JP5554919B2 - 核酸の単離および精製 - Google Patents
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Description
本出願は、2001年11月6日に出願された「ISOLATION AND PURIFICATION OF NUCLEIC ACIDS」という表題の米国仮特許出願第60/337,904号の利益を主張し、その内容は本明細書によって参照として組み入れられる。
該当なし
該当なし
高品質の核酸の単離および精製は、分子生物学的手順において重要な段階である。ヒト血液、血清、培養細胞、ならびに植物、動物、およびヒト組織、ならびに他の試料等の生体液から、一本鎖および二本鎖DNAを単離するための、数多くの方法が報告されている。以下の多くの様々な手順が記載されている:
。これらの手順のほとんどは、時間を要し、単調であり、かつコストがかかる。さらに、これらの手順の多くは有害な有機溶媒の使用を含む。例えば、AstellおよびSmith(1971)によって記載されている方法では、オリゴデオキシリボヌクレオチドのセルロースへの共有結合が必要とされる。KothariおよびTaylor(1972)によって記載されている手順は、セルロースおよび様々なセルロース誘導体に関連し、一つまたは複数の有機溶媒が核酸単離の様々な段階で用いられ、純粋な核酸を単離するためにそれらはみな何回もの精製サイクルを必要とする。さらに、入手可能なマトリックスの各種類の適用は、特定の群の核酸に限定される場合が多いことが見出された。
本発明で記載する方法では、セルロース粒子またはセルロースろ紙等の隣接水酸基を有するポリマーを使用する。驚いたことに、結合緩衝液として調合されるある化学物質および塩の存在下において、これらの粒子またはろ紙は核酸を吸収することができる。次に粒子またはろ紙に結合している核酸を洗浄して不必要な物質を除去し、その後溶出緩衝液または脱イオン水を添加することにより、粒子またはろ紙から結合している核酸を溶出する。
概要
本方法は、最終的な精製以前に、最初に核酸をある程度精製された形態まで精製する必要性を排除することにより、様々な供給源からの核酸の単離を単純化するものである。本方法では、抽出または洗浄用のアルコールを含む有機溶媒の使用もまた排除される。本方法により、PCR、配列決定、またはブロッティング手順等のさらなる特徴づけおよび後続処理が直接できる状態の核酸が産生される。本明細書に記載する独特な特徴のために、本方法はハイスループットスクリーニング系を含む自動化に容易に適応できる。
以下の方法において、セルロース粒子またはセルロースろ紙は、ある濃度の塩およびポリアルキレングリコールの存在下で核酸に結合することが見出された。したがって、本発明は一つの局面において、生体液、様々な溶液、細胞、植物、組織、プラスミドを含む細菌細胞溶解液等を含むがこれらに限定されない様々な供給源から、DNA、RNA、およびPNA等の核酸を単純にかつ迅速に単離する方法を提供する。記載する本発明はまた、核酸を大きさに基づいて単離するためでもある。以下は、DNAによって例示される核酸に関する本発明の説明である。本発明が同様の様式でRNAおよびPNAの分離にも有用であることを理解されたい。小さな核酸はセルロース粒子(または粉末)またはセルロースろ紙への強力な結合に高塩濃度を必要とするため、塩濃度を選択的に操作して、セルロース粒子またはセルロースろ紙に結合している核酸を大きさに基づいて遊離させることができる。DNAが結合しているセルロース粒子またはセルロースろ紙は、セルロース粒子またはセルロースろ紙からDNAを溶出および分離するために適切な溶出緩衝液と接触させる以前に、任意に適切な洗浄緩衝液を用いて洗浄してもよい。洗浄および溶出のすべての段階における液体からのセルロース粒子(粉末)の分離は、例えば、セルロース粉末を小さなカラムにセットすることにより、または減圧濾過または遠心機を使用することにより、単純化され得る。セルロースろ紙についても、同様の手順が用いられ得る。
a) セルロースを核酸を含む溶液と混合し、それにより組み合わせを生成する段階;ならびに
