等。

“烷氧基”表示-O-(未取代的烷基)和-O(未取代的环烷基)。代表性的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。

“羟基”表示-OH基团，“氰基”表示-CN基团，“硝基”表示-NO₂基团，“羰基”表示-CO-基团，“磺酰基”表示-SO₂-基团。

在一些实施方案中，“被一个或多个基团取代”是指在指定的原子或基团中的一个、两个、三个或四个氢原子分别被指定范围的基团中选出的相同或不同的基团替换。

“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸包括乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙烯酸、己酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属例子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等。

“药物组合物”指将本发明中的化合物中的一个或多个或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药与别的化学成分，例如药学上可接受的载体，混合。药物组合物的目的是促进给药给动物的过程。

“药用载体”指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的药物组合物中的非活性成分，例如但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、甘露醇等)、淀粉、环糊精、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、丙烯酸聚合物或甲基丙烯酸聚合物、凝胶、水、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、蓖麻油或氢化蓖麻油或多乙氧基氢化蓖麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。

前述的药物组合物中，除了包括药学上可接受的载体外，还可以包括在药(剂)学上常用的辅剂，例如：抗细菌剂、抗真菌剂、抗微生物剂、保质剂、调色剂、增溶剂、增稠剂、表面活性剂、络合剂、蛋白质、氨基酸、脂肪、糖类、维生素、矿物质、微量元素、甜味剂、色素、香精或它们的结合等。

1、合成化合物1-29的具体实施例

代表性化合物的结构式、编号如下：

实施例1

(S)-4-(1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基)氨基-6-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(中间体1-c)

称取4,6-二氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(1.00g,5.17mmol)加入50mL的圆底烧瓶中，再加入(S)-1-Boc-3-氨基-吡咯烷(1.40g,7.51mmol)和DIPEA(1.94g,15.34mmol)，异丙醇(20mL)作溶剂。搅拌加热回流反应2.5h后，TLC检测显示反应完全，将体系减压蒸干，加入乙酸乙酯，依次用水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相，无水Na₂SO₄干燥，柱色谱分离(CH₂Cl₂：CH₃OH＝20：1)得淡黄色固体1.50g，收率为85.2％。mp:146.6～147.9℃.MS(ESI)m/z:[M+H]⁺＝350.1.¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.03(s,1H,Ar-H),8.71(d,J＝14.2Hz,1H,Ar-H),8.09(d,J＝55.2Hz,1H,NH),7.24-7.30(m,1H,Ar-H),4.94(d,J＝28.2Hz,1H,CH),3.55-3.62(m,4H,CH₂×2),2.18-2.24(m,2H,CH₂),1.51(d,J＝31.8Hz,9H,O(CH₃)₃).

(S)-4-(1-Boc-吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(中间体1-d)

称取2-甲氧基-3-氰基-5-溴吡啶(729mg,3.42mmol)加入到50mL的圆底烧瓶中，再依次加入联硼酸频那醇酯(1.09g,4.30mmol)、KOAc(559mg,5.70mmol)、Pd(dppf)Cl₂(175mg,0.22mmol)，二氧六环(20mL)作为溶剂，N₂保护，搅拌加热回流约3h后，TLC检测显示原料反应完全。待冷却至室温，蒸干溶剂。加入(S)-4-(1-叔丁氧羰基吡咯烷-3-基)氨基-6-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶(1.00g,2.91mmol)、无水Na₂CO₃(604mg,5.72mmol)、Pd(dppf)Cl₂(175mg,0.24mmol)，DME(8mL)和H₂O(2mL)作溶剂，氩气保护，搅拌加热回流约2.5h后，TLC检测显示原料反应完全，停止反应。柱色谱分离(CH₂Cl₂：CH₃OH＝20：1)得棕色固体1.15g，收率为90.2％。mp：187.9～189.3℃.MS(ESI)m/z:[M+H]⁺＝448.2.¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.04(d,J＝1.8Hz,1H,Ar-H),8.65(d,J＝24.2Hz,2H,Ar-H),8.16(dd,J＝103.2,8.7Hz,2H,NH),7.23(d,J＝51.9Hz,1H,Ar-H),4.90(s,1H,CH),3.72(ddd,J＝152.4,52.1,27.3Hz,4H,CH₂×2),2.38(ddd,J＝161.5,83.9,77.3Hz,2H CH₂),1.49(s,9H,O(CH₃)₃).

(S)-4-(1-(四氢吡喃-4-羰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物1)

称取中间体1-d(150mg,0.33mmol)加入到50mL圆底烧瓶中，加入三氟乙酸(1mL)，二氯甲烷(4mL)作溶剂，室温搅拌2h后，TLC检测显示脱Boc反应完全。将体系尽量蒸干，加入四氢吡喃-4-甲酸(67mg,0.51mmol)、HATU(259mg,0.72mmol)、DIPEA(235mg,1.71mmol)，二氯甲烷(5mL)作溶剂，室温搅拌4h后，TLC检测显示原料反应完全，依次加入水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相，无水Na₂SO₄干燥，柱色谱分离(CH₂Cl₂：CH₃OH＝20：1)得到白色固体116mg，收率为74.2％。mp：239.7～241.7℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.53(t,J＝2.2Hz,1H,Ar-H),9.28(s,1H,Ar-H),8.54-8.47(m,3H,Ar-H),8.18(dd,J＝8.8,5.1Hz,1H,NH),4.90(ddd,J＝45.5,14.8,7.4Hz,1H,CH),4.09(s,3H,OCH₃),3.87-3.66(m,4H,CH₂×2),3.51-3.37(m,4H,CH₂×2),2.73-2.68(m,1H,CH),2.25-2.15(m,2H,CH₂),1.64-1.56(m,4H,CH₂×2).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ172.8,164.4,159.6,156.1,151.6,143.9,142.8,137.2,131.4,127.4,125.0,115.8,96.2,66.8,55.4,49.3,44.9,44.5,39.8,39.1,38.6,31.5,29.5,28.8.ESI-HRMS C₂₄H₂₅N₇O₃，计算值[M+H]+：460.20916，测定值：460.20899.

