CN107982252B - 中药组合物在乙型脑炎中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及银杏内酯组合物在制备治疗乙型脑炎药物中的应用。本发明的体外实验表明了银杏内酯组合物能够抑制JEV感染的BHK‑21细胞病变。并且，组合物给药后能够明显改善乳鼠神经行为学症状，感染区体积以及含水量均有不同程度的降低。此外，银杏内酯组合物还能剂量依赖性地降低脑组织TNF‑α和IL‑2的表达。因此，本发明证实了银杏内酯组合物具有治疗/预防乙型脑炎的作用。
Description
技术领域
本发明属于涉及医药技术领域，特别是涉及银杏内酯组合物在预防/治疗乙型脑炎中的应用。
背景技术
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是乙型脑炎的病原体，1870年首次在日本发现，又称日本脑炎病毒。乙脑是人畜共患的自然疫源性疾病,为太平洋国家主要的病毒性脑炎。三代喙库蚊是主要的传播媒介。当免疫力较弱时，病毒可破坏血脑屏障并侵入中枢神经***，表现为高热、抽搐、惊厥、意识障碍及呼吸衰竭等症状。全球每年约3～5万人感染，死亡1～1.5万人，约5％～20％的重症患者有神经***后遗症。根据***报道，2015年我国共有819例确诊乙型脑炎患者，死亡24例。
BHK-21细胞是一种地鼠肾细胞，广泛用于增殖各种病毒及生产兽用疫苗的克隆细胞株。通过乙脑病毒感染BHK-21细胞可诱导BHK-21细胞病变，导致细胞活力降低和凋亡细胞比例增加，表明JEV感染能够诱导细胞发生凋亡。。经JEV感染的BHK-21细胞诱导细胞凋亡过程中会导致JNK信号通路被激活。JNK会发挥激活前凋亡Bim蛋白、阻遏Bcl-2等一系列作用抑制。在JNK磷酸化激活后，Bim转位到线粒体外膜上，促进细胞色素C的释放和细胞凋亡蛋白酶的激活。因此通过抑制JNK磷酸化通路能能有效阻止细胞凋亡。
白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)及可溶性白细胞介素-2受体(solubleinter-leukin-2receptor，sIL-2R)是促使T细胞增殖的关键性因子，是维持细胞免疫功能的重要细胞因子。
此外，有文献公开了患者急性期血清及脑脊液中的肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)和IL-2明显升高，恢复期炎症稳定后下降，且重型患者血和脑脊液中的TNF-α显著高于中型及轻型患儿，这表明TNF-α水平与疾病的严重程度相关，提示TNF-α能参与免疫病理损伤过程；并且，血清中当TNF-α＞50μg/L，则与致命性后果明显呈正相关，这表明TNF-α可以作为病情严重性的一项预测性指标。经JEV感染的乳鼠，病毒可通过血脑屏障进入脑内增殖,引起脑膜及脑组织发炎,造成神经元细胞变性坏死、毛细血管栓塞、淋巴细胞浸润，甚至出现局灶性坏死，脑组织软化及脑内含水量增加。
银杏叶提取物是目前国际上使用最为广泛的中药提取物之一，其中银杏内酯是银杏叶提取物及其制剂主要的药效活性成分，具有拮抗血小板活化聚集、降脂、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、保护神经***等广泛的药理作用。目前还未见银杏叶提取物能对乙型脑炎具有治疗或预防作用的相关报道。
发明内容
本发明通过体外细胞模型及体内动物模型验证的方式对银杏内酯组合物进行研究，旨在得到一种具有治疗或预防乙型脑炎的银杏内酯组合物。
由此，本发明提出了一种银杏内酯组合物在制备治疗和/或预防乙型脑炎药物中的应用。所述乙型脑炎的病原体包括乙脑病毒。
具体地，该银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其中，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～40)：(50～75):(0.2～5)。
进一步地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～35)：(50～70):(0.5～4)。更进一步地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～30)：(50～65):(0.8～4)。
具体地，上述乙型脑炎药物，银杏内酯组合物治疗静脉滴注有效量推荐为0.2-0.8mg/kg/d。需要注意的是，该治疗有效量作为推荐剂量并不对剂量范围产生严格限制。此外，本发明所述银杏内酯组合物可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗。
具体地，银杏内酯组合物可以使用各种药学上可接受的辅料制备成口服给药剂型、注射给药剂型、外用给药制剂。
