CN115089612B - 脐带间充质干细胞在预防病毒感染所致肺部疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了脐带间充质干细胞在预防流感病毒感染所致肺部疾病中的应用。脐带间充质干细胞在制备预防流感病毒感染或冠状病毒感染的药物中的应用。脐带间充质干细胞在制备预防病毒性肺部疾病的药物中的应用。本发明将脐带间充质干细胞应用于病毒感染前的预防性给药，发现脐带间充质干细胞在控制病毒的传播和预防病毒感染意义重大，尤其适用于对医护人员等易感人群提供一种有效、安全的预防病毒性肺炎的新途径。

Description

脐带间充质干细胞在预防病毒感染所致肺部疾病中的应用
技术领域
本发明涉及病毒性重症肺炎预防药物领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞在预防病毒感染所致肺部疾病中的应用。
背景技术
病毒性肺炎是由上呼吸道感染、向下蔓延所致的肺部炎症。单纯孢疹病毒、水痘-带状孢疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒等，都可引起严重的肺部疾病。这些肺炎病毒通常都具有一定的传染性，容易发生变异，人群普遍易感，发病率高，历史上在全世界引起多次病毒性肺炎暴发性流行，是全球关注的重要公共卫生问题。
人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的，甲型流感病毒经常发生抗原变异，已经证实感染人的流感病毒亚型为H7N9、H5N1、H9N2、H3N2、H1N1等。流感病毒、冠状病毒等感染机体后，迅速在呼吸道进行复制，继而导致机体过度免疫应答，损伤肺泡上皮及毛细血管内皮细胞，出现类似急性肺损伤的临床表现。
流感病毒、冠状病毒等可以在人体的细胞内自由穿梭，人类的肺脏、肝脏、肾脏、大脑、免疫***、******、生殖***，统统都是它们的攻击目标。新冠病毒可以在人体内无症状潜伏14天甚至更长时间，目的就是要在神不知鬼不觉之中，最大程度地传染给它能接触到的人。之前治疗新冠患者呼声最高的是抗艾滋病药 (克立芝) ，但随后的双盲实验证明它是无效的。氯喹的前景更不乐观。很多风湿性关节炎和红斑狼疮病人长期服用氯喹，但并没有报告说这类病人就不容易得新冠或者变成重症。甚至有些医院给所有病人都用上氯喹，并没有减少转成重症的作用。
人类在与病毒对抗的斗争中，一种被动的但可以最广泛使用的手段，就是生产出对付病毒的特定疫苗。在接种疫苗后2～3周,通常可以获得免疫力,当机体接触到疫苗所针对的病毒时就可以启动保护性免疫反应。疫苗分为灭活疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗等，由于保留了病毒刺激机体免疫***的特性，在注射人体后引起免疫反应，产生记忆T细胞和记忆B细胞，当病毒侵入人体时这两种细胞会迅速增殖分化成效应T细胞和效应B细胞，效应T细胞与靶细胞结合使其裂解死亡，效应B细胞产生抗体与抗原结合迅速清除抗原。
新冠病毒是一个单链的RNA冠状病毒，极不稳定，非常容易出现变异，仅仅是在2020年2月12日之前，病毒的进化树上最少就已经有了5个单倍型，这个特性在其他病毒上也有体现。科学家原本以为新冠病毒主要是通过血管紧张素转化酶(ACE-2)来建立对人体的攻击路径，但是其后病毒出现变异，又发展出三条新的攻击路径FURIN、GRP78和 CD 147。
由于病毒变异性强,对某些病毒有效的疫苗在遇到病毒的其他突变株时往往无效,因此疫苗的预防控制效果将大大降低。对于全球性新冠肺炎，批准上市的辉瑞mRNA重组疫苗在第二次接种后7天内预防感染的疗效可达95％，但是根据2021年6月4日发表在国际顶级医学期刊《柳叶刀》上的一项迄今为止关于辉瑞/BioNtech疫苗最大规模的研究，接种辉瑞新冠疫苗后，人们对最初首次在印度和南非检测到的变异毒株产生保护性抗体大打折扣，而且随着时间，抗体水平逐渐下降。79％的人对原始毒株表现出可检测到的抗体反应，但对于Alpha变异毒株(英国首次发现的)，这一比例下降到50％；而对于Delta变异毒株(印度首次发现的)和Beta变异毒株(南非首次发现的)，分别下降到32％和25％[1]。
灭活疫苗相比重组疫苗具有更好的抗病毒变异性，但是注射疫苗后人体内的抗体滴度也会随着时间的推移逐渐降低，需要定期注射，并且通常一剂次疫苗注射不能达到预期保护效力，需要进行二剂次甚至三剂次的注射。同时，疫苗的研制周期最少需要几个月甚至一年的时间，这个速度远远小于病毒的变异速度，这也就是说，如果在没有中医药等有效药物介入的情况下，人类实际上就是在骑着自行车追赶病毒的高速列车。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有多向分化潜能的间叶组织来源干细胞，可从脐带、骨髓、脂肪等多种组织获得，是一群多潜能细胞，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化。虽然目前 MSCs在治疗流感病毒所致的肺损伤的报道屡见不鲜，但涉及 MSCs 给药方式、给药剂量、给药时间以及给药次数等尚无统一标准，需更多临床研究来探索最佳的 MSCs 给药方案。针对MSCs在治疗流感病毒感染中的作用，现有的研究结果集中于病毒感染后的抗病毒治疗作用,不涉及病毒感染前的预防作用[2, 3]。