b) 組み合わせの塩およびポリアルキレングリコールの濃度を、核酸がセルロースに結合するのに適した濃度に調整し、それにより溶液中のすべてまたは一部の核酸がセルロースに結合する段階
を含む、核酸をセルロースに結合させる方法を提供する。
a) セルロースを核酸および非核酸物質を含む溶液と混合し、第一の組み合わせを生成する段階;
b) 第一の組み合わせの塩およびポリアルキレングリコールの濃度を、溶液中の核酸がセルロースに結合するのに適した濃度に調整し、セルロースに結合している核酸を含む第二の組み合わせを生成する段階;
c) 第二の組み合わせからセルロースに結合している核酸を分離する段階;
d) c)で分離したセルロースに結合している核酸を溶出緩衝液と接触させ、結合している核酸をセルロースから溶出緩衝液中に遊離させる段階; ならびに
e) 溶出緩衝液からセルロースを分離し、実質的に非核酸物質を含まない核酸を提供する段階。
a) セルロース誘導体を核酸を含む溶液と混合し、それにより組み合わせを生成する段階;
b) 組み合わせの塩およびポリアルキレングリコールの濃度を、核酸がセルロース誘導体に結合するのに適した濃度に調整し、それにより溶液中のすべてまたは一部の核酸がセルロース誘導体に結合する段階。
a) セルロース誘導体を核酸および非核酸物質を含む溶液と混合し、第一の組み合わせを生成する段階;
b) 第一の組み合わせの塩およびポリアルキレングリコールの濃度を、核酸がセルロース誘導体に結合するのに適した濃度に調整し、セルロース誘導体に結合している核酸を含む第二の組み合わせを生成する段階;
c) 第二の組み合わせからセルロース誘導体に結合している核酸を分離する段階;
d) c)で分離したセルロース誘導体に結合している核酸を溶出緩衝液と接触させ、結合している核酸をセルロース誘導体から溶出緩衝液中に遊離させる段階;
e) 溶出緩衝液からセルロース誘導体を分離し、実質的に非核酸物質を含まない核酸を提供する段階。
一般方法論
以下の実施例において使用するセルロース粒子は、Sigma(ミズーリ州セントルイス)(カタログ番号:C-6288)またはWhatman Inc.(ニュージャージー州クリフトン)(カタログ番号:4021050)のセルロース粉末である。セルロースろ紙(No.3)はWhatman Inc.(ニュージャージー州クリフトン)から購入し、直径約13ミリメートルの円形に切断した。セファデックス(登録商標)G-25は、Pharmacia(ニュージャージー州ピスカタウェイ)(カタログ番号:17-0033-01)のものである。
セルロース粒子を用いたDNA単離
対照として使用したウシ胸腺DNA標品(Sigma、ミズーリ州、カタログ番号:D1501)は、可逆的にセルロース粒子に結合させた。セルロース粒子に結合しているDNAを、不必要な物質から分離し洗浄した。次に、粒子からDNAを溶出した。以下の手順を用いた:
1. 50μg(STE緩衝液(100 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA、500 mM塩化ナトリウム)中の1 mg/ml DNA溶液50μl)を含む2 ml微量遠心チューブに、500μlの結合緩衝液(10% PEG 8000 MW、1.25M NaCl)および1 mgのセルロール粒子(50 mg/ml懸濁液20μl)を添加する。
2. 回転(end-over-end )ローテータを用いて、チューブの内容物を室温で10分間混合する。
3. 微量遠心機を用いて、セルロース粒子に結合しているDNAを沈降させる。
4. 1 mlの洗浄緩衝液(10% PEG分子量8000、2.5M NaCl)を用いて粒子を洗浄する。洗浄段階をもう一度繰り返す。
5. 200〜500μlの溶出緩衝液(分子等級脱イオン水またはTE緩衝液(10 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA)を加えて10分間混合し、上記のように粒子を沈降させることにより、粒子からDNAを溶出する。精製したDNAは上清中に回収され、さらなる解析ができる状態になっている。