进一步地，银杏内酯组合物可以制备成胶囊剂、片剂、粉针剂、透皮剂等等。
本发明通过乙脑病毒感染BHK-21细胞，3天后观察其细胞形态，给予银杏内酯组合物药物干预后发现银杏内酯组合物剂量依赖性抑制BHK-21细胞发生病变，病变细胞比例明显降低，同时抑制了乙脑病毒通过JNK通路引起的细胞凋亡。同时实验还证明了银杏内酯组合物给药后能够明显改善乳鼠神经行为学症状，且感染区体积以及含水量均有不同程度的降低。此外，银杏内酯组合物还能剂量依赖性降低脑组织TNF-α和IL-2的表达。因此，无论是乙脑病毒感染的BHK-21细胞模型和乙脑病毒感染的乳鼠乙脑的动物模型的药理实验均表明了银杏内酯组合物具有治疗乙型脑炎的作用。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式的内容仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
需要注意的是，如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用与本发明。
银杏内酯组合物抑制乙脑病毒感染的BHK-21细胞病变及对流行性乙型脑炎模型乳鼠行为学及细胞因子的影响
1、实验材料
1.1药物及试剂
原料银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯K(GK)以及银杏内酯组合物1-4由江苏康缘药业股份有限公司自制。
细胞实验给药浓度具体如下：
动物实验给药浓度如下：
BHK-21细胞购自美国菌种保存中心(ATCC)，乙脑病毒SA14-14-2株由中国农业科学院上海兽医研究所人畜共患病公共卫生实验室提供。细胞培养所需试剂均购自Invitrogen公司；P-JNK抗体、JNK、β-actin、HRP标记的羊抗兔的二抗抗体均购自Cellsignalingtechnology公司；TNF-α和IL-2酶联免疫吸附测定试剂盒购于美国R&D公司。利巴韦林注射液购于上海现代哈森(商丘)药业有限公司(国药准字：H20123033)；全蛋白提取试剂盒和蛋白测定试剂盒(BCA法)购自Thermo公司，其余试剂均购自于Sigma公司，未经特别提出纯度均为分析级。
实验动物选用SPF级2～3d龄昆明乳鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，常规条件饲养，适应环境1周后用于实验。
1.2主要耗材与仪器
CO2细胞培养箱及冰冻切片机购自美国Thermo公司；微孔板检测***FlexStation3购自美国MD公司；ChemiDocXRS***购自美国Bio-Rad公司；TDL-40B型离心机(上海安亨科学仪器厂)。
2、实验方法
2.1病毒株的制备及细胞培养和病毒感染活性测定实验
病毒株RNA的制备：用TRIZOL提取液提取乙脑病毒疫苗株RNA，参照TRIZOL说明书进行。提取的RNA用20μLDEPC处理水溶解，－70℃冻存。RNA转染细胞参照Qiagen公司的Lipofectine转染试剂盒说明书操作。以每孔5μgRNA将转录产物转染6孔板中的BHK-21单层细胞，同时设立一组作为阴性对照，不加任何试剂。37℃CO2孵箱培养，每日观察细胞病变。通过显微镜观察细胞明显病变后收集上清液，－70℃冻存保留病毒种。
细胞培养：细胞置于37℃，5％CO2，培养箱中培养，待细胞长到80％左右时，吸去陈旧培养基，用无菌PBS漂洗细胞2次，吸取漂洗液，加入0.25％胰酶消化至细胞全部从培养皿底部脱落，加入培养基形成细胞悬液，计数以每孔5万个细胞浓度铺于48孔板，待每个孔的细胞长成单层大约80％丰度即可用于下一步处理；其中39个孔接入乙脑病毒(400μl/25cm2)病毒液感染细胞，感染的39个孔中3个孔作为阴性对照(JEV组)，剩下36个感染孔分别给予银杏内酯组合物1,2,3,4的低中高浓度的药物(每个药物浓度3个复孔)，最终工作浓度分别为：12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL。其余孔模拟感染病毒细胞作为对照组，细胞处理72小时后，吸取培养液，小心用PBS漂洗2遍，后每孔加入100μlMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h，吸出MTT，加入200μlDMSO测定吸光值。
2.2Westernblot检测JNK信号通路蛋白水平的实验