实施例2

(S)-4-((1-环戊基甲酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物2)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物2，白色固体(97mg，64.4％)。mp：218.6～220.9℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),9.32(dd,J＝4.8,2.5Hz,1H,Ar-H),8.57–8.47(m,3H,Ar-H),8.20(dd,J＝8.8,3.2Hz,1H,NH),4.91(dd,J＝41.9,7.3Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),4.00(dd,J＝10.1,7.5Hz,1H,CH₂),3.85-3.79(m,2H,CH₂),3.68-3.40(m,1H,CH₂),2.75-2.72(m,1H,CH),2.27-2.15(m,2H,CH₂),1.62-1.21(m,8H,CH₂×4).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.2,174.2,164.5,156.2,150.9,142.9,137.3,131.44 127.5,125.1,115.8,96.2,56.5,55.4,50.8,49.4,39.6,31.5,29.9,29.8,29.6,26.2,26.2,19.0.ESI-HRMS C₂₄H₂₅N₇O₃，计算值[M+H]+：444.21425，测定值：444.21485.

实施例3

(S)-4-((1-环己基甲酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物3)

制备化合物1相类似的方法可制得化合物3(97mg，62.3％)。mp：232.1～233.1℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.54(s,1H,Ar-H),9.29(s,1H,Ar-H),8.51-8.48(m,3H,Ar-H),8.18(dd,J＝8.2,4.2Hz,1H,NH),4.90(dd,J＝46.4,7.0Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),3.80-3.44(m,4H,CH₂×2),2.43(s,1H,CH),2.26-2.16(m,2H,CH₂),1.70-1.19(m,10H,CH₂×5).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.0,164.4,159.6,156.1,151.6,142.8,137.1,131.4,127.4,125.1,115.7,96.2,55.4,49.3,44.9,44.3,42.0,41.6,39.9,31.5,29.6,29.1,26.0,25.7,25.7.ESI-HRMS C₂₅H₂₇N₇O₂，计算值[M+H]⁺：458.22990，测定值：458.23348.

实施例4

(S)-4-((1-三氟乙酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物4)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物4，白色固体(79mg，52.7％)。mp：214.5～217.7℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.59(dd,J＝4.7,2.4Hz,1H,Ar-H),9.28(s,1H,Ar-H),8.58-8.52(m,3H,Ar-H),8.22(dd,J＝8.8,1.9Hz,1H,NH),5.05-4.93(m,1H,CH),4.11(s,3H,OCH₃),3.85-3.62(m,4H,CH₂×2),2.46–2.17(m,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ162.2,159.2,155.6,150.9,149.2,140.3,133.4,131.5,125.8,121.1,115.5,112.0,55.3,54.8,46.11,45.4,42.1,39.8,39.6,17.7.ESI-HRMS C₂₀H₁₆F₃N₇O₂，计算值[M+H]⁺：444.13903，测定值：444.13909.

实施例5

(S)-4-((1-对硝基苯甲酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物5)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物5，白色固体(74mg，43.8％)。mp：161.5～163.2℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.50(dd,J＝13.8,2.3Hz,1H,Ar-H),9.24(dd,J＝12.0,2.3Hz,1H,Ar-H),8.52-8.30(m,3H,Ar-H),8.29(dd,J＝14.7,8.7Hz,2H,Ar-H),8.14(dd,J＝11.8,8.9Hz,1H,Ar-H),7.83(t,J＝9.3Hz,2H,NH),4.92(ddd,J＝48.6,14.3,7.1Hz,1H,CH),4.09(s,3H,OCH₃),3.90-3.56(m,4H,CH₂×2),2.39-2.17(m,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ167.0,166.9,164.,159.5,155.9,148.4,143.9,143.3,142.7,137.1,129.0,127.3,125.0,124.1,115.7,96.2,55.3,50.9,50.6,49.5,47.8,45.1,39.4,31.8,29.4.ESI-HRMS C₂₅H₂₀N₈O₄，计算值[M+H]⁺：497.16803，测定值：497.16921.

实施例6

(S)-4-((1-甲磺酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物6)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物6，白色固体(56mg，38.7％)。mp：196.0～198.4℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),9.32(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),8.55-8.52(m,3H,Ar-H),8.22(d,J＝8.8Hz,1H,NH),4.92(dd,J＝14.5,7.2Hz,1H,CH),4.11(s,3H,OCH₃),3.55-3.40(m,4H,CH₂×2),2.99(s,3H,CH₃),2.35-2.24(m,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ171.1,161.9,155.6,149.2,140.2,133.5,127.5,123.6,121.1,116.1,115.5,112.9,55.3,54.9,54.8,46.6,46.1,45.4,17.7.ESI-HRMSC₁₉H₁₉N₇O₃S，计算值[M+H]⁺：426.13428，测定值：426.13391.

实施例7

(S)-4-((1-环丙基磺酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物7)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物7，白色固体(52mg，33.9％)。mp：191.1～194.0℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),9.32(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),8.71-8.55(m,3H,Ar-H),8.23(d,J＝8.8Hz,1H,NH),4.94(dd,J＝14.2,7.0Hz,1H,CH),4.11(s,3H,OCH₃),3.60-3.45(m,5H,CH₂×2,CH),2.33-2.28(m,2H,CH₂),1.03-0.95(m,4H,CH₂×2).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ171.1,159.1,154.4,150.6,140.3,134.7,128.8,123.9,120.0,118.8,116.9,112.7,109.5,55.2,54.8,54.3,46.6,46.1,45.4,42.1,17.7.ESI-HRMS C₂₁H₂₁N₇O₃S，计算值[M+H]⁺：452.14993，测定值：452.14957.