セルロース粒子を用いた全血からのDNAの単離
ヒト全血試料由来のDNAは、プロテイナーゼKおよび特別に調合した溶解緩衝液を用いて遊離させた。次に、結合緩衝液の存在下で、DNAをセルロース粒子に結合させた。続いて、セルロース粒子に結合しているDNAを、他の混入物から分離し洗浄した。粒子からDNAを溶出した。以下の手順を用いた:
1. 2ml微量遠心チューブに、10 mMトリス-HCl、1mM 塩化カルシウム、50%グリセロール、pH 7.5中のプロテイナーゼK溶液20μl(400μg)をピペットで移す。
2. 200μlの全血(ヘパリン処理、クエン酸処理、またはEDTA処理済)を添加する。
3. 200μlの溶解緩衝液(50 mMトリス-HCl、50 mM EDTA、6MグアニジンHCl、6M尿素、10 mM塩化カルシウム、10%ツィーン20)を添加する。
4. 15秒間瞬間ボルテックスすることにより、チューブの内容物を混合する。
5. チューブの内容物を、56℃で10分間インキュベートする。
6. 56℃からチューブを取り出し、500μlの結合緩衝液(10% PEG 8000 MW、1.25M NaCl)を添加した後、よく混合したセルロース粒子懸濁液20μl(1 mg)を添加する。
7. 回転ローテータで混合しながら、チューブの内容物を室温で10分間インキュベートする。
8. 微量遠心機を用いて、セルロース粒子に結合しているDNAを沈降させる。
9. 上清を吸引し、1 mlの洗浄緩衝液(10% PEG 8000 MW、2.5M NaCl)を添加してよく混合し上清を吸引することにより粒子を洗浄する。洗浄段階をもう一度繰り返す。
10. 200〜500μlの溶出緩衝液(10 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA)または分子等級脱イオン水を加え、上記の段階7のように混合する。
11. 微量遠心機を用いて粒子を沈降させ、精製されたDNAを含む上清を慎重に収集する。
12. その時点で、精製したDNAはさらなる解析ができる状態になっている。
マイクロチューブ内におけるセルロースろ紙を用いたDNAの単離
特別に調合した結合緩衝液中で、DNAを捕獲するためのマトリックスとして、1層の円形のワットマンろ紙(Whatman Filter Paper)を用いた。洗浄緩衝液を用いて捕獲されたDNAを洗浄して不必要な物質を除去し、次にろ紙から精製DNAを溶出した。以下の手順を用いた:
1. セルロースろ紙から1枚の均一な円形(直径13 mm)の層を切り取り、2 ml微量遠心チューブ内にセットする。
2. まず2 mlの分子等級脱イオン水でろ紙を洗浄し、その後2 mlの結合緩衝液(10% PEG 8000 MW、1.25M NaCl)で洗浄する。
3. チューブに結合緩衝液500μlを添加し、その後STE緩衝液(100 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA、500 mM NaCl)中の1 mg/mlウシ胸腺DNA溶液50μlを添加する。
4. 回転ローテータで混合しながら、チューブを室温で10分間インキュベートする。
5. ろ紙を含むマイクロチューブから溶液(液体)を吸引し、それぞれ1 mlの洗浄緩衝液(10% PEG 8000 MW、2.5M NaCl)を用いてろ紙を2回洗浄する。
6. 200〜500μlの溶出緩衝液(10 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA)または分子等級脱イオン水を添加する。上記の段階4のように、10分間混合する。
7. 精製されたDNA(溶出緩衝液中)を、ろ紙を含むマイクロチューブからきれいなチューブに慎重に移す。DNAはさらなる処理ができる状態になっている。
カラム内におけるセルロースろ紙を用いたDNAの単離
特別に調合した結合緩衝液中で、DNAを捕獲するためのカラム内のマトリックスとして、1層または3層の円形のセルロースろ紙を用いた。洗浄緩衝液を用いて捕獲されたDNAを洗浄して不必要な物質を除去し、次にカラムから精製DNAを溶出した。以下の手順を用いた:
