CN114292785A - 一株海洋链霉菌及其在防控嗜水气单胞菌感染水生动物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株海洋链霉菌及其在防控嗜水气单胞菌感染水生动物中的应用，属于生物防治技术领域。该链霉菌的名称为Streptomyces sp.SH5，保藏编号：GDMCC No：62057。该SH5菌株分离自水体环境，应用于养殖水体很大程度上降低了生态安全风险。该SH5菌株通过定植于斑马鱼肠道，激活宿主免疫体系，抑制炎症反应，降低嗜水气单胞菌毒力因子的生产及毒力基因表达，可有效提高在嗜水气单胞菌胁迫下的斑马鱼存活率，从而以绿色环保、不影响宿主微生态平衡的友好方式实现对嗜水气单胞菌感染的防控。

Description

一株海洋链霉菌及其在防控嗜水气单胞菌感染水生动物中的 应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，涉及一种海洋链霉菌及其在水产病害防控领域的应用，特别涉及能够定植于水生动物肠道的海洋链霉菌SH5及其在防控嗜水气单胞菌感染水生动物(比如斑马鱼)中的应用。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是水环境常见致病菌，其可感染鱼、虾、贝等多类水产动物，诱发运动性气单胞菌败血症，我国每年因该疾病爆发而导致的直接经济损失高达数十亿。抗生素药物疗法一直是国内、外普遍使用的防治水产病害的传统手段，然而广谱抗生素的大量使用导致的耐药性、环境污染、破坏生态平衡等问题，迫使人们尽快研发出更安全、环保、可靠的新型病害防控药物及方法，以迎合国家“绿色发展”战略需求。生物防治因为绿色环保、安全健康、经济廉价、方便使用等优势被认为是可替代抗生素的主要技术手段。

链霉菌因善产拮抗活性物质、降解酶类、良好的抗逆性等优势而在生物防控领域受到广泛关注。然而，链霉菌的好氧生活特征，使得目前还没有关于链霉菌可定植水生生物体内发挥生物防控作用的相关发现和依据。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种海洋链霉菌。该菌株是一株可定植于斑马鱼肠道的链霉菌，将该菌株发酵液投施至养殖水体，可有效提高在嗜水气单胞菌胁迫下的斑马鱼存活率，抑制斑马鱼炎症反应，降低嗜水气单胞菌毒力因子的生产及相关毒力基因的表达。

本发明的另一目的在于提供上述海洋链霉菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一株海洋链霉菌，菌株命名为海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SH5，是从大连市星海湾海洋底泥分离纯化得到。

所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SH5的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：62057，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年11月12日。

所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SH5的16S rDNA序列特征：其16SrDNA序列具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，序列长度为1374bp。

一种生物制剂，基于上述海洋链霉菌制备得到。

所述的生物制剂由该海洋链霉菌经液体培养制备得到，优选包括如下步骤：将该海洋链霉菌接种至ISP1液体培养基中培养，即可获得生物制剂。

所述的培养指在28～30℃，180～200rpm下培养48～72h。

所述的海洋链霉菌SH5在防控嗜水气单胞菌感染水生动物中的应用。

所述的海洋链霉菌SH5在水生动物肠道定植能力分析中的应用；

进一步，海洋链霉菌SH5在提高水生动物免疫应答中的应用。

所述的海洋链霉菌SH5在调节嗜水气单胞菌在水生动物炎症反应过程中的应用。

进一步的，所述的海洋链霉菌SH5在抑制嗜水气单胞菌在水生动物肠道定植中的应用。

进一步的，所述的海洋链霉菌SH5在病原菌胁迫下降低水生动物炎症反应中的应用；所述的病原菌为嗜水气单胞菌。

进一步的，所述的水生动物为斑马鱼。

所述的海洋链霉菌SH5在抑制嗜水气单胞菌毒力因子生产及毒力基因表达中的应用。

所述的毒力基因为aerA，act，ast，hlyA，alt，ahp，ahyR，ompA，fur。

所述SH5菌株防控嗜水气单胞菌感染斑马鱼的原理在于SH5通过定植于斑马鱼肠道，激活宿主免疫体系，抑制炎症反应，降低嗜水气单胞菌毒力基因表达，从而以绿色环保、不影响宿主微生态平衡的友好方式实现对嗜水气单胞菌感染的防控。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SH5菌株。该SH5菌株分离自水体环境，应用于养殖水体很大程度上降低了生态安全风险。

