CN114306337A - 山莨菪碱在制备治疗新型冠状病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了山莨菪碱在制备治疗新型冠状病毒药物中的应用,属于医药技术领域。本发明首次通过实验表明山莨宕碱对新冠病毒的抑制效果非常显著,为新型冠状病毒性肺炎的临床治疗提供了一种安全范围大、毒副作用小的治疗药物,也为拓展山莨宕碱的临床应用提供实验支持。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,更具体的说是涉及山莨菪碱在制备治疗新型冠状病毒药物中的应用。
背景技术
山莨菪碱是中国科学家1965年从茄科植物唐古特莨菪中提取出的生物碱,其人工合成品为654-2。山莨菪碱的结构与阿托品相似,是托品酸和有机碱形成的酯类,在托品基的6位碳原子上有不对称的羟基。
山莨菪碱属于非选择性的M受体阻断剂,能够阻断M1-M5受体亚型。因此,山莨菪碱有一系列相似于阿托品的药理作用如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌,抑制胃肠蠕动及膀胱收缩,其他作用还包括散瞳、扩张支气管、有机磷酸酯类中毒的解救等。自1965年以来,山莨菪碱被用于感染性休克,弥散性血管内凝血等感染性疾病的治疗,取得了很好的治疗效果。北京友谊医院儿科使用山莨菪碱治疗爆发型流行性脑脊髓膜炎,使死亡率从66.9%下降到12.4%,用山莨菪碱治疗中毒性细菌性痢疾,使死亡率从20-30%下降到0.5%。研究者将其作用机制归结为抑制去甲肾上腺素诱导的微血管痉挛和扩张小血管,对抗自由基损伤的作用。近年来有报道山莨菪碱的抗休克作用与减少血小板内血栓素合成、抑制粒细胞和血小板的聚集密切相关,同时也可以拮抗内毒素对白细胞流态和功能的干扰,减少白细胞附壁滚动和粘附,明显降低内皮细胞与白细胞的粘附系数,加快血液流速。山莨菪碱还能降低离体组织中的丙二醛的含量,保护内毒素激活的多形核细胞对血管内皮细胞的损伤,稳定内皮细胞膜。这些作用可以归结为解除小血管痉挛,扩张血管,增加血流从而改善微循环的作用,以及经阻断Ca2+内流而实现的膜稳定作用,是目前已知的主要机制。
近年来,一些研究表明,除了血管机制以外,山莨菪碱还可以通过抗炎机制来发挥抗休克作用,Kushiya等的研究发现,山莨菪碱具有显著抑制2型志贺氏毒素(Stx2)诱导人外周单核细胞产生炎症因子(TNFα,IL-1β,IFN-γ)的能力。Nakagawa等人研究证实,山莨菪碱能够显著抑制感染性休克小鼠血清中致炎细胞因子(TNFα,IL-6,IL-1β,IFNγ)的水平,并能有效降低感染性休克小鼠的死亡率。在培养的人脐静脉内皮细胞,山莨菪碱能够显著抑制内毒素诱导的内皮细胞表达纤溶酶原激活抑制因子1(PAI-1)和组织因子(TF)表达,并推测其作用与NF-κB有关。这些研究提示,山莨菪碱的抗感染作用在其抗休克作用中扮演了重要的角色。
国际病毒分类委员会将引起新型冠状病毒肺炎的新型冠状病毒命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。WHO同日宣布,将这一病毒引起的疾病正式命名为Coronavirus Disease 2019(COVID-19)。中国科学院武汉病毒研究所石正丽团队从早期的5例患者样本中获得了该病毒的全基因组序列,来自5例患者的病毒序列相似性达到99.9%。尽管该病毒全基因组与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)/BJ01株的序列一致性为79.5%,但被作为冠状病毒分类标准的开放阅读框(ORF)1ab中的7个保守的复制酶结构域与SARS-CoV氨基酸序列一致性高达94.6%,提示该新型冠状病毒SARS-CoV属于SARS相关冠状病毒(SARSr-CoV)家族。SARS-CoV-2侵入宿主细胞所依赖的受体与SARS-CoV相同,也是血管紧张素转化酶II。由于ACE2的表达分布,这2种冠状病毒主要感染有纤毛的支气管上皮细胞和人肺泡II型上皮细胞。COVID-19疫情严重威胁人类健康及社会、经济发展;面对COVID-19全球暴发的严峻态势,相关药物与疫苗的研发是疫情控制非常迫切的需要。
因此,提供山莨菪碱在制备治疗新型冠状病毒药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了山莨菪碱在制备治疗新型冠状病毒药物中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
山莨菪碱在制备治疗新型冠状病毒药物中的应用。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明的有益效果如下:山莨菪碱作为一种已经在临床上应用多年的药物,其药理特性明确,安全范围大、毒副作用小,本发明的实验数据首次表明山莨宕碱对新冠病毒的抑制效果非常显著。本发明为新型冠状病毒性肺炎的临床治疗提供了一种安全范围大、毒副作用小的治疗药物,也为拓展山莨宕碱的临床应用提供实验支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明不同浓度的山莨菪碱对细胞活力的影响;
图2附图为本发明山莨菪碱对新型冠状病毒的抑制作用荧光定量结果图;
其中,A:正常组;B:新冠病毒感染组;C:新冠病毒感染+山莨菪碱(50μg/ml)预处理组;D:新冠病毒感染+山莨菪碱(100μg/ml)预处理组;E:新冠病毒感染+山莨菪碱(200μg/ml)预处理组;
图3附图为本发明山莨菪碱对新型冠状病毒的抑制作用荧光定量统计结果图;其中,***P<0.001vs新冠病毒组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)细胞、试剂