实施例8

(S)-4-((1-环丁基甲酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物8)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物8，白色固体(56mg，38.3％)。mp：210.2～211.8℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58(s,1H,Ar-H),9.31(dd,J＝4.4,2.5Hz,1H,Ar-H),8.51-8.49(m,3H,Ar-H),8.20(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H,NH),4.89(ddd,J＝21.5,14.7,7.4Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),3.82-3.61(m,4H,CH₂×2),3.48-3.23(m,1H,CH),2.29-2.11(m,6H,CH₂×3),2.08-1.76(m,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ170.0,164.0,160.1,158.1,154.4,148.0,137.9,130.3,127.6,119.9,114.4,113.9,60.5,53.4,45.5,39.3,39.0,38.9,38.8,38.6,38.5,16.7,13.5.ESI-HRMS C₂₃H₂₃N₇O₂，计算值[M+H]⁺：430.19860，测定值：430.19833.

实施例9

(S)-4-(1-(2-呋喃甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物9)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物9，白色固体(47mg，31.3％)。mp：174.1～176.0℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),9.31(s,1H,Ar-H),8.58-8.51(m,3H,Ar-H),8.21(d,J＝8.8Hz,1H,NH),7.88(d,J＝7.7Hz,1H,Ar-H),7.12(s,1H,Ar-H),6.65(d,J＝8.2Hz,1H,Ar-H),5.02-4.90(m,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),3.76-3.58(m,4H,CH₂×2),2.33-2.22(m,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ171.1,165.1,161.2,159.1,155.5,149.1,139.3,139.0,131.42,128.7,120.9,115.5,114.9,114.5,61.6,52.9,46.6,46.0,41.9,39.8,39.6,17.7,14.6.ESI-HRMS C₂₃H₁₉N₇O₃，计算值[M+H]⁺：442.16221，测定值：446.16203.

实施例10

(S)-4-(1-(N-甲基-4-哌啶甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物10)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物10，白色固体(67mg，41.7％)。mp：246.0～248.2℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.60(s,1H,Ar-H),9.34(t,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),8.55-8.51(m,3H,Ar-H),8.23(dd,J＝8.8,4.5Hz,1H,NH),4.92(dd,J＝43.6,6.9Hz,1H,CH),4.11(s,3H,OCH₃),3.82-3.48(m,8H,CH₂×4),3.47-3.45(m,3H,NCH₃),2.69(s,1H,CH),2.25-2.23(m,2H,CH₂),1.80(dd,J＝33.4,13.5Hz,4H,CH₂×2).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.0,164.4,159.6,156.1,151.6,142.8,137.1,131.3,127.3,125.1,115.7,96.2,55.3,49.3,44.9,44.3,42.0,41.6,39.9,31.5,29.6,29.1,26.0,25.7,25.7.ESI-HRMSC₂₅H₂₈N₈O₂，计算值[M+H]⁺：473.24080，测定值：473.24024.

实施例11

(S)-4-(1-(2-羟基乙酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物11)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物11，白色固体(38mg，27.6％)。mp：227.4～229.3℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.59(d,J＝1.4Hz,1H,Ar-H),9.32(s,1H,Ar-H),8.55-8.52(m,3H,Ar-H),8.22(dd,J＝8.8,2.9Hz,1H,NH),5.45(s,1H,OH),4.99-4.96(m,1H,CH),4.81(dd,J＝21.9,12.4Hz,2H,CH₂),4.11(s,3H,OCH₃),3.59(m,4H,CH₂×2),2.27(m,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.6,170.5,169.5,164.5,155.9,151.7,142.9,136.8,131.4,127.4,125.3,115.8,96.3,61.8,59.9,55.4,49.2,39.7,31.3,29.3.ESI-HRMS C₂₀H₁₉N₇O₃，计算值[M+H]⁺：406.16221，测定值：406.16169.

实施例12

(S)-4-((1-丙酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物12)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物12，白色固体(89mg，64.9％)。mp：220.9～221.3℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.57(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),9.31(t,J＝2.6Hz,1H,Ar-H),8.52(dt,J＝7.1,4.7Hz,3H,Ar-H),8.20(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H,NH),4.89(ddd,J＝48.3,14.5,7.4Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),3.81-3.46(m,J＝26.3,19.5,14.3,8.8,4.8Hz,4H,CH₂×2),2.33-2.16(m,4H,CH₂×2),1.04-0.98(m,3H,CH₃).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ171.1,164.9,155.3,148.9,141.1,139.5,131.6,128.7,126.2,122.9,120.9,115.5,54.8,54.2,46.5,45.3,41.9,39.8,39.6,18.1,17.7.ESI-HRMS C₂₁H₂₁N₇O₂，计算值[M+H]⁺：404.18295，测定值：404.18287.

实施例13

(S)-4-((1-丙酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-三氟甲基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物13)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物13，白色固体(93mg，61.3％)。mp：186.2～188.2℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.63(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),8.95(d,J＝2.0Hz,1H,Ar-H),8.56-8.52(m,3H,Ar-H),8.20(dd,J＝8.8,2.2Hz,1H,NH),4.87(dd,J＝43.5,7.1Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),3.84-3.46(m,4H,CH₂×2),2.30-2.17(m,4H,CH₂×2),1.02-0.95(m,3H,CH₃).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ171.1,164.6,159.1,154.7,148.9,139.9,131.6,128.0,122.6,120.9,115.5,55.2,54.8,54.2,46.5,46.1,45.4,42.1,39.8,39.,17.7.ESI-HRMS C₂₁H₂₁F₃N₆O₂，计算值[M+H]⁺：447.17509，测定值：447.17487.

实施例14

(S)-4-((1-叔丁氧羰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-氯吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体14-b)

称取4,6-二氯吡啶并[3,4-d]嘧啶(1.00g,5.00mmol)加入50mL的圆底烧瓶中，再加入(S)-1-Boc-3-氨基-吡咯烷(1.40g,7.51mmol)和DIPEA(1.94g,15.00mmol)，异丙醇作溶剂(20mL)作溶剂。搅拌加热回流反应2.5h后，TLC检测显示反应完全，将体系减压蒸干，加入乙酸乙酯，依次用水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相用无水Na₂SO₄干燥，柱色谱分离(CH₂Cl₂：CH₃OH＝20：1)淡黄色固体1.42g，收率为80.6％。mp：146.6～147.9℃.MS(ESI)m/z:[M+H]⁺＝350.1.¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.03(s,1H,Ar-H),8.71(d,J＝14.2Hz,1H,Ar-H),8.09(d,J＝55.2Hz,1H,Ar-H),7.27(m,1H,NH),4.94(d,J＝28.2Hz,1H,CH),3.65-3.34(m,4H,CH₂×2),2.25-2.20(m,2H,CH₂),1.51(d,J＝31.8Hz,9H,O(CH₃)₃).

