CN110452243B - 一种吡咯并嘧啶衍生物表皮生长因子抑制剂及其制备方法与用途 - Google Patents
一种吡咯并嘧啶衍生物表皮生长因子抑制剂及其制备方法与用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种EGFR蛋白酪氨酸激酶的临床突变体的选择性抑制剂，及具有如式(I)的结构，是一类含有吡咯并嘧啶结构的化合物，同时公开了该类化合物的制备方法和其作为EGFR蛋白酪氨酸激酶的临床突变体的选择性抑制剂的应用，尤其是对于T790M变异的表皮生长因子受体EGFR的抑制作用，和在治疗与表皮生长因子受体EGFR过度表达相关疾病如肾癌、肺癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌和胶质细胞瘤。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种吡咯并嘧啶衍生物表皮生长因子抑制剂及其制备方法与用途。
背景技术
皮生长因子EGFR(epithelial growth factor receptor)是一个170kDa的跨膜糖蛋白受体酪氨酸激酶，由表皮生长因子激活，影响细胞的生长和分化。EGF或TGFα对EGFR的结合激活受体的酪氨酸激酶活力。EGFR羧基末端的酪氨酸残基Tyr1068、Tyr1148、和Tyr1173是EGF结合后发生的自动磷酸化的主要位点。一旦被激活，EGFR1068位和1173位磷酸化的酪氨酸残基就能介导Grb2对EGFR的结合。此外，1173位磷酸化的酪氨酸残基是SHC在EGFR上的主要结合位点。EGFR广泛分布在许多正常和恶性上皮细胞中，其过度表达和自我激活可能与许多肿瘤的发生发展有关。目前主要用于各种上皮源性恶性肿瘤包括头颈部鳞癌、肺癌、乳腺癌和膀胱癌等的研究。
蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶。许我生长因子受体蛋白包括表皮生长因子受体通过磷酸化而起作用，表皮生长因子受体EGFR酪氨酸激酶使表皮生长因子受体磷酸化。临床上，EGFR酪氨酸激酶抑制剂已被用于癌症的治疗，第一代可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和埃罗替尼。对身体里有这些特定的激活突变的病毒人表现出了显著的临床反应(50-80％)。然而，对于这些药物产生继发性而药突变的病人会几个月内遭受癌症的复发。第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂包括来那替尼，达克替尼，阿法替尼，这些药物的结构中都含有亲电的基团Michael受体。其中以阿法替尼为药物代表为例，烯丙酰胺结构对阿法替尼的抗肿瘤活性起着至关重要的作用，它作为Michael受体与EGFR上半胱氨酸残基(Cys797)的催化部位(新核的巯基)发生迈克尔加成反应，从而使激酶失活，不可逆地抑制酪氨酸激酶的活性，因而具有良好的耐受性。研究者们通过培养抑制剂与受体的晶体，从分子水平上完全证明了这些共价键的存在，并且发现了阿法替尼通过与HER2的Cys 805以及HER4的Cys 803作用进而强力抑制这些酶。在对野生型EGFR体外测试显示，阿法替尼在对野生型EGFR与L858R/T790M双突变型的抑制作用与吉非替尼、埃罗替尼以及拉帕替尼相比有着更好的效果。此外，阿法替尼对DER4的抑制作用高于拉帕替尼30倍。第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂奥希替尼对L858R/T790M/C797S三突变型的抑制作用也达到纳摩尔。总之，进一步开发出对突变型具有强抑制作用的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，同时，研发高效、低毒的具有耐药性的抗肿瘤新药在当前药物研发领域中十分重要。
发明内容
本发明为了抑制T790M变异的EGFR酪氨酸激酶，设计了一系列抑制剂小分子，发现了对T790M变异EGFR具有高抑制活性的化合物，并且该化合物对癌细胞具有明显的抑制作用，该化合物为含有吡咯并嘧啶结构的化合物和α,β-不饱和羧酸酰胺结构。该化合物可以对T790M/L858R变体EGFR实现高活性抑制，并可以抑制或杀死EGFRT790M变异的肿瘤细胞，同时对野生型EGFR具有很高的抑制活性作用。
本发明提供了式(I)所示吡咯并嘧啶衍生物的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐，其可作为一种不可逆EGFR抑制剂，
其中：
可为如下任一种
R1可以为如下结构：
其中R2，R3和R4各自可以为H，C1-12烷基，C1-12杂烷基，C1-12杂环烷基，C1-12烯基，C1-12炔基，C1-12环烷基中任意一种。
优选地，所述化合物包括具有如表1结构的化合物：
表1结构通式(I)的化合物包括编号801-815的一种
本发明还提供了上述吡咯并嘧啶衍生物EGFR蛋白酪氨酸激酶选择性抑制剂的一种制备方法，如Scheme 1所示，该方法包括以下步骤：起始原料经Suzuki偶联反应得到关键中间体2，中间体2各自与双环化合物发生亲电取代，酰化，最后得到相应的通式(I)所示的化合物(Scheme 1所示)
Scheme 1通式(I)化合物的合成与制备
本发明还提供了前述的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物、EFGR激酶抑制剂中的用途。
所述药物组合物为片剂、胶囊、颗粒剂、喷雾剂或者注射剂的形式。
所述药学上可接受的载体选自填充剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂中的一种或多种。包括但不限于任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、吸收延迟剂等，这样的介质和药剂用于药学活性物质在本领域的众所周知的。
本发明还提供了所述吡咯并嘧啶衍生物表皮生长因子抑制剂及药学上可接受的盐作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂的用途；
进一步地，所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂为表皮生长因子受体抑制剂；
更优选地，所述表皮生长因子受体抑制剂为对T790M变异的表皮生长因子受体的抑制剂。
吡咯并嘧啶衍生物表皮生长因子抑制剂及药学上可接受的盐或者其药物组合物在制备用于治疗表皮生长因子受体过度表达相关疾病的药物中的用途。
进一步地，所述肿瘤为肝癌、肺癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌和星形胶质母细胞瘤。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改，替换或变更。
以下通过实施形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解发本发明上述主题的范围仅于以下的实例。凡基于发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明。