(2)本发明的SH5菌株有效提升嗜水气单胞菌胁迫下的斑马鱼存活率。

(3)本发明的SH5菌株虽为好氧菌株，但是能够定植于斑马鱼肠道中。

(4)本发明的SH5菌株有效降低嗜水气单胞菌在斑马鱼肠道的定植数量。

(5)本发明的SH5菌株有效抑制病原菌嗜水气单胞菌毒力基因的表达。

(6)本发明的SH5菌株有效提升斑马鱼免疫应答，并在病原菌胁迫下显著降低斑马鱼炎症反应。

附图说明

图1是目标菌株SH5提升嗜水气单胞菌胁迫下斑马鱼存活率的实际效果；其中，SH5(L)表示低浓度处理组，即SH5以1：1000稀释发酵液添加到斑马鱼幼鱼的养殖水中；SH5(H)表示高浓度处理组，即SH5以1：100稀释发酵液添加到斑马鱼幼鱼的养殖水中。

图2是SH5菌株16S rDNA序列及进化树。

图3是引物SH5F/R特异性检验；其中，M为DL2000的marker，泳道1为SH5，泳道2为链霉菌TK24，泳道3为大肠杆菌，泳道4为嗜水气单胞菌，泳道5为副溶血弧菌，泳道6为斑马鱼。

图4是荧光标记的SH5菌株在斑马鱼肠道内的定植效果(A)以及定植SH5的定量分析(B)。

图5是SH5菌株减少嗜水气单胞菌在斑马鱼肠道定植的作用效果；其中，A为不同时间点每条斑马鱼嗜水气单胞菌的数量；B为不同时间点每条斑马鱼SH5的数量。

图6是SH5菌株对斑马鱼免疫应答及炎症反应相关基因表达的影响；其中，A为嗜水气单胞菌攻毒6h的结果；B为嗜水气单胞菌攻毒12h的结果。

图7是SH5菌株抑制嗜水气单胞菌毒力基因表达的作用；其中，A为SH5及嗜水气单胞菌共培养6h的结果；B为SH5及嗜水气单胞菌共培养12h的结果；A为SH5及嗜水气单胞菌共培养24h的结果。

图8是SH5菌株对嗜水气单胞菌的拮抗作用。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例2中所用的大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GDMCC 1.215、嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)GDMCC 1.2306，均购自广东省微生物菌种保藏中心；

副溶血弧菌为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC 17802购自广东环凯生物科技有限公司；

变铅青链霉菌TK24为变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24在文献“Xu D,Seghezzi N,Esnault C,et al.Repression of Antibiotic Production andSporulation in Streptomyces coelicolor by Overexpression of a TetR FamilyTranscriptional Regulator[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,76(23):7741-7753.”中公开。

实施例1

所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SH5的筛选与鉴定方法，步骤及结果如下：

(1)称取大连星海湾海泥样品1g，加入10mL胆酸钠(0.1％w/v)，200r/min，震荡30min，离心(500g，1min)后保存上清。向下层海泥沉淀加入10mL胆酸钠(0.1％w/v)，低功率超声波水域温和处理1min，离心(500g，1min)后保留上清。合并所得两批次上清液，采用无菌海水对上清液进行梯度稀释，得到稀释10³倍上清液，取0.2mL稀释液均匀涂布于含有15μg/mL萘啶酸及50μg/mL重铬酸钾的HV平板上，置于28℃培养箱中培养20天后，观察链霉菌菌落，挑取单菌落并在Bennett培养基上划线培养，7天后观察链霉菌菌株生长形态，确认无细菌或真菌污染。从Bennett培养基上取链霉菌琼脂块接种于TSB液体培养基中，28℃、200rpm培养7天，取500μL菌悬液与等体积的40％甘油充分混匀后置于1.5mL离心管中，于-70℃冰箱中保存。