1. 上記の実施例3のようにセルロースろ紙から均一な円形の層を切り取り、カラム(0.5×10 cm)の底に1層または3層をセットした。
2. カラム内のろ紙を2 mlの分子等級脱イオン水で洗浄し、その後2 mlの結合緩衝液(10% PEG 8000 MW、1.25M NaCl)で洗浄する。各洗浄とも、単に重力によりカラムから液体が排出されるようにする。
3. カラムに結合緩衝液500μlを添加し、その後STE緩衝液(100 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA、500 mM NaCl)中の1 mg/mlウシ胸腺DNA溶液50μlを添加する。
4. 重力によりカラムから液体を排出させる。
5. それぞれ500μlの洗浄緩衝液(10% PEG 8000 MW、2.5M NaCl)を用いて、カラム中のろ紙を2回洗浄する。
6. 200〜500μlの溶出緩衝液(10 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA)または分子等級脱イオン水を添加する。精製DNAを収集するが、このDNAはさらなる処理ができる状態になっている。
マイクロチューブ内におけるセファデックス(登録商標)G-25を用いたDNAの単離
特別に調合した結合緩衝液中で、DNAを捕獲するためのマトリックスとして、セファデックス(登録商標)G-25を用いた。洗浄緩衝液を用いて捕獲されたDNAを洗浄して不必要な物質を除去し、次にカラムから精製DNAを溶出した。以下の手順を用いた:
1. 0.02%アジ化ナトリウムを含む分子等級水中の、セファデックス(登録商標)G-25の50 mg/ml懸濁液を調製する。
2. 1 mg(20μl)、5 mg(100μl)、および10 mg(200μl)のセファデックス(登録商標)G-25懸濁液を、3本の個々の微量遠心チューブにピペットで移す。
3. 500μlの結合緩衝液(10% PEG 8000 MW、1.25M NaCl)を添する。
4. STE緩衝液(100 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA、500 mM NaCl)中の1 mg/mlウシ胸腺DNA溶液50μlを添加する。
5. 回転ローテータで混合しながら、室温で10分間インキュベートする。
6. それぞれ1 mlの洗浄緩衝液(10% PEG 8000 MW、2.5M NaCl)を用いて、セファデックス(登録商標)粒子を2回洗浄する。微量遠心機を用いて粒子を沈降させ、上清を吸引する。
7. 200〜500μlの溶出緩衝液(10 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA)または分子等級脱イオン水を添加する。
8. 上記の段階5のように、室温で10分間インキュベートする。
9. 微量遠心機を用いて、粒子を沈降させる。
10. 精製されたDNAを含む上清をきれいなマイクロチューブに慎重に移す。DNAはさらなる処理ができる状態になっている。
カラム内におけるセファデックス(登録商標)G-25を用いたDNAの単離
特別に調合した結合緩衝液中で、DNAを捕獲するためのマトリックスとして、カラム内に充填されたセファデックス(登録商標)G-25用いた。洗浄緩衝液を用いて捕獲されたDNAを洗浄して不必要な物質を除去し、次にカラムから精製DNAを溶出した。以下の手順を用いた:
1. 0.02%アジ化ナトリウムを含む分子等級水中の、セファデックス(登録商標)G-25の50 mg/ml懸濁液を調製する。
2. 2本の個々のカラム(0.5×10 cm)に、1 mg(20μl)または5 mg(100μl)のセファデックス(登録商標)G-25懸濁液を充填する。
3. 500μlの結合緩衝液(10% PEG 8000 MW、1.25M NaCl)を添する。
4. STE緩衝液(100 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA、500 mM NaCl)中の1 mg/mlウシ胸腺DNA溶液50μlを添加する。