制备具有通式(I)化合物的方法包括：起始原料经Suzuki偶联反应得到关键中间体2，中间体2各自与双环化合物发生亲电取代，酰化，最后得到相应的通式(I)所示的化合物。值得说明的是，通式(I)化合物包括但不限于下述列举的化合物。
实施例1：1-{7-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-丙烯酮(化合物801)的制备：
中间体4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶2a的制备：
将3-碘-4-氨基-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶(293mg，1.13mmol)溶于乙醇和DME的混合溶剂2mL中(1:3)中，再加入0.25mL饱和碳酸钠溶液和N-甲基吲哚-3-硼酸频哪醇酯(411mg，1.6mmol)。整个体系抽换气三次后，向混合物中加入四(三苯基膦)钯(127mg，0.11mmol)，然后将整个体系在氮气条件下加热到90℃并搅拌12小时。待反应结束后，用硅藻土进行过滤，所得滤液用水和二氯甲烷洗涤三次。将有机相通过减压旋蒸得到固体，并通过硅胶柱层析进行分离(淋洗剂为含1-2％甲醇的二氯甲烷)，最后获得目标化合物245mg(0.93mmol)，为淡绿色固体，收率：82％。LC/MS(ESI)：m/z 264(M+H)+。
中间体1-{N-Boc-2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3a的制备：
在80℃下搅拌2a(205mg，0.78mmol)和N-Boc-2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物182mg，收率：48％。LC/MS(ESI)：m/z 487(M+H)+。
中间体1-{2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4a的制备：
将3a(92mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{7-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-丙烯酮(化合物801)的制备：
将上一步粗产物4a溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体53mg，两步收率：63％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,1H),8.17(d,1H),7.59(d,1H),7.44(m,1H),7.33(m,1H),7.19(s,1H),7.10(s,1H),7.01(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),3.72-3.64(m,8H),1.79-1.54(m,4H),1.32(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 441(M+H)+。
实施例2：1-{7-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-丙烯酮(化合物802)的制备：
中间体4-氨基-3-(1-甲基-2-氮杂-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶2b的制备：
将3-碘-4-氨基-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶(294mg，1.13mmol)溶于乙醇和DME的混合溶剂2mL中(1:3)中，再加入0.25mL饱和碳酸钠溶液和N-甲基2-氮杂吲哚-3-硼酸频哪醇酯(413mg，1.6mmol)。整个体系抽换气三次后，向混合物中加入四(三苯基膦)钯(127mg，0.11mmol)，然后将整个体系在氮气条件下加热到90℃并搅拌12小时。待反应结束后，用硅藻土进行过滤，所得滤液用水和二氯甲烷洗涤三次。将有机相通过减压旋蒸得到固体，并通过硅胶柱层析进行分离(淋洗剂为含1-2％甲醇的二氯甲烷)，最后获得目标化合物234mg(0.88mmol)，为淡绿色固体，收率：78％。LC/MS(ESI)：m/z 265(M+H)+。
中间体1-{N-Boc-2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3b的制备：
在80℃下搅拌2b(206mg，0.78mmol)和N-Boc-2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物190mg，收率：50％。LC/MS(ESI)：m/z 488(M+H)+。
中间体1-{2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4b的制备：
将3b(93mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{7-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-丙烯酮(化合物802)的制备：：
将上一步粗产物4b溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体48mg，两步收率：57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.32-8.27(m,2H),7.92(d,1H),7.65(m,1H),7.45(m,1H),7.10(s,1H),7.02(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),3.95(s,3H),3.72-3.64(m,5H),1.79-1.54(m,4H),1.32(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 442(M+H)+。
实施例3：1-{7-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-丙烯酮(化合物803)的制备：
中间体4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶2c的制备：
将3-碘-4-氨基-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶(294mg，1.13mmol)溶于乙醇和DME的混合溶剂2mL中(1:3)中，再加入0.25mL饱和碳酸钠溶液和N-甲基2-氮杂吲哚-3-硼酸频哪醇酯(413mg，1.6mmol)。整个体系抽换气三次后，向混合物中加入四(三苯基膦)钯(127mg，0.11mmol)，然后将整个体系在氮气条件下加热到90℃并搅拌12小时。待反应结束后，用硅藻土进行过滤，所得滤液用水和二氯甲烷洗涤三次。将有机相通过减压旋蒸得到固体，并通过硅胶柱层析进行分离(淋洗剂为含1-2％甲醇的二氯甲烷)，最后获得目标化合物232mg(0.88mmol)，为淡绿色固体，收率：78％。LC/MS(ESI)：m/z 265(M+H)+。
中间体1-{N-Boc-2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3c的制备：