人脐带间充质干细胞（human umbilical cord- derived mesenchymal stemcells，hUC-MSCs）作为理想的MSCs来源越来越受到人们的重视，关于hUC-MSCs 的研究报导也日渐增长。近年来随着MSCs在呼吸***疾病中研究的增多，其修复损伤肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞、逆转肺病理改变的作用也得到证实。另有研究指出，CXCL10-CXCR3促进中性粒细胞介导的病毒性和非病毒性暴发性肺损伤的发生[4]。但这些都是基于对已有损伤的修复，MSCs是否能够在病毒感染前保护机体免受或少受病毒感染或减轻病毒对机体的破坏尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供脐带间充质干细胞在制备预防病毒的药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种脐带间充质干细胞在预防病毒性肺部疾病中的应用。流感病毒引起免疫功能失调会引发“细胞因子风暴”，从而导致以急性呼吸功能衰竭为主的多器官功能损害的重症肺炎。本发明评价了异体人源脐带间充质干细胞预防H7N9、H5N1禽流感病毒、甲型H3N2和H1N1流感病毒引起的重症肺炎的疗效以及在体外条件下对新型冠状病毒SARS-CoV-2抑制作用，为预防病毒性重症肺炎提供一种新途径。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
现有的关于MSCs致瘤作用的报道多数以骨髓 MSCs 为研究对象，以脐带间充质干细胞(hUC-MSCs )为研究对象的报道较少。本发明将脐带间充质干细胞应用于病毒感染前的预防性给药，发现脐带间充质干细胞在控制病毒的传播和预防病毒感染意义重大，尤其适用于对医护人员等易感人群提供一种有效、安全的预防病毒性肺炎的新途径。
脐带间充质干细胞在制备预防流感病毒感染或冠状病毒感染的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的流感病毒选自人或动物流感病毒。
作为本发明的进一步优选，所述的流感病毒包括但不局限于甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒。
作为本发明的进一步优选，所述的流感病毒选自高致病性H7N9或H5N1亚型禽流感病毒。
作为本发明的进一步优选，所述的流感病毒选自甲型H3N2或H1N1流感病毒。
作为本发明的进一步优选，所述的冠状病毒选自新型冠状病毒SARS-CoV-2。
脐带间充质干细胞在制备预防病毒感染所致肺部疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的病毒感染所致肺部疾病主要是由人或动物流感病毒或冠状病毒感染引起的肺部疾病。
作为本发明的进一步优选，所述的流感病毒感染所致肺部疾病是由不局限于甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒所引起的肺部疾病。
作为本发明的进一步优选，所述的流感病毒感染所致肺部疾病包括由高致病性H7N9或H5N1亚型禽流感病毒所引起的肺部疾病。
作为本发明的进一步优选，所述的流感病毒感染所致肺部疾病包括由甲型H3N2或H1N1流感病毒所引起的肺部疾病。
作为本发明的进一步优选，所述的冠状病毒感染所致肺部疾病包括由新型冠状病毒SARS-CoV-2所引起的肺部疾病。
作为本发明的更进一步优选，所述的肺部疾病为重症肺炎。
与现有技术比较，本发明具有以下优势：
本发明的创新之处在于将hUC-MSCs用于病毒感染所致肺部疾病的预防性给药。预防性药物治疗临床应用广泛，比如血栓性疾病患者预防性服用抗凝药物，临床常见的反复发作的偏头痛患者服用预防性药物、外科手术中预防应用抗菌药物等。相比于注射疫苗需要14天左右甚至更长时间才能建立起免疫保护作用，将hUC-MSCs用于预防病毒性肺部疾病仅需要7天左右。当有新型毒株出现时，疫苗的研发会存在滞后现象，hUC-MSCs就能比疫苗更快地建立起防护效应。此外，疫苗仅能特异性免疫某一种特定病毒，对其变异株或其他毒株的免疫效果大大降低，hUC-MSCs对流感病毒和冠状病毒等均有一致的有效免疫效果，并且hUC-MSCs单次注射即可达到预期效果。因此，将hUC-MSCs应用于病毒感染所致肺部疾病的预防性给药能够为医护人员、一线工作者等提供快捷、高效的保护作用。