(S)-4-((1-Boc-吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体14-c)

称取2-甲氧基-3-氰基-5-溴吡啶(729mg,3.42mmol)加入到50mL的圆底烧瓶中，再依次加入联硼酸频那醇酯(1.09g,4.28mmol)、KOAc(559mg,5.70mmol)、Pd(dppf)Cl₂(175mg,0.22mmol)，二氧六环(20mL)作为溶剂，N₂保护，搅拌加热回流约3h后，TLC检测显示原料反应完全。待冷却至室温后，蒸干溶剂。加入第二步反应原料，即(S)-4-((1-叔丁氧羰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-氯吡啶并[3,4-d]嘧啶(1.00g,2.85mmol)、无水Na₂CO₃(604mg,5.70mmol)、Pd(dppf)Cl₂(175mg,0.22mmol)加入反应体系中，DME(8mL)和H₂O(2mL)作溶剂，N₂保护，搅拌加热回流约2.5h后，TLC检测显示原料反应完全，停止反应。柱色谱分离(CH₂Cl₂：CH₃OH＝20：1)得棕色固体1.18g，收率为92.3％。mp：187.9～189.3℃.MS(ESI)m/z:[M+H]⁺＝448.3.¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.04(d,J＝1.8Hz,1H,Ar-H),8.65(d,J＝24.2Hz,2H,Ar-H),8.16(dd,J＝103.2,8.7Hz,2H,Ar-H),7.23(d,J＝51.9Hz,1H,NH),4.90(s,1H,CH),3.72(ddd,J＝152.4,52.1,27.3Hz,4H,CH₂×2),2.38(ddd,J＝161.5,83.9,77.3Hz,2HCH₂),1.49(s,9H,O(CH₃)₃).

(S)-4-(1-(四氢吡喃-4-羰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物14)

称取中间体14-c(150mg,0.34mmol)加入到50mL圆底烧瓶中，加入三氟乙酸(1mL)，二氯甲烷(4mL)作溶剂，室温搅拌2h后，TLC检测显示脱Boc反应完全。将体系尽量蒸干，加入四氢吡喃-4-甲酸(67mg,0.51mmol)、HATU(259mg,0.68mmol)、DIPEA(235mg,1.70mmol)，二氯甲烷(5mL)作溶剂，室温搅拌4h后，TLC检测显示原料反应完全，依次加入水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相，无水Na₂SO₄干燥，柱色谱分离(CH₂Cl₂：CH₃OH＝20：1)得到白色固体90mg，收率为57.6％。mp:254.8～255.7℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.06-9.03(m,2H,Ar-H),8.60(ddd,J＝25.4,12.8,3.6Hz,3H,Ar-H),8.31(t,J＝5.9Hz,1H,NH),4.76(dd,J＝50.4,6.0Hz,1H,CH),4.06(s,3H,OCH₃),3.72-3.50(m,4H,CH₂×2),3.44-3.38(dd,J＝11.7,2.6Hz,3H,CH₂,CH₂),3.17(d,J＝5.2Hz,1H,CH₂),2.73-2.70(m,1H,CH₂),2.36-2.30(m,1H,CH₂),2.14-2.06(m,1H,CH),1.64-1.55(m,4H,CH₂×2).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ172.8,172.8,163.8,156.9,152.3,149.9,146.7,143.7,141.1,127.9,119.7,115.5,111.6,96.2,66.8,66.7,55.3,51.7,50.1,44.7,31.6,29.6,28.9,28.8.ESI-HRMSC₂₄H₂₅N₇O₃，计算值[M+H]⁺：460.20485，测定值：460.20496.

实施例15

(S)-4-((1-三氟乙酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物15)

采用制备化合物14相类似的方法可制得化合物15，白色固体(64mg，42.5％)。mp：253.1～254.9℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.09-9.06(m,2H,Ar-H),8.65(ddd,J＝18.3,8.2,3.1Hz,3H,Ar-H),8.49(dd,J＝12.3,5.9Hz,1H,NH),4.83(ddd,J＝16.2,11.4,5.8Hz,1H,CH),4.06(s,3H,OCH₃),3.86-3.76(m,2H,CH₂),2.36-2.14(m,2H,CH₂),1.24(dd,J＝18.3,9.0Hz,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ163.8,156.9,152.3,149.9,146.9,146.8,143.7,141.3,128.0,119.7,115.5,111.9,96.2,55.3,52.3,49.4,46.4,45.5,31.5,28.6.ESI-HRMS C₂₀H₁₆F₃N₇O₂，计算值[M+H]⁺：444.13855，测定值：444.13862.

实施例16

(S)-4-((1-环戊基甲酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物16)

采用制备化合物14相类似的方法可制得化合物16，白色固体(66mg，44.0％)。mp：224.1～225.4℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58(d,J＝2.1Hz,1H,Ar-H),9.32(dd,J＝4.8,2.5Hz,1H,Ar-H),8.57–8.47(m,3H,Ar-H),8.20(dd,J＝8.8,3.2Hz,1H,NH),4.91(dd,J＝41.9,7.3Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),4.00(dd,J＝10.1,7.5Hz,1H,CH₂),3.50-3.46(m,2H,CH₂),3.45-3.43(m,1H,CH_2b),2.89-2.85(m,1H,CH),2.25-2.18(m,2H,CH₂),1.81-1.51(m,8H,CH₂×4).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.2,174.2,164.5,156.2,150.9,142.9,137.3,131.4,127.5,125.1,115.8,96.2,56.5,55.,50.8,49.4,39.6,31.5,29.9,29.8,29.6,26.2,26.2,19.0.ESI-HRMS C₂₄H₂₅N₇O₂，计算值[M+H]⁺：444.21469，测定值：444.21485.