5. 室温で10分間インキュベートする。
6. 重力によりカラムから液体を排出させる。
7. それぞれ1 mlの洗浄緩衝液(10% PEG 8000 MW、2.5M NaCl)を用いて、カラム中のセファデックス(登録商標)粒子を2回洗浄する。
8. 200〜500μlの溶出緩衝液(10 mMトリス-HCl、pH8.0、1 mM EDTA)または分子等級脱イオン水を添加する。
9. 精製DNAをきれいなチューブに収集する。
10. DNAはさらなる処理ができる状態になっている。
Claims (16)
- 下記の段階を含む、有機溶媒の不存在下において、核酸溶液中の非核酸物質から核酸を分離する方法であって、段階c)およびe)の分離が遠心機、減圧濾過、カラムを用いて行われるか、または手動で行われる方法:
a)隣接水酸基を有する多糖類誘導体を、精製又は半精製されていない核酸を含む溶液と混合し、第一の組み合わせを生成する段階であって、前記多糖類誘導体が、アガロース、セファロース(商標)、スーパーデックス(商標)、スーパーロース(商標)、セファクリル(商標)、デキストラン、およびそれらの混合物からなる群から選択される工程; b)ポリエチレングリコールの濃度を5%から15%の間の濃度に調整し、且つ塩の濃度を0.25Mから5.0Mの間に調整することにより、多糖類誘導体結合核酸を含む第二の組み合わせを生成する段階であって、前記多糖類誘導体に核酸が結合する段階;
c)第二の組み合わせから該多糖類誘導体結合核酸を分離する段階;
d)c)で分離した前記多糖類誘導体結合核酸を溶出緩衝液と接触させ、結合している前記核酸を前記多糖類誘導体から溶出緩衝液中に遊離させる段階;ならびに
e)溶出緩衝液から前記多糖類誘導体を分離し、実質的に非核酸物質を含まない核酸を提供する段階。 - 前記多糖類誘導体が粒子の形態である、請求項1記載の方法。
- 段階c)およびe)における分離が減圧濾過を用いて行われる、請求項1または2記載の方法。
- 段階c)およびe)における分離が遠心機を用いて行われる、請求項1または2記載の方法。
- 段階c)およびe)における分離がカラムを用いて行われる、請求項1または2記載の方法。
- 段階c)およびe)における分離が手動で行われる、請求項1または2記載の方法。
- 前記多糖類誘導体粒子に結合している核酸がDNAであり、そして洗浄緩衝液を用いて洗浄され、該洗浄緩衝液は、DNAを多糖類誘導体粒子に結合させたままで多糖類誘導体粒子に結合している不純物を除去するものである、請求項2から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多糖類誘導体に結合している核酸がDNAであり、そして多糖類誘導体粒子に結合しているDNAが、多糖類誘導体に結合しているDNAを遊離させる溶出緩衝液により溶出される、請求項7記載の方法。
- 前記溶出緩衝液により遊離されるDNAが単離される、請求項8記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコールが1000から8000の分子量を有し、そして塩が塩化ナトリウムである、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコールが6000から8000の分子量を有し、そして塩が塩化ナトリウムである、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 調整された塩濃度が0.5Mから2.5Mの間である、請求項11記載の方法。
- 前記塩が塩化ナトリウムであり、かつ調整された塩化ナトリウム濃度が0.5Mから1.5Mの間である、請求項11記載の方法。
- 前記多糖類誘導体がアガロースまたはデキストランを含む、請求項1記載の方法。
- 前記多糖類誘導体がカラムに含まれている、請求項1記載の方法。
- 前記多糖類誘導体がマトリックスの形態である、請求項15記載の方法。
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