本发明选用临床致死率比SARS高的H7N9禽流感病毒、H5N2禽流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型，提前输注脐带间充质干细胞可显著延长小鼠的平均生存期，提高小鼠的存活率，具有很高的死亡保护率。其中，在1.2×106个干细胞/只剂量下，干细胞提前预防7天的效果最显著。同时，新型冠状病毒SARS-CoV-2体外抑制实验证明提前24h将脐带间充质干细胞与PBMC共孵育，再接种新冠病毒可以显著抑制新型冠状病毒的复制，抑制率可达90%；干细胞和PBMC比例为1:10时对病毒的抑制效果显著优于1:5时的抑制效果。
与疫苗对病毒防御的机制不同的是，我们的机制研究指出hUC-MSCs通过减少中性粒细胞在感染后小鼠肺部的募集和降低CXCR3受体的表达，从而达到减轻病毒性肺炎的目的。且将hUC-MSCs应用于流感病毒感染所致肺部疾病的预防性给药是安全的。因此，通过将脐带间充质干细胞制剂纳入到现有预防方案中对病毒性重症肺炎进行预防，有望为医护人员等易感人群提供一种有效、安全、快捷的预防病毒性肺炎的新途径，并为预防类似病毒性感染疾病提供理论依据与数据支持。
附图说明
图1是本发明中脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠生存保护效率预试验结果示意图。
Control表示空白对照，Model表示H7N9病毒感染组，MSC15、7、MSC5分别表示表示脐带间充质干细胞预防治疗15天、7天、5天；下同。
图2是脐带间充质干细胞对小鼠感染H7N9流感病毒后体重增长的影响示意图。
图3是脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠肺水肿的影响示意图。
图4是脐带间充质干细胞对小鼠血清抗体滴度的影响示意图。
图5是脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠肺病理组织结构的影响示意图。
图6是脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠细胞因子TNF-α的影响示意图。
图7是脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠细胞因子GM-CSF的影响示意图。
图8是脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠细胞因子IFN-γ的影响示意图。
图9是脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-9、IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-23、IL-22 的影响示意图。
图10是脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠细胞因子IP-10的影响示意图。
图11是脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠细胞因子MIP-1α、MIP-2的影响示意图。
图12是病毒感染后细胞因子风暴发生过程示意图。
图13是COVID-19患者细胞因子风暴信号通路示意图。
图14是脐带间充质干细胞对新型冠状病毒体外抑制实验结果。
图15是脐带间充质干细胞提前预防病毒性肺炎机制研究结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
以下实施例以H7N9禽流感、H5N1禽流感、H3N2甲型流感、H1N1甲型流感和新型冠状病毒体外抑制实验为例说明本发明的有效性，但并不以此限制本发明的保护范围。
实施例1 一种脐带间充质干细胞制备方法
以下实施例中的间充质干细胞制剂为人脐带间充质干细胞制剂，通过采集人脐带制备而成。采集人脐带并置于培养皿中，然后通过生理盐水对脐带组织进行清洗，清洗完成后剥离华通氏胶于离心管中。
加入适量完全培养液，将华通氏胶剪成小组织块并种植于培养皿中培养。
去除培养皿中的培养液，然后通过生理盐水清洗后加入胰酶进行消化，直至培养皿中细胞消化完成后加入终止液终止消化，将细胞悬液转移至离心管中离心并弃上层清液，再用适量培养液重悬细胞并计数，最后根据计数结果将细胞悬液种植于新培养皿进行培养。