实施例17

(S)-4-((1-环丁基甲酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物17)

采用制备化合物14相类似的方法可制得化合物17，白色固体(46mg，31.5％)。mp：230.5～232.4℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58-9.57(m,1H,Ar-H),9.31(dd,J＝4.4,2.5Hz,1H,Ar-H),8.54-8.49(m,3H,Ar-H),8.20(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H,NH),4.89(ddd,J＝21.5,14.7,7.4Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),3.84-3.72(m,2H,CH₂),3.63-3.47(m,2H,CH₂),3.25-3.15(m,1H,CH),2.13-1.90(m,6H,CH₂×3),1.85(ddd,J＝60.0,16.2,9.6Hz,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ170.0,164.0,160.1,158.1,154.4,148.0,137.9,130.3,127.6,119.9,114.4,113.9,60.5,53.4,45.5,39.3,39.0,38.9,38.8,38.6,38.5,16.7,13.5.ESI-HRMS C₂₃H₂₃N₇O₂，计算值[M+H]⁺：430.19860，测定值：430.19833.

实施例18

(S)-4-((1-环丙基磺酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物18)

采用制备化合物14相类似的方法可制得化合物18，得到白色固体(50mg，32.4％)。mp：256.8～258.3℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),9.32(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),8.71(t,J＝4.7Hz,1H,Ar-H),8.57-8.55(m,2H,Ar-H),8.23(d,J＝8.8Hz,1H,NH),4.94(dd,J＝14.2,7.0Hz,1H,CH),4.11(s,3H,OCH₃),3.61-3.36(m,4H,CH₂×2),2.80-2.51(m,1H,CH),2.41-2.28(m,2H,CH₂),1.00-0.95(m,4H,CH₂×2).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ171.1,161.9,159.1,155.6,154.4,150.6,140.3,134.7,128.8,124.0,121.1,118.8,116.9,112.7,109.5,55.2,54.8,46.6,46.1,42.0,17.7.ESI-HRMS C₂₁H₂₁N₇O₃S，计算值[M+H]⁺：452.14993，测定值：452.14957.

实施例19

(S)-4-((1-甲磺酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物19)

采用制备化合物14相类似的方法可制得化合物19，白色固体(39mg，27.0％)。mp：216.3～218.1℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.58(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),9.32(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),8.55-8.52(m,3H,Ar-H),8.22(d,J＝8.8Hz,1H,NH),4.92(dd,J＝14.5,7.2Hz,1H,CH),4.11(s,3H,OCH₃),3.44-3.38(m,4H,CH₂×2),2.99(s,3H,CH₃),2.30-2.24(m,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ171.1,159.2,153.9,150.5,149.2,140.2,131.5,127.54,121.1,116.1,115.5,112.9,55.3,54.9,54.8,46.6,46.1,42.1,17.7.ESI-HRMSC₁₉H₁₉N₇O₃S，计算值[M+H]⁺：426.13428，测定值：452.13391.

实施例20

(S)-4-(1-(四氢吡喃-4-羰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-硝基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物20)

采用制备化合物14相类似的方法可制得化合物20，白色固体(20mg，12.3％)。mp：210.6～212.3℃.¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.59(s,1H,Ar-H),9.32(dd,J＝6.3,2.1Hz,1H,Ar-H),8.56-8.52(m,3H,Ar-H),8.21(dd,J＝8.8,3.5Hz,1H,NH),4.89(ddd,J＝21.7,14.7,7.4Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),3.65-3.55(m,4H,CH₂×2),3.29-3.24(m,2H,CH₂),2.19-2.15(m,1H,CH),2.11-1.90(m,6H,CH₂×3),1.90-1.75(m,2H,CH₂).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ172.6,164.5,151.7,150.9,142.9,131.4,127.4,125.2,115.8,96.3,55.4,41.,41.7,40.5,40.4,40.1,39.8,39.5,37.6,29.5,24.5,18.0,17.9.ESI-HRMS C₂₃H₂₅N₇O₅，计算值[M+H]⁺：480.19899，测定值：480.19884.

实施例21

(S)-4-((1-丙酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-三氟甲基吡啶-5-基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物21)

采用制备化合物14相类似的方法可制得化合物21，白色固体(88mg，58.0％)。mp：226.5～228.5℃.¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.18(d,J＝5.0Hz,2H,Ar-H),8.70(dd,J＝40.2,19.1Hz,3H,Ar-H),8.48(t,J＝6.2Hz,1H,NH),4.87-4.73(m,1H,CH),4.08(s,3H,OCH₃),3.64-3.59(m,4H,CH₂×2),2.19-2.06(m,4H,CH₂×2),1.00(dt,J＝10.3,7.4Hz,3H,CH₃).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ165.8,165.3,150.9,142.9,138.4,137.2,130.3,116.5,105.4,105.1,59.5,50.9,39.4,39.3,39.2,39.0,38.9,38.8,38.6,38.5,13.6.ESI-HRMSC₂₁H₂₁F₃N₆O₂，计算值[M+H]⁺：447.17509，测定值：447.17503.

实施例22

(S)-4-((1-环丁基甲酰基吡咯烷)-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-三氟甲基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物8)(化合物22)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物22，白色固体(52mg，43.0％)。mp：184.4～186.3℃.¹H NMR(600MHz,DMSOc)δ9.62(s,1H,Ar-H),8.95(s,1H,Ar-H),8.61–8.48(m,3H,Ar-H),8.20(d,J＝8.8Hz,1H,NH),4.86(ddd,J＝50.8,14.1,7.0Hz,1H,CH),4.09(s,3H,OCH₃),3.80(dd,J＝18.1,9.4Hz,1H,CH),3.63(s,1H,CH),3.52–3.44(m,2H,CH₂),3.32–3.23(m,1H,CH),2.28–2.02(m,6H,CH₂×3),1.96–1.85(m,1H,CH),1.80–1.70(m,1H,CH).¹³CNMR(150MHz,DMSO-d₆)δ172.6,161.2,159.6,156.2,151.5,144.0,137.2,136.1,131.5,127.1,125.6,124.4,122.8,111.9(q,J＝33.1Hz),55.0,50.1(dd,J＝116.5,101.0Hz),44.4,37.9,37.6,31.4,29.5,24.6,18.0.ESI-MS C₂₃H₂₃F₃N₆O₂，计算值[M+H]⁺：472.18，测定值：472.30.