在80℃下搅拌2c(206mg，0.78mmol)和N-Boc-2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物190mg，收率：50％。LC/MS(ESI)：m/z 488(M+H)+。
中间体1-{2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4c的制备：
将3c(93mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{7-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-丙烯酮(化合物803)的制备：：
将上一步粗产物4b溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体48mg，两步收率：57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(d,1H),8.39(d,1H),8.27(s,1H),7.06-7.17(m,5H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),3.72-3.59(m,8H),1.79-1.54(m,4H),1.32(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z442(M+H)+。
实施例4：1-{6-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基}-丙烯酮(化合物804)的制备：
中间体1-{N-Boc-2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3d的制备：
在80℃下搅拌2a(205mg，0.78mmol)和N-Boc-2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物168mg，收率：47％。LC/MS(ESI)：m/z 459(M+H)+。
中间体1-{2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4d的制备：
将3d(87mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{6-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基}-丙烯酮(化合物804)的制备：
将上一步粗产物4d溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体45mg，两步收率：58％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,1H),8.17(d,1H),7.59(d,1H),7.44(m,1H),7.33(m,1H),7.19(s,1H),7.10(s,1H),7.01(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.74-3.72(m,7H),1.89-1.64(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 413(M+H)+。
实施例5：1-{6-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基}-丙烯酮(化合物805)的制备：
中间体1-{N-Boc-2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3e的制备：
在80℃下搅拌2a(206mg，0.78mmol)和N-Boc-2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物161mg，收率：45％。LC/MS(ESI)：m/z 460(M+H)+。
中间体1-{2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4e的制备：
将3e(87mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{6-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基}-丙烯酮(化合物805)的制备：
将上一步粗产物4e溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体49mg，两步收率：62％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.32-8.27(m,2H),7.92(d,1H),7.65(m,1H),7.45(m,1H),7.10(s,1H),7.02(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.95(s,3H),3.72(s,4H),1.89-1.64(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 414(M+H)+。
实施例6：1-{6-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基}-丙烯酮(化合物806)的制备：
中间体1-{N-Boc-2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3f的制备：
在80℃下搅拌2c(206mg，0.78mmol)和N-Boc-2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物183mg，收率：51％。LC/MS(ESI)：m/z 460(M+H)+。
中间体1-{2-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4f的制备：
将3f(87mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{6-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基}-丙烯酮(化合物806)的制备：
将上一步粗产物4f溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体47mg，两步收率：60％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(d,1H),8.39(d,1H),8.27(s,1H),7.06-7.17(m,5H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.72(s,4H),3.59(s,3H),1.89-1.64(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 414(M+H)+。
实施例7：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-丙烯酮(化合物807)的制备：