去除新培养皿中的培养液，然后通过生理盐水清洗后加入胰酶进行消化，直至培养皿中细胞消化完成后加入终止液终止消化，再用细胞筛过滤并将过滤后的细胞悬液转移至离心管中计数离心弃上层清液，再配置细胞制剂悬液并加入细胞制剂悬液重悬细胞，最后将细胞悬液转移至转移袋中并放入低温环境中待取，从而完成间充质干细胞制剂的制备。
对制备的间充质干细胞制剂进行合格检测。
以下实施例中，所述间充质干细胞制剂均在消毒后的超净台中进行，且制备过程中所需器具和耗材等均需要用75％乙醇消毒，在制备过程中还需要对培养皿中的采集物以及操作具体过程进行详细标注，并将生产有关信息记录于GMP车间台账中。
同时，还可以对干细胞进行冻存，若需要进行干细胞制剂制备之前需要对冻存的干细胞进行复苏，其中干细胞冻存和复苏操作均属于现有技术，此处不再一一赘述。
也可不按照本实施例方法制备脐带间充质干细胞，按照本领域已公开的其他方法制备的脐带间充质干细胞或者市售脐带间充质干细胞制剂也适用于本发明。
实施例2 H7N9禽流感病毒感染小鼠预防试验
本实施例采用实施例1得到的人脐带间充质干细胞进行。
试验方法
将体重14-15g雌性ICR小鼠随机分为5组，每组20只，适应性喂养5天，按下列方法进行动物分组：正常对照组；病毒感染对照组；干细胞提前预防15天组；干细胞提前预防7天组和干细胞提前预防5天组，每只小鼠经尾静脉注射接种1.2×106个干细胞。
小鼠适应性喂养5天后，在攻毒前第15天，干细胞提前预防15天组注射干细胞制剂；在攻毒前第7天，干细胞提前预防7天组注射干细胞制剂；在攻毒前第5天，干细胞提前预防5天组注射干细胞制剂。
攻毒当天，正常对照组小鼠用PBS滴鼻处理，病毒感染对照组和提前预防组均滴鼻感染7.9mg/kg剂量的H7N9流感病毒。
本实施例所述病毒滴鼻剂量为半数致死量LD50的5倍。
动物处理：试验结束后剖杀各组小鼠进行采样分析，小鼠最后一次给药后禁食12小时，采用水合氯醛麻醉后，称重，摘眼球采血收集，EDTA抗凝血，直接采用流式细胞分类仪进行T细胞分析，其余血样2500rpm离心收集血浆置-80℃冻存用于细胞因子检测；摘取肺脏称重，记录肺组织与体重比，同时将摘取肺右大叶置10%的***溶液中固定，按病理组织切片流程进行病理分析，其余组织冻存于-80℃冰箱用于病毒载量分析。
统计学方法：采用SPSS12.0进行数据统计分析，计量资料采用均数±标准差（X ±SD）表示，采用配对样本t检验单因素方差分析，P＜0.05具有统计学差异。
试验结果
小鼠感染H7N9流感病毒死亡保护效力结果
试验期间每天观察动物发病情况，称重，记录死亡数，共观察15d，按“死亡保护效率=（病毒对照组死亡数-给药组死亡数）/病毒对照组死亡数×100%”、“生命延长率=（给药组平均存活天数-病毒对照组平均存活天数）/病毒对照组平均存活×100%”计算死亡保护效率和生命延长率。
如图1所示，H7N9病毒感染组从攻毒后第8天开始出现死亡，在第9-11天出现死亡高峰，在整个观察期内有9只小鼠死亡，死亡率为90%。脐带间充质干细胞预防治疗15天、7天、5天对H7N9流感病毒感染的死亡保护效率分别为55.6%、66.7%、44.4%，与病毒感染对照组之间存在统计学差异（*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p＜0.001） 。此外，脐带间充质干细胞提前预防还可有效延长小鼠感染H7N9流感病毒后的生存时间，脐带血干细胞提前预防15天、7天、5天的平均生存期分别为13.2±2.3天、13.7±2.1天和12.3±2.9天，其生命延长率分别为51.4%、64.9%、27.0%，病毒感染对照组存在显著差异（p<0.01或p<0.05）。
综合上述观察指标，脐带间充质干细胞提前预防可显著延长小鼠的平均生存期，提高小鼠的存活率，干细胞提前预防7天的效果最显著。
小鼠体重增长情况
如图2所示，H7N9感染流感病毒3天后各组小鼠体重增长受到影响，开始逐渐下降，其中脐带间充质干细胞提前预防各组体重下降幅度明显轻于病毒感染对照组。同时，相比于其他各组，脐带间充质干细胞提前预防7天组小鼠体重下降幅度最轻，且康复期体重恢复最快。
以上结果表明脐带间充质干细胞提前预防7天对H7N9流感病毒感染引起的小鼠体重下降有明显改善作用。
以上所述康复期是指病毒感染后小鼠体内病毒消除至完全康复的时期。
肺脏器相关指标检测
各组小鼠处死后，取全肺，生理盐水清洗血污，观察脏器大体形态。称重，按照“肺指数=小鼠肺重/小鼠体重×100%”、“湿干比=小鼠肺湿重/小鼠肺干重×100%”计算肺指数和肺湿干比。
表1和图3表明H7N9流感病毒感染后第5天和第6天，与正常对照组相比，病毒感染对照组小鼠肺指数显著升高，与正常对照组均存在显著性差异（p<0.05），且肺湿干比显著降低（p<0.05），提示小鼠肺水肿增加；与病毒感染对照组相比，间充质干细胞提前预防均能有效降低小鼠肺指数和肺湿干比，其中提前预防7天和5天的效果最为显著，存在显著性差异（p<0.01或p<0.05），表明间充质干细胞提前预防可改善小鼠肺水肿程度。