实施例23

(S)-4-(1-(2-呋喃甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-三氟甲基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物23)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物23，白色固体(72mg，57.0％)。mp：138.6～142.6℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.63(s,1H,Ar-H),8.94(s,1H,Ar-H),8.56(t,J＝8.9Hz,3H,Ar-H),8.20(d,J＝8.7Hz,1H,NH),7.88(d,J＝14.8Hz,1H,Ar-H),7.12(s,1H,Ar-H),6.65(d,J＝16.0Hz,1H,Ar-H),5.03–4.86(m,1H,CH),4.09(s,3H,OCH₃),3.99–3.55(m,4H,CH₂×2),2.47–2.17(m,2H,CH₂).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆))δ161.2,159.6,157.6,156.1,151.6,148.2,145.6,143.9,137.2,135.9,131.6,127.1,125.5,124.4,122.6,116.1,111.9,111.8(q,J＝32.6Hz),54.9,50.9(dd,J＝288.3,175.6Hz),45.5,31.7,28.9.ESI-MS C₂₃H₁₉F₃N₆O₃，计算值[M+H]⁺：484.15，测定值：484.28.

实施例24

(S)-4-(1-(N-甲基-4-哌啶甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-三氟甲基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物24)

采用制备化合物1相类似的方法可制得化合物24，白色固体(32mg，24.0％)。mp：206.8～209.7℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆))δ9.63(s,1H,Ar-H),8.96(s,1H,Ar-H),8.63–8.51(m,3H,Ar-H),8.21(s,1H,NH),4.89(dd,J＝61.6,6.7Hz,1H,CH),4.10(s,3H,OCH₃),4.04–3.97(m,1H,CH),3.81(d,J＝6.1Hz,1H,CH),3.65(d,J＝8.0Hz,2H,CH₂),3.51–3.42(m,2H,CH₂),3.07(s,2H,CH₂),2.41(s,3H,NCH₃),2.23(dd,J＝31.4,6.8Hz,2H,CH₂),1.76(s,4H,CH₂×2),1.06(s,1H,CH).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ172.9,161.2,159.7,156.1,151.5,144.0,137.5,136.1,131.6,127.1,125.6,122.7,111.8(q,J＝39.7Hz),56.5(2C),55.0,54.2,50.5(dd,J＝60.7,40.3Hz),49.3,44.7,31.4,29.5,27.1,19.0.ESI-MSC₂₅H₂₈F₃N₇O₂，计算值[M+H]⁺：515.23，测定值：515.26.

实施例25

(S)-4-(1-(N-甲基-4-氮杂环丁烷甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-三氟甲基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物25)

称取中间体1-d(150mg,0.33mmol)加入到50mL圆底烧瓶中，加入三氟乙酸(1mL)，二氯甲烷(4mL)作溶剂，室温搅拌2h后，TLC检测显示脱Boc反应完全。将体系尽量蒸干，加入1-(叔丁氧羰基)氮杂环丁烷-3-甲酸(67mg,0.51mmol)、HATU(259mg,0.72mmol)、DIPEA(235mg,1.71mmol)，二氯甲烷(5mL)作溶剂，室温搅拌4h后，依次加入水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相，无水Na₂SO₄干燥，旋干，加入三氟乙酸(1mL)，二氯甲烷(4mL)作溶剂，室温搅拌2h后，TLC检测显示脱Boc反应完全。将体系尽量蒸干，柱色谱分离(CH₂Cl₂：CH₃OH＝10：1)，得到白色固体(54mg，24.0％)。mp：150.8～151.2℃¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.62(s,1H,Ar-H),8.97(s,1H,Ar-H),8.65–8.47(m,3H,Ar-H),8.22(d,J＝8.7Hz,1H,NH),4.89(dd,J＝51.1,6.8Hz,1H,CH),4.17–4.06(m,6H,OCH₃,CH₂,CH),3.84(ddd,J＝28.8,18.2,9.0Hz,2H,CH₂),3.65(d,J＝27.9Hz,1H,CH),3.54–3.42(m,2H,CH₂),2.40–2.18(m,3H,CH₂,CH).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ168.4,161.2,159.7,156.2,151.6,144.1,137.2,136.1,131.5,127.1,125.6,118.8,116.8,111.9(q,J＝38.7Hz),55.0,50.9,49.4,47.7(d,J＝21.7Hz),44.6,34.2,31.1,29.5.ESI-MS C₂₂H₂₂F₃N₇O₂，计算值[M+H]⁺：473.18，测定值：473.25.

实施例26

(S)-4-(1-(N-甲基-4-(S)吡咯甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-三氟甲基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物26)

采用制备化合物25相类似的方法可制得化合物26，白色固体(58mg，45.8％)。mp：126.2～129.6℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.62(d,J＝10.8Hz,1H,Ar-H),8.96(d,J＝6.6Hz,1H,Ar-H),8.64–8.52(m,3H,Ar-H),8.22(t,J＝7.7Hz,1H,NH),4.93(ddd,J＝21.6,14.7,7.4Hz,1H,CH),4.41–4.29(m,1H,NH),4.10(s,3H,OCH₃),3.92–3.83(m,1H,CH),3.69(ddd,J＝12.0,8.5,3.6Hz,1H,CH),3.61–3.46(m,3H,CH₂,CH),3.26–3.16(m,1H,CH),3.14–3.04(m,1H,CH),2.44–2.19(m,3H,CH₂,CH),1.84(m,3H,CH₂,CH).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ168.1,161.3,159.8,158.4(q,J＝30.7Hz),156.2,151.6,144.0,137.3,136.0,131.5,127.1,125.6,120.7(dd,J＝871.7,286.3Hz),111.8(dd,J＝58.2,32.8Hz),58.9,55.1,50.2(dd,J＝135.8,79.7Hz),46.5,44.9,31.1,28.9,24.7.ESI-MS C₂₃H₂₄F₃N₇O₂，计算值[M+H]⁺：487.19，测定值：487.20.