BHK-21细胞铺于14个10cm2培养皿中，细胞密度为1×106/mL。待每组的细胞长至单层大约80％丰度后，除了一个设立空白以模拟感染病毒细胞作为对照(control)组(不注入病毒，但注射生理盐水)，剩下的每个培养皿接入乙脑病毒SA14-14-2株感染细胞，细胞感染2小时后，加入低、中、高三个剂量梯度的银杏内酯组合物，低、中、高三个剂量的最终工作浓度分别为：12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL。药物作用30min后，用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，应用BCA法测定样品蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳后，电转蛋白至PVDF膜，封闭，分别加入稀释的P-JNK、JNK和β-actin(1:1000，CST公司)等抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗兔二抗(1：3000，CST公司)溶液室温孵育2h后洗涤膜，ECL法显影，应用ChemiDocXRS***拍照，采用Gel-Proanalyzer4图像分析软件进行显影条带灰度值分析。
2.3动物分组及给药
SPF级2～3d龄昆明乳鼠随机分为假手术组(Control对照组)、模型组(JEV组)、银杏内酯组合物1、2、3、4低、中、高(1.75mg/Kg、3.5mg/Kg和7mg/Kg)剂量组、以及作为阳性对照的利巴韦林注射液组(5mg/Kg)，每组18只。采用尾静脉注射方式给药，从术前15d开始给药，每天1次，假手术组及模型组用等体积的生理盐水替代。
2.4模型制备及神经行为学评分
采用Longa改良法，建立乳鼠乙脑模型，方法简述如下。末次给药1h后，腹腔注射水合氯醛麻醉乳鼠，用皮下注射法注入乙脑病毒，以肉眼看到或者用手摸到直径至少1mm的实体结节为标准造模。假手术组不注射乙脑病毒，剩余操作步骤完全同上。Berderson(姿势反射测验)的4分制评分法评价银杏内酯组合物对各组乳鼠神经行为学的影响。
2.5脑组织感染体积比及含水量测定
再灌注24h后，各组随机选取乳鼠6只，以质量浓度25g/L水合氯醛0.3mL腹腔注射麻醉后，立即处死。将大脑组织完整取出，冰冻5min后，将脑组织均匀切成2mm厚度，迅速放入体积分数2％的TTC溶液中，室温下染色30min，再用体积分数10％的***溶液避光固定24h。拍摄照片，用图像分析***对照片进行分析，感染体积为每个层面的感染面积之和与厚度的乘积。各组另随机选取大鼠6只，处死后，采用干湿质量法测定脑组织含水量，计算公式如下：脑组织含水量(％)＝(1－脑组织干质量/脑组织湿质量)×100％
2.6脑组织生化指标检测
各组剩余大鼠6只，深度麻醉后迅速断头取脑；称质量后按1∶9的比例在冰浴上加入预冷的生理盐水，高速匀浆，离心后取上清分装于1.5mL离心管中，低温冰箱保存备用。采用ELISA法检测TNF-α和IL-2表达，详细操作步骤参照试剂盒说明书。
2.7数据处理
实验结果以Mean±SD.表示，所有数据用SPSS13.0软件进行分析。采用方差分析统计，p﹤0.05即表示有统计学差异。
3实验结果
3.1银杏内酯组合物抑制乙脑病毒感染的BHK-21细胞病变
应用MTT法测定银杏内酯组合物干预后的乙脑病毒感染的BHK-21细胞的细胞活力，结果显示，相比较control组，乙脑病毒感染的BHK-21细胞感染组(JEV)细胞活力极显著降低，同时给药组给予4种银杏内酯组合物干预后，各银杏内酯组合物均剂量依赖性的显著抑制乙脑病毒感染的BHK-21细胞病变(见表1)，表明了银杏内酯组合物能够对经乙脑病毒感染的细胞起到很好的保护作用。
表1银杏内酯组合物对JEV感染的BHK-21细胞病变的抑制
| 组别 | 给药剂量(μg/mL) | 相对细胞活力(％) |
| control组 | 0 | 100 |
| JEV | 0 | 48.00±2.1<sup>###</sup> |
| YXNZ-1-XB-低 | 12.5 | 58.75±2.8** |
| YXNZ-1-XB-中 | 25 | 65.83±1.7*** |
| YXNZ-1-XB-高 | 50 | 70.38±3.4*** |
| YXNZ-2-XB-低 | 12.5 | 58.01±2.4** |
| YXNZ-2-XB-中 | 25 | 65.14±3.2*** |
| YXNZ-2-XB-高 | 50 | 69.59±3.7*** |
| YXNZ-3-XB-低 | 12.5 | 58.70±2.9** |
| YXNZ-3-XB-中 | 25 | 63.45±3.2*** |
| YXNZ-3-XB-高 | 50 | 69.09±4.2*** |
| YXNZ-4-XB-低 | 12.5 | 56.73±2.4* |
| YXNZ-4-XB-中 | 25 | 59.08±2.7** |
| YXNZ-4-XB-高 | 50 | 66.22±3.4*** |
###p＜0.001vsControl组；*p＜0.05vsJEV组；**p＜0.01vsJEV组；***p＜0.001vsJEV组。