表1.脐带间充质干细胞对H7N9感染小鼠肺水肿的影响
组别 湿干比（%） 第5天肺指数 第6天肺指数 肺指数抑制率
正常对照组 4.42±0.41 0.83±0.08 0.69±0.16 --
病毒感染对照组 5.60±0.26 1.34±0.097 2.12±0.83 --
MSC-15 5.20±0.21 1.21±0.17 1.75±0.73<sup>*</sup> 25.9<sup>*</sup>
MSC-7 4.99±0.42<sup>*</sup> 1.22±0.15 1.43±0.39<sup>**</sup> 48.5<sup>**</sup>
MSC-5 4.99±0.17<sup>*</sup> 1.12±0.17 1.36±0.39<sup>**</sup> 53.1<sup>**</sup>
血凝抑制法检测小鼠体内抗体滴度
小鼠禁食12h后，水合氯醛麻醉后，摘眼球取全血于加有EDTA的抗凝管中，2500rpm离心10min，去上清。取血清样本25μL，加入到96孔第一列孔中，然后用PBS做2倍对比稀释至10孔，每孔加入25μL的4单位的H7N9灭活病毒，室温作用45min，再加入25μL的1%的红细胞室温作用45min，最后根据血清样品抑制病毒血凝效果的孔判定血清抗体的水平。
图4所示，病毒感染后15天各组小鼠的抗体显著异常升高，其中模型组小鼠的抗体升高最为显著，表明小鼠成功感染。与病毒感染对照组相比，脐带间充质干细胞提前预防15天、7天和5天组小鼠抗体平均低约2-3个滴度，其中提前预防7天的抗体滴度最低，提示脐带间充质干细胞提前预防可能与其及早的清除了病毒从而导致抗原减少，抗体滴度低有关。
小鼠肺组织病理变化
解剖小鼠后摘取肺脏称重，记录肺组织与体重比，同时将摘取小鼠肺右大叶置10%的***溶液中固定，按病理组织切片流程进行病理分析。
如图5所示，肺组织H&E染色显示正常对照组小鼠肺泡组织结构完整，细支气管及小血管壁周围无明显炎症细胞浸润，细支气管黏膜完整，肺泡中隔未见血管扩张，充血与炎症细胞浸润。与正常对照组相比，H7N9流感病毒感染组小鼠肺组织病理变化明显，可见弥漫性肺泡壁增厚，肺间质内血管扩张，大量炎症细胞浸润; 细支气管与小血管壁周围组织可见大量单核细胞、淋巴细胞浸润，细支气管黏膜脱落坏死。与病毒感染对照组相比，干细胞提前预防可有效改善肺部炎症的效应，其中提前预防7天的效果最为显著，该组小鼠肺部结构基本完整，肺部炎症较轻，肺细支气管及小血管壁周围仅有少量单核细胞、淋巴细胞浸润。
以上结果表明，间充质干细胞提前预防7天和5天组相比于病毒感染对照组，小鼠肺病变的程度显著减轻。
液相芯片检测小鼠血清细胞因子
小鼠解剖前麻醉后摘眼球取血，收集EDTA抗凝血，2500rpm离心收集血浆，用Luminex液相芯片检测相关细胞因子的表达量。
图6-11表明病毒感染后15天各组小鼠细胞因子TNF-α、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-23、IP-10、MIP-1α、MIP-2显著升高，其中病毒感染对照组小鼠的细胞因子升高最为显著。与病毒感染对照组相比，脐带间充质干细胞提前预防15天、7天和5天组小鼠上述细胞因子水平均下降，其中脐带间充质干细胞提前预防15天的TNF-α与病毒感染对照组相比存在显著性差异（p<0.05）。
如图12-13所示，细胞因子的大量释放会引起细胞因子风暴，是急性肺损伤发生的重要原因。临床观察显示，2019-新型冠病毒感染重症患者出现了TNF-α、IFN-γ等促炎性细胞因子显著升高的现象，具有细胞因子风暴的特征。
间充质干细胞提前预防降低了H7N9感染小鼠的多种细胞因子分泌，提示可降低急性肺损伤发生的可能。
实施例3 H5N1禽流感病毒感染小鼠预防试验
本实施例采用实施例1得到的人脐带间充质干细胞进行。
将体重14-15g雌性ICR小鼠随机分为5组，每组10只，适应性喂养5天，按下列方法进行动物分组：正常对照组；病毒感染对照组；干细胞提前预防15天组；干细胞提前预防7天组和干细胞提前预防5天组，每只小鼠经尾静脉注射接种1.2×106个干细胞。
小鼠适应性喂养5天后，在攻毒前第15天，干细胞提前预防15天组注射干细胞制剂；在攻毒前第7天，干细胞提前预防7天组注射干细胞制剂；在攻毒前第5天，干细胞提前预防5天组注射干细胞制剂。
攻毒当天，正常对照组小鼠用PBS滴鼻处理，病毒感染对照组和提前预防组均滴鼻感染7.9mg/kg剂量的H5N1禽流感病毒。
记录小鼠死亡情况，按“死亡保护效率=（病毒对照组死亡数-给药组死亡数）/病毒对照组死亡数×100%”计算每组小鼠的死亡保护效率。
结果显示，H5N1病毒感染组从攻毒后第6天开始出现死亡，在第7-9天出现死亡高峰，在整个观察期内有10只小鼠死亡，死亡率为100%。脐带间充质干细胞提前预防15天、7天、5天对H5N1流感病毒感染的死亡保护效率分别为30.0%、50.0%、40.0%。
