CN111773234B - 淫羊藿次苷ⅱ在制备抗肠道病毒71型药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了中药制药技术领域中的中草药淫羊藿中的特异单体淫羊藿次苷Ⅱ在制备药物组合物中的应用，尤其是在制备防治肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)的药物组合物中的应用。通过体外EV71感染细胞模型实验进行研究，结果显示淫羊藿次苷Ⅱ能在基因和蛋白水平抑制EV71的复制。证明所述的淫羊藿次苷Ⅱ有明显的抗EV71的作用，可用于制备抗EV71的药物。

Description

淫羊藿次苷Ⅱ在制备抗肠道病毒71型药物中的应用
技术领域
本发明涉及中药制药技术领域，涉及中草药淫羊藿中的特异单体淫羊藿次苷Ⅱ在制备抗病毒药物中的应用，具体是在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
背景技术
手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的急性肠道传染病，好发于学龄前尤其是3岁以下儿童，其主要传播途径为消化道、呼吸道以及密切接触。肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是HFMD的主要病原体，是一种高度噬神经病毒，可引起严重的神经***损害。所以，从根源上治疗及预防刻不容缓。目前，临床上多用干扰素、利巴韦林和甲泼尼龙等进行联合给药治疗HFDM，但上述药物对EV71引起的重症HFMD效果差强人意，寻求新的、特异的抗EV71药物对HFMD的预防及治疗显得尤为重要。
中药淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)别名仙灵脾、千两金、放杖草等，为小檗科淫羊藿属植物，普遍分布于我国贵州、四川、辽宁、江西、陕西、湖南、湖北等地。淫羊藿最早记载见于《神农本草经》，具有极高的药用价值，其应用历史悠久，据记载，淫羊藿的主要功效有补肾壮阳、祛风除湿等。现代研究表明，淫羊藿在临床上可用于治疗***肿块、高血压等疾病，还有增强人体免疫功能、延缓衰老、防治神经性疾病等作用。
现有技术CN201580055424.0公开了一种含有朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分的抗病毒组合物，其包含朝鲜淫羊藿(Epimediumkoreanum)提取物作为活性成分。披露朝鲜淫羊藿提取物可以制备预防或者治疗手足口病等病毒性疾病。但是上述文件整个说明书中并无该病毒组合物能用于预防和治疗手足口病的相关证据，也没有具体指明是哪种病毒引起的手足口病，加之淫羊藿提取物中的活性成分未知，因此现有技术缺乏一种具体的从淫羊藿中提取的成分用以治疗EV71引起的疾病。
另外，淫羊藿次苷Ⅱ是从淫羊藿中提取的一种多羟基黄酮类单体成分，是淫羊藿的有效成分之一，文献报道其具有治疗***功能障碍、抗缺血性脑损伤、抗肿瘤等作用，但未见有关淫羊藿次苷Ⅱ抗EV71作用的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供淫羊藿次苷Ⅱ在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
本发明的目的之一是提供淫羊藿次苷II或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂作为活性成分在制备抗肠道病毒药物中的应用。
其中，所述的肠道病毒为肠道病毒71型。
所述肠道病毒71型感染所致的疾病包括手足口病、病毒性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎和中枢神经***感染。
本发明的目的之二是提供一种药物，淫羊藿次苷II为活性成分制备的防治肠道病毒感染的药物。
具体的，淫羊藿次苷II为活性成分制备的抗肠道病毒71型感染的药物。
本发明所述的淫羊藿次苷Ⅱ的分子式为：C27H30O10(可市购)。
本发明对上述分子式为C27H30O10的淫羊藿次苷Ⅱ进行了下述实验：
以EV71感染的RD(人恶性胚胎横纹肌瘤)细胞为研究模型，检测淫羊藿次苷Ⅱ对EV71感染后细胞病变效应(Cell cytopathic effect，CPE)的影响；对上清中病毒滴度的影响；对EV71 VP1 mRNA和VP1蛋白的影响。检测结果显示，淫羊藿次苷Ⅱ能够抑制EV71引起的CPE，降低病毒滴度，抑制EV71 VP1 mRNA的转录水平，抑制VP1蛋白的表达。
实验结果证明，淫羊藿次苷Ⅱ具有明显的抗EV71作用，可用于制备抗EV71感染的药物。
附图说明
图1是用CCK8法检测淫羊藿次苷Ⅱ对RD细胞生长的影响示意图；
图2是在光镜下观察淫羊藿次苷Ⅱ对EV71引起CPE的影响示意图；
图3是用Reed-Muench公式计算淫羊藿次苷Ⅱ作用于EV71感染的RD细胞后，病毒滴度的变化示意图；
图4是用荧光定量PCR法检测淫羊藿次苷Ⅱ作用于EV71感染的RD细胞后，对EV71VP1 mRNA转录水平的影响示意图；
图5是用Western Blot法检测淫羊藿次苷Ⅱ作用于EV71感染的RD细胞后，对EV71VP1蛋白的影响示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
1、CCK8筛选淫羊藿次苷Ⅱ作用RD细胞最大无毒浓度
取处于对数生长期的RD细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于96孔板中，1×104个/孔，待细胞长满单层，弃去培养液，将不同浓度的淫羊藿次苷Ⅱ(12.5μM、25μM、50μM、100μM和200μM)加入96孔板中，每个稀释度接种5个孔为实验组，设5个孔只加培养基、细胞为实验对照组，另设5孔只加培养基作空白对照，每孔0.1mL。置于37℃，5％CO2培养箱中培养，分别于培养24h、48h后采用CCK8法测定OD值，计算细胞存活率。
Figure BDA0002632266450000031
如图1所示，本发明用CCK8分析的方法检测药物对细胞生长的影响，采用本领域实验公认的细胞模型RD，选用的淫羊藿次苷Ⅱ浓度分别为12.5μM、25μM、50μM、100μM和200μM，实验数据进行单因素方差分析，结果显示浓度大于50μM的淫羊藿次苷Ⅱ对RD细胞的生长有明显的影响(p<0.05)。