3.2银杏内酯组合物抑制JEV通过JNK信号通路诱导细胞凋亡
应用Westernblot检测银杏内酯组合物干预后JEV感染组和control组JNK总蛋白和磷酸化蛋白水平，结果显示，相比较control组，JEV组磷酸化JNK蛋白极显著增加，同时给药组给予4种银杏内酯组合物干预后，各银杏内酯组合物均剂量依赖性的显著降低磷酸化JNK蛋白的水平(见表2)。结果表明银杏内酯组合物可显著抑制乙脑病毒通过JNK信号通路诱导的细胞凋亡的过度磷酸化，抑制JNK蛋白的活性，治疗乙型脑炎。
表2银杏内酯组合物对JNK蛋白磷酸化的抑制
| 组别 | 给药剂量(μg/mL) | p-JNK/JNK相对灰度值 |
| control组 | 0 | 0.15±0.03 |
| JEV | 0 | 0.68±0.08<sup>###</sup> |
| YXNZ-1-XB-低 | 12.5 | 0.42±0.03** |
| YXNZ-1-XB-中 | 25 | 0.35±0.04*** |
| YXNZ-1-XB-高 | 50 | 0.32±0.03*** |
| YXNZ-2-XB-低 | 12.5 | 0.50±0.07* |
| YXNZ-2-XB-中 | 25 | 0.45±0.07** |
| YXNZ-2-XB-高 | 50 | 0.36±0.06*** |
| YXNZ-3-XB-低 | 12.5 | 0.52±0.03* |
| YXNZ-3-XB-中 | 25 | 0.48±0.05** |
| YXNZ-3-XB-高 | 50 | 0.40±0.10** |
| YXNZ-4-XB-低 | 12.5 | 0.55±0.05* |
| YXNZ-4-XB-中 | 25 | 0.49±0.02** |
| YXNZ-4-XB-高 | 50 | 0.42±0.09** |
###p＜0.001vsControl组；*p＜0.05vsJEV组；**p＜0.01vsJEV组；***p＜0.001vsJEV组
3.3各组乳鼠神经行为学评分影响比较
实验结果表明，假手术组(Control对照组)无神经功能缺陷症状，并且，JEV模型组、银杏内酯组合物组、利巴韦林注射液组也均有不同程度的神经功能缺陷，但与假手术组之间的差异具有统计学意义。与模型组比较，银杏内酯组合物各剂量组的神经行为学评分均显著降低，提示银杏内酯组合物具有改善乙脑感染引起的神经功能缺陷。结果见表3。
表3银杏内酯组合物对乳鼠神经行为学评分的影响
| 组别 | 给药剂量(mg/Kg/d) | 行为学评分(分) |
| Control组 | 0 | 0.±0 |
| JEV | 0 | 2.68±0.17<sup>###</sup> |
| YXNZ-1-DW-低 | 1.75 | 2.12±0.13* |
| YXNZ-1-DW-中 | 3.5 | 1.85±0.14** |
| YXNZ-1-DW-高 | 7 | 1.32±0.13*** |
| YXNZ-2-DW-低 | 1.75 | 2.15±0.15* |
| YXNZ-2-DW-中 | 3.5 | 1.88±0.29** |
| YXNZ-2-DW-高 | 7 | 1.42±0.19*** |
| YXNZ-3-DW-低 | 1.75 | 2.20±0.27* |
| YXNZ-3-DW-中 | 3.5 | 1.89±0.20** |
| YXNZ-3-DW-高 | 7 | 1.56±0.17*** |
| YXNZ-4-DW-低 | 1.75 | 2.22±0.24* |
| YXNZ-4-DW-中 | 3.5 | 2.05±0.17* |
| YXNZ-4-DW-高 | 7 | 1.86±0.20** |
| 利巴韦林注射液组 | 5 | 1.38±2.21*** |
###p＜0.001vsControl组；*p＜0.05vsJEV组；**p＜0.01vsJEV组；***p＜0.001vsJEV组
3.4各组乳鼠脑组织感染体积比及含水量比较
与假手术组比较，模型JEV组乳鼠脑组织感染体积比及含水量显著增加，提示造模成功；与模型组比较，银杏内酯组合物各剂量组感染体积比均明显下降，且具有剂量依赖性，其含水量也呈下降趋势。结果见表4。
表4银杏内酯组合物对乳鼠脑组织感染体积比和含水量的影响
###p＜0.001vsControl组；*p＜0.05vsJEV组；**p＜0.01vsJEV组；***p＜0.001vsJEV组
3.5各组乳鼠脑组织TNF-α和IL-2比较
实验结果表明，模型JEV组乳鼠脑组织TNF-α和IL-2的量明显高于假手术组(Control组)；银杏内酯组合物各剂量组均能降低乙脑模型乳鼠脑组织TNF-α和IL-2的含量，与模型组比较，差异具有统计学意义。结果见表5。
表5银杏内酯组合物对各组乳鼠脑组织TNF-α和IL-2的影响