表2.脐带间充质干细胞对H5N1感染小鼠死亡率的影响
组别 总数（只） 死亡数（只） 死亡率 死亡保护效率
正常对照组 10 0 0 ——
病毒感染对照组 10 10 100% ——
MSC-15 10 7 70% 30.0%
MSC-7 10 5 50% 50.0%
MSC-5 10 6 60% 40.0%
实施例4 甲型H3N2流感病毒感染小鼠预防试验
本实施例采用实施例1得到的人脐带间充质干细胞进行。
将体重14-15g雌性ICR小鼠随机分为5组，每组7只，适应性喂养5天，按下列方法进行动物分组：正常对照组；病毒感染对照组；干细胞提前预防15天组；干细胞提前预防7天组和干细胞提前预防5天组，每只小鼠经尾静脉注射接种1.2×106个干细胞。
小鼠适应性喂养5天后，在攻毒前第15天，干细胞提前预防15天组注射干细胞制剂；在攻毒前第7天，干细胞提前预防7天组注射干细胞制剂；在攻毒前第5天，干细胞提前预防5天组注射干细胞制剂。
攻毒当天，正常对照组小鼠用PBS滴鼻处理，病毒感染对照组和提前预防组均滴鼻感染7.9mg/kg剂量的甲型H3N2流感病毒。
记录小鼠死亡情况，按“死亡保护效率=（病毒对照组死亡数-给药组死亡数）/病毒对照组死亡数×100%”计算每组小鼠的死亡保护效率。
结果显示，H3N2病毒感染组从攻毒后第7天开始出现死亡，在第8-9天出现死亡高峰，在整个观察期内有6只小鼠死亡，死亡率为86%。脐带间充质干细胞提前预防15天、7天、5天对H3N2流感病毒感染的死亡保护效率分别为33.3%、66.7%、50.0%。
表3.脐带间充质干细胞对H3N2感染小鼠死亡率的影响
组别 总数（只） 死亡数（只） 死亡率 死亡保护效率
正常对照组 7 0 0 ——
病毒感染对照组 7 6 86% ——
MSC-15 7 4 57% 33.3%
MSC-7 7 2 29% 66.7%
MSC-5 7 3 43% 50.0%
实施例5 H1N1甲型流感病毒感染小鼠预防试验
本实施例采用实施例1得到的人脐带间充质干细胞进行。
将体重14-15g雌性ICR小鼠随机分为5组，每组8只，适应性喂养5天，按下列方法进行动物分组：正常对照组；病毒感染对照组；干细胞提前预防15天组；干细胞提前预防7天组和干细胞提前预防5天组，每只小鼠经尾静脉注射接种1.2×106个干细胞。
小鼠适应性喂养5天后，在攻毒前第15天，干细胞提前预防15天组注射干细胞制剂；在攻毒前第7天，干细胞提前预防7天组注射干细胞制剂；在攻毒前第5天，干细胞提前预防5天组注射干细胞制剂。
攻毒当天，正常对照组小鼠用PBS滴鼻处理，病毒感染对照组和提前预防组均滴鼻感染7.9mg/kg剂量的H1N1流感病毒。
记录小鼠死亡情况，按“死亡保护效率=（病毒对照组死亡数-给药组死亡数）/病毒对照组死亡数×100%”计算每组小鼠的死亡保护效率。
结果显示，H1N1病毒感染组从攻毒后第7天开始出现死亡，在第8-9天出现死亡高峰，在整个观察期内有7只小鼠死亡，死亡率为88%。脐带间充质干细胞提前预防15天、7天、5天对H1N1流感病毒感染的死亡保护效率分别为42.9%、71.4%、57.1%。
表4.脐带间充质干细胞对H1N1感染小鼠死亡率的影响
组别 总数（只） 死亡数（只） 死亡率 死亡保护效率
正常对照组 8 0 0 ——
病毒感染对照组 8 7 88% ——
MSC-15 8 4 50% 42.9%
MSC-7 8 2 25% 71.4%
MSC-5 8 3 38% 57.1%
实施例6 新型冠状病毒（SARS-COV-2）体外抑制实验
本实施例采用实施例1得到的人脐带间充质干细胞进行。
本实施例所述阳性对照药为瑞德西韦，白色粉末，由江苏省疾病预防控制中心提供。
本实施例所述细胞为非洲绿猴肾（Vero-E6）细胞，由江苏省疾病预防控制中心提供。
本实施例所述新型冠状病毒（SARS-CoV-2）毒株为（BetaCoV/JS02/Human/2019）,在江苏省疾病预防控制中心P3实验室-80℃保存。
本实施例所述PBMC细胞为密度梯度离心法分离获得。
加入病毒的量为MOI＝0.05。
加入瑞德西韦的量为5uM。
干细胞对SARS-COV-2体外抑制作用
将Vero-E6细胞按照5×104个/孔接种于两块24孔板中。
细胞铺板：干细胞+PBMC（提前共孵育24h）组、干细胞组、PBMC组，干细胞浓度为1×105个/孔，PBMC浓度为1×106个/孔，干细胞和PBMC比例为1:10；另一块24孔板干细胞浓度为1 ×105个/孔，PBMC浓度为为5 ×105个/孔，干细胞和PBMC比例为1:5。