中间体1-{N-Boc-7-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3g的制备：
在80℃下搅拌2a(205mg，0.78mmol)和N-Boc-7-氮杂螺[3.5]壬烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物182mg，收率：48％。LC/MS(ESI)：m/z 487(M+H)+。
中间体1-{7-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4g的制备：
将3g(92mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-丙烯酮(化合物807)的制备：
将上一步粗产物4g溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体53mg，两步收率：63％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,1H),8.17(d,1H),7.59(d,1H),7.44(m,1H),7.33(m,1H),7.19(s,1H),7.10(s,1H),7.01(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.82-3.74(m,7H),1.89-1.64(m,4H),1.54-1.52(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 441(M+H)+。
实施例8：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-丙烯酮(化合物808)的制备：
中间体1-{N-Boc-7-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3h的制备：
在80℃下搅拌2b(206mg，0.78mmol)和N-Boc-7-氮杂螺[3.5]壬烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物190mg，收率：50％。LC/MS(ESI)：m/z 488(M+H)+。
中间体1-{2-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4h的制备：
将3h(93mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-丙烯酮(化合物808)的制备：
将上一步粗产物4h溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体48mg，两步收率：57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.32-8.27(m,2H),7.92(d,1H),7.65(m,1H),7.45(m,1H),7.10(s,1H),7.02(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.95(s,3H),3.82(s,4H),1.89-1.64(m,4H),1.54-1.52(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 442(M+H)+。
实施例9：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-丙烯酮(化合物809)的制备：
中间体1-{N-Boc-7-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3i的制备：
在80℃下搅拌2c(206mg，0.78mmol)和N-Boc-7-氮杂螺[3.5]壬烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物190mg，收率：50％。LC/MS(ESI)：m/z 488(M+H)+。
中间体1-{7-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4i的制备：
将3i(93mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基}-丙烯酮(化合物809)的制备：
将上一步粗产物4i溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体48mg，两步收率：57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(d,1H),8.39(d,1H),8.27(s,1H),7.06-7.17(m,5H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.82(s,4H),3.59(s,3H),1.89-1.64(m,4H),1.54-1.52(m,4H).LC/MS(ESI)：m/z 442(M+H)+。
实施例10：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.5]壬烷-6-基}-丙烯酮(化合物810)的制备：
中间体1-{N-Boc-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3j的制备：
在80℃下搅拌2a(205mg，0.78mmol)和N-Boc-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物182mg，收率：48％。LC/MS(ESI)：m/z 487(M+H)+。
中间体1-{6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4j的制备：
将3j(92mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.5]壬烷-6-基}-丙烯酮(化合物810)的制备：
将上一步粗产物4j溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体53mg，两步收率：63％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,1H),8.17(d,1H),7.59(d,1H),7.44(m,1H),7.33(m,1H),7.19(s,1H),7.10(s,1H),7.01(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.82-3.74(m,5H),3.27(s,2H),1.89-1.64(m,6H),1.44-1.42(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 441(M+H)+。
实施例11：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.5]壬烷-6-基}-丙烯酮(化合物811)的制备：
中间体1-{N-Boc-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3k的制备：