实施例27

(S)-4-(1-(N-甲基-4-氮杂环丁烷甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物27)

采用制备化合物25相类似的方法可制得化合物27，白色固体(80mg，64.1％)。mp：205.5～206.5℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.57(s,1H,Ar-H),9.31(d,J＝1.2Hz,1H,Ar-H),8.54(dd,J＝13.2,4.8Hz,3H,Ar-H),8.22(dd,J＝7.5,5.1Hz,1H,NH),4.91(dd,J＝59.9,7.1Hz,1H,CH),4.19–4.06(m,8H,OCH₃,CH₂×2,CH),3.93–3.78(m,2H,CH₂),3.67(d,J＝36.3Hz,1H,CH),3.58–3.41(m,2H,CH₂),2.42–2.18(m,2H,CH₂).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ168.3,164.5,159.6,156.0,151.6,150.8,144.2,142.9,137.4,131.4,127.5,125.2,115.9,96.4,55.4,50.3,47.8,44.7,34.3,31.2,29.5.ESI-MS C₂₂H₂₂N₈O₂，计算值[M+H]⁺：430.19，测定值：430.25.

实施例28

(S)-4-(1-(N-甲基-4-(S)吡咯甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物28)

采用制备化合物25相类似的方法可制得化合物28，白色固体(60mg，46.5％)。mp：181.1～184.4℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.65–9.45(m,1H,Ar-H),9.29(d,J＝1.6Hz,1H,Ar-H),8.74–8.43(m,3H,Ar-H),8.19(t,J＝8.2Hz,1H,NH),5.19–4.66(m,1H,CH),4.09(t,J＝6.9Hz,3H,OCH₃),4.00–3.81(m,2H,CH₂),3.69(ddd,J＝11.7,8.5,3.3Hz,1H,CH),3.59–3.50(m,2H,CH₂),3.12–3.01(m,1H,CH),2.87–2.73(m,1H,CH),2.35–2.17(m,2H,CH₂),2.16–2.05(m,1H,CH),1.79–1.62(m,2H,CH₂).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ171.2,164.4,159.7,156.1,151.6,150.9,144.0,142.8,137.2,131.4,127.4,125.3,115.9,96.2,58.9,55.4,50.5,49.3,47.1,44.8,31.3,29.6,26.1.ESI-MS C₂₃H₂₄N₈O₂，计算值[M+H]⁺：444.20，测定值：444.50.

实施例29

(S)-4-(1-(N-甲基-4-(R)吡咯甲酰基)吡咯烷-3-基)氨基-6-(2-甲氧基-3-氰基吡啶-5-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶(化合物29)

采用制备化合物25相类似的方法可制得化合物29，白色固体(67mg，51.7％)。mp：142.1～143.2℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.58(dd,J＝7.4,2.2Hz,1H,Ar-H),9.32(d,J＝1.0Hz,1H,Ar-H),8.63–8.48(m,3H,Ar-H),8.22(dd,J＝8.6,7.0Hz,1H,NH),5.06–4.85(m,1H,CH),4.55–4.45(m,1H,CH),4.10(d,J＝13.0Hz,3H,OCH₃),3.91–3.86(m,1H,CH),3.75–3.66(m,1H,CH),3.64–3.49(m,2H,CH₂),3.32–3.23(m,2H,CH₂),3.22–3.11(m,1H,CH),2.47–2.20(m,3H,CH₂,CH₂)1.97–1.77(m,3H,CH₂,CH₂).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ167.1,164.5,156.1,151.6,150.9,144.1,142.9,137.5,131.5,127.7,125.2,118.6,116.7,96.2,58.8,55.4,49.3,46.2,45.1,30.9,28.6,24.3,21.2.ESI-MS C₂₃H₂₄N₈O₂，计算值[M+H]⁺：444.20，测定值：444.50.

2、本发明化合物对PI3Kδ激酶活性的测定

测试方法：将测试的化合物样品用DMSO溶解，配制10mmol·L^-1母液，然后把化合物加到筛选体系中，化合物检测浓度范围是0.1nmol·L^-1–10μmol·L^-1，按照3倍梯度进行稀释，每个浓度做两个复孔。所有的酶反应体系组成如下：50mmol·L^-1HEPES(pH值7.5)、50mmol·L^-1NaCl、3mmol·L^-1MgCl₂、0.025mg·L^-1BSA、10μmol·L^-1ATP、激酶，激酶底物；同时加入不同浓度的待筛化合物，组成50μL的反应体系，室温下反应40分钟，后用荧光素酶的方法检测体系内的ADP含量，再反应5分钟后，在MD-SpectraMax M5多功能酶标仪上检测化学发光信号，化学发光信号值强度与酶活性抑制成正比。检测到的化学发光信号值，代入如下公式：

％activity＝{(Lu药物–Lu本底)/(Lu酶–Lu本底)}×100％

然后用Graphpad Prism5软件处理，计算出化合物的IC₅₀值。本发明化合物的生化学活性通过以上的试验进行测试，本发明化合物对PI3Kδ的IC₅₀值见表1。

表1本发明化合物对PI3Kδ激酶的IC₅₀值

A表示IC₅₀<10nM；B表示IC₅₀范围10-20nM；C表示IC₅₀范围20-100nM；D表示100-500nM；E表示IC₅₀>500nM；-表示未测试。

结论：本发明优选化合物对PI3Kδ激酶活性具有明显的抑制作用。

3、本发明化合物对PI3K激酶的选择性活性的测定

采用上述相似的方法，测试本发明化合物对PI3K激酶的各个亚型(包括PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kδ和PI3Kγ)的活性，以Idelalisib阳性药物作为对照。本发明化合物对PI3K激酶的各个亚型(包括PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kδ和PI3Kγ)的活性见表2。