将两块24孔板置于37℃，5%CO2恒温培养箱培养18h后，干细胞+PBMC（提前共孵育6h）组每孔接种对应数量的干细胞和PBMC；继续培养6h后，除了细胞对照组外所有组均加入新型冠状病毒（MOI＝0.05），置于37℃，5％CO2孵箱中吸附1小时，吸附完成后弃去带有病毒的培养基，重新加入新的病毒生长液，阳性对照组加入含瑞德西韦（5μM）的病毒生长液；于37℃，5％CO2孵箱中培养72h，培养结束后吸取每一孔培养上清，56℃灭活30min，进行病毒核酸提取和基因检测。
表5.各实验组的细胞板分布
Figure 4391DEST_PATH_IMAGE001
统计处理方法：所有数据输入到EXCEL表中，ΔCt=Ct实验组－Ct Virus对照组，抑制率=（1－2－ΔCt）×100%，计算各组抑制率。实验数据以x ±s表示，采用GraphPad Prism 8.0软件包，进行单因素方差分析，P＜0.05具有显著性差异。
根据图14，提前24h将脐带间充质干细胞与PBMC共孵育，再接种新冠病毒可以显著抑制新型冠状病毒的复制（PBMC（E6）+Stem cells 24h组、PBMC（E5）+stem cells 24h 组与virus control组相比，P＜0.001），干细胞和PBMC比例为1:10时抑制率达90%；脐带间充质干细胞和PBMC共培养条件下（提前孵育）比二者单独作用可以更加有效地抑制新型冠状病毒的复制（PBMC + Stem cells 24h组分别与PBMC组、stem cells组相比）；干细胞和PBMC比例为1:10时对病毒的抑制效果显著优于1:5时的抑制效果（PBMC（E6）+Stem cells 24h组与PBMC（E5）+stem cells 24h 组相比，P＜0.001）。
实施例7 hUC-MSCs提前预防病毒性肺炎机制研究试验
本实施例采用实施例1得到的人脐带间充质干细胞进行。
将体重14-15g雌性ICR小鼠随机分为5组，每组20只，适应性喂养5天，按下列方法进行动物分组：正常组、模型组、干细胞7天注射组、干细胞7天注射感染组和阳性药组。
在攻毒前第7天，干细胞7天注射组和干细胞7天注射感染组每只小鼠经尾静脉注射接种1.2x106个干细胞，阳性药组注射利巴韦林药物。攻毒当日除正常组和干细胞7天注射组用PBS滴鼻外，其余各组滴鼻感染7.9mg/kg剂量的H7N9流感病毒。
检测肺泡灌洗液中中性粒细胞和CXCR3表达：肺泡灌洗液用 CD45、CD11b、Ly6G抗体进行标记，通过流式细胞仪检测CD45+ CD11b+ Ly6G+中性粒细胞的表达。将灌洗液用CD11b、Ly6G和CXCR3抗体对中性粒细胞染色，由流式细胞仪分析CD11b+Ly6G+细胞中的CXCR3水平。
如图15所示，CD45+ CD11b+ Ly6G+表示中性粒细胞的数量，CD45+ CD11b+ Ly6G+CD183+表示CXCR3的表达。可以看出，干细胞提前预防显著降低小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞的数量（P＜0.05）（图15的A图），同时有明显降低CXCR3表达的趋势，并且作用效果优于阳性药物利巴韦林（图15的B图）。
主要参考文献
[1] Wall, E.C., et al., Neutralising antibody activity against SARS- CoV-2 VOCs B.1.617.2 and B.1.351 by BNT162b2 vaccination. Lancet, 2021. 397(10): p. 2331-2333.
[2] Akbari, A. and J. Rezaie, Potential therapeutic application of mesenchymal stem cell-derived exosomes in SARS-CoV-2 pneumonia. Stem CellResearch & Therapy, 2020. 11(1).p.243-258.
[3] Harrell, C.R., et al., Therapeutic Potential of Mesenchymal Stem Cells and Their Secretome in the Treatment of SARS-CoV-2-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. Analytical Cellular Pathology, 2020. 169.p.73-82.
[4] Ichikawa, A., et al., CXCL10-CXCR3 enhances the development of neutrophil-mediated fulminant lung injury of viral and nonviral origin. Am JRespirCrit Care Med, 2013. 187(1): p. 65-77.