在80℃下搅拌2b(206mg，0.78mmol)和N-Boc-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物190mg，收率：50％。LC/MS(ESI)：m/z 488(M+H)+。
中间体1-{6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4k的制备：
将3k(93mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.5]壬烷-6-基}-丙烯酮(化合物811)的制备：
将上一步粗产物4k溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体48mg，两步收率：57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.32-8.27(m,2H),7.92(d,1H),7.65(m,1H),7.45(m,1H),7.10(s,1H),7.02(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.95(s,3H),3.82(m,2H),3.27(s,2H),1.89-1.64(m,6H),1.44-1.42(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 442(M+H)+。
实施例12：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.5]壬烷-6-基}-丙烯酮(化合物812)的制备：
中间体1-{N-Boc-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3l的制备：
在80℃下搅拌2c(206mg，0.78mmol)和N-Boc-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物190mg，收率：50％。LC/MS(ESI)：m/z 488(M+H)+。
中间体1-{6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4l的制备：
将3l(93mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.5]壬烷-2-基}-丙烯酮(化合物812)的制备：
将上一步粗产物4l溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体48mg，两步收率：57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(d,1H),8.39(d,1H),8.27(s,1H),7.06-7.17(m,5H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.82(m,2H),3.59(s,3H),3.27(s,2H),1.89-1.64(m,6H),1.44-1.42(m,2H).LC/MS(ESI)：m/z 442(M+H)+。
实施例13：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6-基}-丙烯酮(化合物813)的制备：
中间体1-{N-Boc-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3m的制备：
在80℃下搅拌2a(205mg，0.78mmol)和N-Boc-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物177mg，收率：48％。LC/MS(ESI)：m/z 473(M+H)+。
中间体1-{6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4m的制备：
将3m(90mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6-基}-丙烯酮(化合物813)的制备：
将上一步粗产物4m溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体51mg，两步收率：63％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,1H),8.17(d,1H),7.59(d,1H),7.44(m,1H),7.33(m,1H),7.19(s,1H),7.10(s,1H),7.01(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.74(s,3H),3.33-3.28(s,4H),1.89-1.64(m,6H).LC/MS(ESI)：m/z 427(M+H)+。
实施例14：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6-基}-丙烯酮(化合物814)的制备：
中间体1-{N-Boc-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3n的制备：
在80℃下搅拌2b(206mg，0.78mmol)和N-Boc-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物184mg，收率：50％。LC/MS(ESI)：m/z 474(M+H)+。
中间体1-{6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4n的制备：
将3n(90mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吲唑-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6-基}-丙烯酮(化合物814)的制备：
将上一步粗产物4n溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体46mg，两步收率：57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.32-8.27(m,2H),7.92(d,1H),7.65(m,1H),7.45(m,1H),7.10(s,1H),7.02(s,2H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.95(s,3H),3.33-3.28(s,4H),1.89-1.64(m,6H).LC/MS(ESI)：m/z 428(M+H)+。
实施例15：1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.4]辛烷-6-基}-丙烯酮(化合物815)的制备：
中间体1-{N-Boc-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶3o的制备：