2、光镜下观察淫羊藿次苷Ⅱ对EV71引起CPE的影响
取处于对数生长期的RD细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于6孔板中，5×105个/孔，待细胞长满单层，弃去培养液，PBS清洗2～3次，以MOI＝0.1的EV71感染RD细胞，2h后，吸出病毒液，替换为完全培养基配置的含不同浓度淫羊藿次苷Ⅱ的培养基，同时设淫羊藿次苷Ⅱ单独给药组，EV71感染组，阴性培养基对照组。24h后在光学显微镜下观察CPE。如图2所示，CPE是病毒在宿主细胞中复制后导致细胞内发生一系列变化，如：开始时，细胞核发生变化，染色质着边，核浓缩，随后细胞膜发生变化，失去黏附作用，细胞变圆，从培养瓶壁脱落，或细胞互相融合等。这些变化可通过显微镜检查。结果显示：和EV71感染组相比，淫羊藿次苷Ⅱ浓度为12.5μM、25μM和50μM时能有效抑制EV71引起的CPE。
3、淫羊藿次苷Ⅱ对EV71病毒滴度的影响
种板，接毒以及加药方式同2，加药24h后，收集细胞上清，4℃,12000rpm,离心10min，再次收集细胞上清，备用。
取对数生长期的Vero细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，按照1×104个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞长满单层，弃去培养液，用PBS清洗两遍，将收集的上清病毒液用DMEM/F-12培养基依次10倍稀释(10-1～10-10)，每个稀释度接种8个孔，另设8孔作空白对照，只加无血清的DMEM/F-12培养基，每孔0.1mL。置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每日观察并记录CPE情况，连续72h，用Reed-Muench公式计算病毒液的50％细胞感染剂量(50％tissue culture infective dose，TCID50)。
Figure BDA0002632266450000041
如图3所示，和病毒感染组相比淫羊藿次苷Ⅱ25μM和50μM能降低细胞上清中由EV71感染引起的滴度。结果显示，和病毒感染组相比淫羊藿次苷Ⅱ25μM和50μM能降低细胞上清中由EV71感染引起的滴度。
4、淫羊藿次苷Ⅱ对VP1基因转录水平的影响
种板，接毒以及加药方式同2，加药24h后，收集细胞提取总RNA,流程如下：①取出6孔板，置于冰上，PBS清洗2次，加入1mL Trizol裂解5-10min，转移裂解液至EP管中；②加入0.2mL氯仿，涡旋震荡仪震荡30s，室温静置15min。12000rpm，4℃离心15min；③取上层无色水相置于新EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min,12000rpm，4℃离心10min；④弃上清，取1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，上下颠倒洗涤，12000rpm，4℃离心8min；⑤弃上清，待沉淀RNA残留的乙醇挥发后，取30μL RNase-free water溶解RNA沉淀，冻于-80℃冰箱。
根据所得RNA浓度值，定量为1μg，计算所需RNA样本的量。将提取的RNA在20μL体系中进行反转录为cDNA，反应程序为：37℃，15min；85℃，5sec，4℃保存，反应体系如下：
表1实时荧光定量PCR反转录体系
Figure BDA0002632266450000042
Figure BDA0002632266450000051
表2实时荧光定量PCR引物序列
Figure BDA0002632266450000052
将获得的cDNA为模板，每个样品三个重复，以β-actin为内参，在荧光定量PCR仪中进行扩增，反应程序为：95℃，30s；(95℃，3s→60℃，30s)×40次循环，溶解曲线仪器默认，反应体系如表：
表3实时荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002632266450000053
实验重复三次，利用Graphpad prism5软件进行数据分析作图，用β-actin做内参、2-△△Ct计算结果，计算各组之间的相对水平。
如图4所示，淫羊藿次苷Ⅱ50μM能有效降低EV71 VP1 mRNA的转录水平。
5、淫羊藿次苷Ⅱ对VP1蛋白表达的影响
种板，接毒以及加药方式同2，加药24h后，收集细胞提取总蛋白,流程如下：用RIPA裂解液提取细胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。10％SDS-PAGE上电泳分离，上样量为40μg，然后转印至PVDF膜上；5％BSA室温封闭2h，一抗VP1、β-actin 4℃孵育过夜，TBST6min×5次；相应二抗室温孵育2h，TBST 6min×5次；用ELC超敏发光液A、B按1：1比例混合发光，用ChemiDocTM Touch Imaging System仪器进行曝光。如图5所示，淫羊藿次苷Ⅱ50μM能有效降低EV71 VP1 mRNA的转录水平。同时，通过Western blot检测EV71 VP1蛋白的表达，结果显示淫羊藿次苷Ⅱ能有效抑制EV71 VP1蛋白的表达，并具有浓度依赖性。
综合以上实验结果得出淫羊藿次苷Ⅱ有明显的EV71作用，可用于制备防治由EV71引起的手足口病、病毒性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎和中枢神经***感染的药物。

Claims (2)

1.淫羊藿次苷II或其药学上可接受的盐作为活性成分在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。
2.淫羊藿次苷II或其药学上可接受的盐作为活性成分在制备防治由肠道病毒71型引起的手足口病、病毒性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿和中枢神经***感染的药物中的应用。
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