Vero E6细胞由海军军医大学海军医学系生物医学防护教研室提供;本实验所用鼻/咽拭子样本来源于2020年1月至2月海军军医大学长海医院收治的COVID-19肺炎疑似患者,由海军军医大学海军医学系生物医学防护教研室利用qRT-PCR法从送检的COVID-19疑似患者鼻/咽拭子样本中检测出SARS-CoV-2核酸阳性样本。用于SARS-CoV-2分离的样本以每管200μL分装,冻存于-80℃冰箱中。COVID-19患者恢复期血清样本取自江苏大学附属镇江第三人民医院收治的确诊COVID-19患者(在患者治疗康复出院3周后采集)。病毒的分离全过程均在海军军医大学P3实验室中进行。SARS-CoV-2(ORF1ab/N基因)荧光探针定量试剂盒为上海伯杰生物医药有限公司产品;青链霉素双抗为美Thermo Fisher公司产品。
(2)CCK8检测细胞活力
山莨菪碱用PBS稀释,在96孔板中接种Vero E6细胞悬液(100μl/孔),细胞密度约为4×104个/mL,24小时后给药,使山莨菪碱的终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml,每个药物浓度做5个复孔,给药24小时后细胞换液,按照CCK8试剂盒(上海东仁化学科技有限公司)的说明书每孔加入10μl的CCK8,将培养板在培养箱中孵育0.5小时后,利用酶标仪检测450nm处各组细胞的吸光度值,结果见图1。
图1结果显示,给予50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的山莨菪碱后,细胞活力并未发生有意义的降低,提示这些浓度的山莨菪碱对细胞均未产生毒性作用。
(3)细胞给药及分组
根据课题组前期的实验研究探索得到的治疗剂量以及CCK8检测结果,确定山莨菪碱的给药剂量分别分为如下几组:50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml;观察山莨菪碱预处理对新型冠状病毒的抑制效应。
(4)免疫荧光检测与细胞病变观察
病毒的准备:Vero E6细胞采用含10%FBS的DMEM培养液(含1%青链霉素双抗)于5%CO2、37℃、饱和湿度的孵箱中培养待用。将Vero E6细胞接种于96孔细胞培养板,100μl/孔,细胞密度约为4×104个/mL,待细胞汇合度为90%左右时加入鼻/咽拭子样本进行病毒分离。将冻存于-80℃冰箱的鼻/咽拭子样本取出,置于4℃冰箱融化,然后取出置于冰上,加入等体积的DMEM培养液(含2μg/mL TPCK胰酶、1%青链霉素双抗和0.2%牛血清白蛋白),再置于37℃孵箱,1h后吸取鼻/咽拭子上清,加入接种有Vero E6细胞的96孔板,每孔50μL。将96孔板置于孵箱中,2h后吸除上清,用PBS轻轻洗孔3次,随后加入100μL含TPCK胰酶的无血清DMEM培养液,置于孵箱中继续培养。24h后每天观察细胞是否出现细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),待超过50%细胞出现CPE并从孔底面脱落时,吸取上清,避免碰触细胞残骸,然后高速离心,小心吸取10μL上清传代感染接种于24孔板中的Vero E6细胞,取20μL上清用qRT-PCR法检测SARS-CoV-2核酸,确定为SARS-CoV-2核酸阳性样本,病毒滴度1x108PFU/ml。
给药及观察:Vero E6细胞采用含10%FBS的DMEM培养液(含1%青链霉素双抗)于5%CO2、37℃、饱和湿度的孵箱中培养待用。将山莨菪碱加入培养的Vero E6细胞(100μl/孔,细胞密度约为4×104个/mL)中(96孔板),使山莨菪碱的终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml,每个药物浓度做6个复孔,孵育1小时后,将上述从COVID-19肺炎病人鼻/咽拭子中分离的病毒加入Vero E6细胞中(2μL/孔),继续孵育24小时。随后取出96孔板并将浸泡于甲醇中,置于-20℃冰箱30分钟,灭活病毒并固定细胞。然后利用细胞免疫荧光的方法检测SARS-CoV-2蛋白,利用康复期病人的血清作为一抗,Alexa标记的抗兔及抗人荧光IgG作为二抗,进行免疫荧光染色后利用全自动细胞成像及分析***(BioTekCytation 5 Imaging Reader,美国BioTek公司)进行观察、拍照,结果见图2-图3。
图2-图3结果显示,新冠病毒感染后,SARS-CoV-2蛋白的表达显著增加,而用不同浓度的山莨菪碱预处理后,发现SARS-CoV-2蛋白的表达被有效抑制,尤其是在100μg/ml、200μg/ml的山莨菪碱预处理后,SARS-CoV-2蛋白的表达被显著抑制,且其作用具有剂量依赖性。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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1.山莨菪碱在制备治疗新型冠状病毒药物中的应用。
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JINSONG SU: "Network Pharmacology Integrated Molecular Docking Reveals the Mechanism of Anisodamine Hydrobromide Injection against Novel Coronavirus Pneumonia", EVID BASED COMPLEMENT ALTERNAT MED . * |
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