在80℃下搅拌2c(206mg，0.78mmol)和N-Boc-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-((甲基磺酰基)氧基)(1eq)和碳酸钾(2eq)的DMF(3mL)悬浮液16h。反应结束后，用水处理混合物并用二氯甲烷萃取。收集有机相，干燥后真空浓缩得到淡绿色目标化合物184mg，收率：50％。LC/MS(ESI)：m/z 474(M+H)+。
中间体1-{6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基}-4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-1H-吡咯[3,4-d]嘧啶4o的制备：
将3o(90mg，0.19mmol)溶于2mL二氯甲烷溶液中，加入过量的三氟乙酸，在室温下搅拌混合物2h，用二氯甲烷稀释混合物，然后用饱和碳酸氢钠水溶液中和洗涤。收集有机相，用无水硫酸钠进行干燥后真空浓缩，所得粗产物不用提纯直接投下一步。
1-{2-[4-氨基-3-(1-甲基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯[3,4-d]嘧啶-1-基]-6-氮杂螺[3.4]辛烷-2-基}-丙烯酮(化合物815)的制备：
将上一步粗产物4o溶解在5mL四氢呋喃溶液中，加入DIPEA(196μL，1.2mmol)，然后滴加丙烯酰氯(17μL，0.21mmol)，搅拌反应2小时。经TLC检测反应完全。停止反应，加入DCM(25mL)，然后用50mL饱和NaHCO3水洗，水层用DCM(2*25mL)萃取，无水MgSO4干燥，浓缩，粗产品通过快速柱分离得到黄色固体46mg，两步收率：57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(d,1H),8.39(d,1H),8.27(s,1H),7.06-7.17(m,5H),6.62(m,1H),6.04(m,1H),5.58(m,1H),4.20(m,1H),3.59(s,3H),3.33-3.28(m,4H),1.89-1.64(m,6H).LC/MS(ESI)：m/z 428(M+H)+。
实施例16：EGFR激酶抑制活性及相关突变位点结合率的测定
对上述实施例1-15制得的化合物811-815，采用FRET技术来测定前述化合物对EGFR激酶抑制活性，该抑制活性采用IC50这一指标对表示，IC50即EGFR激酶的活性被抑制50％时的化合物的浓度。
同时采用TR-FRET技术对本发明化合物实施例1-15制得的化合物811-815的EGFR-T790M激酶活性抑制作用进行测定，也采用IC50这一指标对表示。采用Life technologies公司Z’-LYTETM Kinase Assay Kits(PV3193)，并选用Tyrosine 4Peptide中的EGFR-T790M激酶解决方案进行活性测定试验。测定结果见表2
表2实施例化合物的EGFR抑制活性及EGFRT790M结合率测定
| EGFR | EGFR<sup>T790M</sup> | |
| 样品编号 | IC<sub>50</sub>(nM) | IC<sub>50</sub>(nM) |
| 801 | 18.2 | 0.9 |
| 802 | 27.5 | 18.6 |
| 803 | 37.2 | 26.5 |
| 804 | 16.7 | 1.4 |
| 805 | 26.5 | 13.3 |
| 806 | 48.9 | 32.8 |
| 807 | 18.7 | 1.6 |
| 808 | 23.5 | 17.3 |
| 809 | 38.6 | 32.4 |
| 810 | 19.7 | 2.1 |
| 811 | 26.4 | 13.5 |
| 812 | 38.9 | 31.7 |
| 813 | 12.7 | 1.1 |
| 814 | 26.9 | 16.5 |
| 815 | 36.6 | 30.4 |
实施例17：本发明化合对癌细胞株的抑制活性测定(MTT法检测)
细胞株：人非小细胞肺癌腺癌细胞株NCI-H1975(EGFR-T790M高表达)，人非小细胞肺细胞株A549(EFGR高表达)。
方法：将细胞株NCI-H1975和A549置于20％FBS(胎牛血清)(Gibco)+1640+1％双抗进行培养。然后取生长状态良好的NCI-H1975细胞，5000个/孔分别接种于96孔细胞板，置于37℃、含5％CO2的培养箱中孵出育24h使细胞贴壁完全。弃去旧培养液，每孔依次加入100μL含0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000和10000nmol/L待测化合物的培养液，溶剂对照组每孔加入100μL含0.1％DMSO的培养液，每组3复孔，72h后弃去旧的培养液，避光条件下每孔加入100μL含0.5mg·mL-1MTT的培养液，置于细胞培养箱中继续孵育4h，弃去上清，每孔加入100μLDMSO，振荡，用酶标仪在492nm波长下测定各孔吸光度值。根据各化合物不同浓度对备细胞生长的抑制率，经换算得到下表中的IC50(nM)。
表3化合物对肺癌细胞株作用
| NCI-H1975 | A549 | |
| 样品编号 | IC<sub>50</sub>(nM) | IC<sub>50</sub>(nM) |
| 801 | 18 | 1.2 |
| 804 | 26 | 1.8 |
Claims (6)
1.一种具有结构通式(I)的吡咯并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，
其中：
选自如下任一种：
R1选自如下结构：
其中R2，R3和R4各自选自H，C1-12烷基，C1-12烯基，C1-12炔基。
2.根据权利要求1所述的吡咯并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述结构通式(I)的化合物选自如下结构式：
3.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的吡咯并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊、颗粒剂、喷雾剂或者注射剂的形式。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自填充剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂中的一种或多种。
6.权利要求1或2所述的吡咯并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐或者权利要求3至5中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗表皮生长因子受体过度表达相关疾病的药物中的用途；
其中，所述表皮生长因子受体过度表达相关疾病选自肾癌、肺癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌和胶质细胞瘤中的一种或多种。
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|---|
| 酪氨酸激酶抑制剂类小分子抗肿瘤药物的研究进展;张星贤等;《中国新药杂志》;20181231;第27卷(第22期);第2616-2629页 * |
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