表2本发明化合物对PI3K激酶各个亚型的IC₅₀值

-表示未测试。

结论：本发明优选化合物对PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kδ和PI3Kγ的IC₅₀值的表明，本发明化合物对PI3Kδ的活性具有明显的选择性作用。

4、本发明化合物对白血病细胞系的体外细胞增殖测定

测试方法：采用MTT测定本发明化合物对白血病细胞系(例如：SU-DHL-6细胞，Ramos细胞，Raji细胞)的细胞增殖抑制。将测试的化合物样品和阳性药用DMSO溶解，配制成一系列浓度梯度的母液(10^-2mol·L^-1，10^-3mol·L^-1，10^-4mol·L^-1，10^-5mol·L^-1，10^-6mol·L^-1)。使用DMEM培养基和RPMI1640培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，MTT,青霉素，链霉素等实验材料。于96孔板每孔加入浓度为8000-10000个/mL的细胞悬液200μL，置于37℃，5％CO₂培养箱中，24h后，加入样品溶液，2μL/孔，设三孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育72h，于2000转/min的离心机，离心10min，弃去上清液，加入2μL/孔的MTT，孵育4h弃去上清液，每孔加入150mL DMSO,溶解后用全自动酶标仪测490nm和570nm下的光密度值(OD)，以溶液对照处理的肿瘤细胞为对照组，按照下式求得化合物对白血病细胞的抑制率：

细胞抑制率＝(1-给药组平均OD值/对照组平均OD值)×100％

在抑制率的基础上通过改良寇氏法计算出IC₅₀值。以idelalisib作为阳性对照药进行测试。本发明化合物的细胞活性通过此试验进行测试，其中代表性化合物对白血病细胞系SU-DHL-6细胞的抑制活性见表3。

表3本发明化合物对SU-DHL-6细胞的IC₅₀值

另外本发明中代表性化合物对白血病细胞系Ramos细胞和Raji细胞的抑制活性与SU-DHL-6细胞的活性相似。

结论：本发明优选化合物对白血病细胞具有不同的抑制作用，说明本发明优选化合物对不同细胞类型具有不同的效力。

5、本发明化合物对SU-DHL-6细胞的AKT磷酸化的抑制的测定

测试方法：采用Western Blot试验方法测定本发明化合物1、8、9、24、25、26对SU-DHL-6细胞的AKT磷酸化的抑制。将测试的化合物样品和阳性药用DMSO溶解，配制成一系列浓度梯度的母液(10^-2mol·L^-1，10^-3mol·L^-1，10^-4mol·L^-1，10^-5mol·L^-1，10^-6mol·L^-1)。使用RPMI1640培养基，胎牛血清,PBS、PBST缓冲液、BCA试剂盒、蛋白裂解液、上样缓冲液、电泳缓冲液、转膜缓冲液、一抗、二抗、化学发光试剂盒等。于6孔板每孔加入浓度为6×10⁵个/mL的细胞悬液2mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中，24h后，加入样品溶液或DMSO，2μL/孔，设二孔，使药物的最终浓度为10^-5mol·L^-1、10^-6mol·L^-1、10^-7mol·L^-1、和10^-8mol·L^-1，给药结束后，在培养箱中继续培养24h。然后将每孔培养基转移至离心管离心10min，速度为1000r/min。随后弃去上清液，使用PBS洗涤两次后，按每孔100μL加入裂解液(RIPA+PMSF+磷酸酶抑制剂)，随后高速冷冻离心30min，转速为1.2×10⁴r/min；结束后收集上清液待用。

接下来使用不同浓度的标准蛋白加入到96孔板中，使用蛋白定量试剂盒，并在波长为562nm处测量吸光度值绘制标准曲线。同样的方法测定给药组、DMSO组的吸光度值，根据标准曲线计算其蛋白浓度。后加入RIPA调平总蛋白浓度，加入Loading Buffer，99℃煮沸5min，使蛋白变性，待用。使用凝胶试剂盒，根据相应比例，制备分离胶和浓缩胶，上样，通过SDS-PAGE进行电泳分离2.5h。电泳结束后，切下相应蛋白位置的分离胶，与PVDF膜紧密贴合，在冰上进行转膜2h。结束后，封闭2h。封闭完成后，PBST洗涤2次，后用相应的一抗(AKT、p-Ser⁴⁷³AKT和β-actin)4℃孵育13-16h。结束后，PBST洗涤3次，二抗孵育30min，结束后PBST洗膜3次。二抗孵育结束后，将膜取出，使用专用发光试剂盒进行化学发光。结果见图1和图2。

结论：本发明优选化合物对磷酸化的Akt有明显的抑制作用，呈浓度依赖性，说明本发明优选化合物对不同细胞类型具有不同的效力。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种吡啶并嘧啶类化合物，其特征在于，该化合物结构式如下：

其中，X₁和X₂必有一个为N，另一个为CH；Z为NH；W为羰基或磺酰基；

R¹为甲氧基；

R²为氰基或三氟甲基；

R³为甲基、乙基、三氟甲基、羟甲基、环己基、环戊基、环丁基、环丙基、1-甲基哌啶基、氮杂环丙基、氮杂环丁基或呋喃基。

2.根据权利要求1所述的吡啶并嘧啶类化合物，其特征在于，该化合物结构式如下：

其中，Z为NH；

W为羰基或磺酰基；

R¹为甲氧基；

R²为氰基或三氟甲基；

R³为甲基、乙基、三氟甲基、羟甲基、环己基、环戊基、环丁基、环丙基、1-甲基哌啶基、氮杂环丙基、氮杂环丁基或呋喃基。

3.一种吡啶并嘧啶类化合物，其特征在于，为以下结构中任意一种：

4.权利要求1～3中任意一项所述的吡啶并嘧啶类化合物在药学上能够接受的盐。

5.权利要求1～3中任意一项所述的吡啶并嘧啶类化合物或权利要求4所述的吡啶并嘧啶类化合物在药学上能够接受的盐在制备治疗和/或预防PI3Kδ过度表达所引起的疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疾病为类风湿性关节炎、血液肿瘤、淋巴瘤或PI3Kδ过度活化综合症。

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