Claims (5)

1.脐带间充质干细胞在制备预防病毒感染的药物中的应用，所述的病毒为流感病毒。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于所述的流感病毒选自人或动物流感病毒。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述的流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的流感病毒选自高致病性H7N9或H5N1亚型禽流感病毒。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的流感病毒选自甲型H3N2或H1N1流感病毒。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115089612B (zh) * 2022-08-22 2022-11-22 中国药科大学 脐带间充质干细胞在预防病毒感染所致肺部疾病中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111297899A (zh) * 2020-02-21 2020-06-19 云南雅盛医疗科技有限公司 一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用
CN111514169A (zh) * 2020-05-23 2020-08-11 湖南源品细胞生物科技有限公司 一种msc用于抑制病毒复制的应用
CN111904980A (zh) * 2020-02-05 2020-11-10 浙江生创精准医疗科技有限公司 间充质干细胞与在治疗急性肺损伤、急性呼吸窘迫症或肺纤维化中的用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114829583A (zh) * 2020-02-25 2022-07-29 上海大学 间充质干细胞在治疗重症covid19肺炎中的用途
US20210308190A1 (en) * 2020-04-07 2021-10-07 Miguelangelo J. Perez-Cruet Human umbilical cord blood mesenchymal stem cell transfusion immunotherapy for treatment of cytokine storm associated with coronavirus infection
CN112826833A (zh) * 2020-07-30 2021-05-25 中国人民解放军总医院第五医学中心 间充质干细胞在制备新冠肺炎引起的肺损伤修复药物中的应用
US20220218817A1 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 Vitro Biopharma, Inc. Immune modulation by mesenchymal stem cells
CN115089612B (zh) * 2022-08-22 2022-11-22 中国药科大学 脐带间充质干细胞在预防病毒感染所致肺部疾病中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111904980A (zh) * 2020-02-05 2020-11-10 浙江生创精准医疗科技有限公司 间充质干细胞与在治疗急性肺损伤、急性呼吸窘迫症或肺纤维化中的用途
CN111297899A (zh) * 2020-02-21 2020-06-19 云南雅盛医疗科技有限公司 一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用
CN111514169A (zh) * 2020-05-23 2020-08-11 湖南源品细胞生物科技有限公司 一种msc用于抑制病毒复制的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Therapeutic Implications of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cells in Attenuating Influenza A(H5N1) Virus–Associated Acute Lung Injury;Hayley Loy et al;《The Journal of Infectious Diseases》;20190115;第186-196页 *

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