| 组别 | 给药剂量(mg/Kg/d) | TNF-αng/L | IL-2ng/L |
| Control对照组 | 0 | 8.37±1.07 | 16.21±2.31 |
| JEV | 0 | 17.21±2.41<sup>###</sup> | 34.32±3.01<sup>###</sup> |
| YXNZ-1-DW-低 | 1.75 | 14.41±2.14* | 26.89±1.71* |
| YXNZ-1-DW-中 | 3.5 | 12.40±1.22** | 24.12±3.21** |
| YXNZ-1-DW-高 | 7 | 11.15±1.47*** | 20.64±1.78*** |
| YXNZ-2-DW-低 | 1.75 | 14.34±1.65* | 27.89±2.45* |
| YXNZ-2-DW-中 | 3.5 | 12.42±1.45** | 24.20±2.87** |
| YXNZ-2-DW-高 | 7 | 11.23±0.98*** | 21.21±3.81*** |
| YXNZ-3-DW-低 | 1.75 | 14.44±1.20* | 28.22±4.45* |
| YXNZ-3-DW-中 | 3.5 | 12.57±1.34** | 24.47±1.78** |
| YXNZ-3-DW-高 | 7 | 11.32±2.04*** | 22.44±3.21*** |
| YXNZ-4-DW-低 | 1.75 | 14.89±1.42* | 28.95±2.41* |
| YXNZ-4-DW-中 | 3.5 | 13.21±1.44* | 26.32±3.01* |
| YXNZ-4-DW-高 | 7 | 12.54±1.48** | 24.05±2.45** |
| 利巴韦林注射液组 | 5 | 10.42±2.01*** | 19.23±3.07*** |
###p＜0.001vsControl组；*p＜0.05vsJEV组；**p＜0.01vsJEV组；***p＜0.001vsJEV组
综上所述，本发明通过实验证实了银杏内酯组合物能剂量依赖性抑制BHK-21细胞发生病变，且能明显改善乳鼠神经行为学症状，给药组的感染区体积比及含水量相对于模型组也均有不同程度的降低，此外，银杏内酯组合物还能剂量依赖性降低脑组织TNF-α和IL-2的表达。细胞及动物实验结果均显示出本发明的银杏内酯组合物均对乙型脑炎的良好的效果。
本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种银杏内酯组合物在制备治疗乙型脑炎药物中的应用，其特征在于，所述银杏内酯组合物中，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40)：(50～75):(0.2～5)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述银杏内酯组合物中，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～35)：(50～70):(0.5～4)。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述银杏内酯组合物中，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30)：(50～65):(0.8～4)。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述治疗乙型脑炎药物由银杏内酯组合物和各种药学上可接受的辅料组成。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述治疗乙型脑炎药物选自口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口服给药剂型的剂量为0.2-0.8mg/kg/d。
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-
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 柴石退热颗粒对流行性乙型脑炎模型乳鼠行为学及细胞因子的影响;刘志勇等;《中医学报》;20160901;第31卷(第220期);第1345-1348页 * |
| 神经生长因子对乙型脑炎病毒感染BHK-21细胞的抑制作用;杨栋等;《中国生物制品学杂志》;20130630;第26卷(第6期);第840-843页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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