(2)菌株活化。首先将目标链霉菌菌株SH5从-70℃冰箱取出，取100μL涂布于ISP1固体培养基中，置于28℃培养3天，而后取菌株琼脂块接种于50mL ISP1液体培养基，28℃、200rpm培养3天待用。将TU型斑马鱼胚胎(受精0天)(购自于上海费曦生物科技有限公司)用无菌水清洗3次，放入6孔板中，置于28℃恒温培养箱，以14h光照、10h黑暗控制光周期，提供受精条件。受精后的第3天(3dpf)，向斑马鱼养殖水体中按1：100(SH5(H))、1：1000(SH5(L))稀释比例加入链霉菌发酵液，对照组(Control)中加入同体积ISP1液体培养基，每日换水后维持原始链霉菌发酵液浓度。发酵液处理3天后，换无菌水培养，加入终浓度1×10⁸CFU/mL的嗜水气单胞菌攻毒，每隔12h记录存活率。每组设置3个平行实验。存活率结果详见图1。从图1中可知，在没有添加SH5(Control)的情况下，斑马鱼幼鱼在攻毒后24h存活率出现下降，36h后急剧下降，在48h时斑马鱼幼鱼的存活率为0％；而在SH5处理组下，斑马鱼幼鱼在攻毒后24h存活率为100％，在36h存活率超过80％，是对照组(Control)的3倍。结果表明，SH5处理下能有效提高斑马鱼在嗜水气单胞菌攻毒下的存活率。

其中，ISP1液体培养基，配方为：酵母提取粉3g，胰蛋白胨5g，无菌水定容至1L，pH7.2±0.2；ISP1固体培养基还需加入20g琼脂。

(3)目标菌株SH5的16S rDNA序列鉴定。取200μL SH5菌株的24h发酵液，离心弃上清，将收集的菌丝悬浮于100μL无菌水，加热至100℃，10分钟，所得溶液直接作为模板应用于PCR。采用通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反应体系如下：ddH₂O 15.00μL，KOD-Plus buffer 2.5μL，dNTP mix(200mmol/L)2.5μL，引物27F 1.0μL，引物1492R 1.0μL，菌液模板1.0μL，KOD-Plus酶0.5μL，MgSO₄(25mmol/L)1.5μL。反应程序设置如下：95℃预变性5min，之后进入热循环(×30)：94℃，1min；54℃，1min；72℃，2min，最后72℃延伸10min。所得PCR扩增产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)，对PCR产物(大小约1.5kb)进行切胶回收，并将纯化的DNA片段克隆至pMD18-T载体上，所得T-A连接产物转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，采用PCR对克隆进行检测，对阳性克隆进行基因测序。

(4)依据SH5菌株16S rDNA序列建立进化树。首先，将测得的16S rDNA序列导入EzTaxon专业数据库，在线进行同源序列比对分析，而后将结果导入Cluxtalx 1.83软件进行多序列匹配排列，所得结果应用于Mega5软件，并通过邻位相连法(Neighbor-joiningmethod)建立***进化树。所得结果见图2，SH5菌株与S.badius NRRL B-2567(AY999783)聚为一支。鉴定菌株SH5为链霉菌(Streptomyces sp.)，命名为海洋链霉菌(Streptomycessp.)SH5。

所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SH5的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：62057，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年11月12日。

所述的海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SH5的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示(1374bp)。

实施例2

所述SH5菌株在斑马鱼肠道内的定植以及减少嗜水气单胞菌在斑马鱼肠道定植的作用效果。

(1)荧光显微镜直接观察SH5在斑马鱼肠道的定植情况。首先，采用绿色荧光示踪染料CFDA-SE对SH5进行荧光标记。而后，将染色的SH5按1：100浓度添加到经PTU(苯硫脲)(用以抑制斑马鱼幼鱼黑色素的生成)处理的斑马鱼养殖水中，每天换水后补充荧光染料以维持初始浓度。3天之后，改用正常养殖水(不添加SH5)继续饲养斑马鱼，并于每24h从每组随机选取5条斑马鱼幼鱼，经MS-22麻醉后，利用其光学透性，在荧光显微镜下观察SH5的定植情况。结果显示，SH5可以在斑马鱼肠道中停留7天以上，并且在斑马鱼前肠和中肠的数量较多(图4A)。

(2)SH5在斑马鱼肠道定植数量的分析。采用RT-PCR技术鉴定SH5于不同时间点在斑马鱼肠道定植的具体数量，具体步骤如下：首先，使用ClustalW对链霉菌的16S rDNA进行多核苷酸序列比对，根据序列的保守与可变区域，设计出SH5的特异性引物(SH5-F：5′-TAACACTCTGTCCCGCATGG-3′；SH5-R：5′-TTACCCCACCAACAAGCTGA-3′)，扩增区域包含16SrDNA的γ高变区，并采用大肠杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌及其他链霉菌(变铅青链霉菌TK24)、斑马鱼验证引物SH5-F/R的特异性，结果表明仅有SH5扩增出条带，其他均无条带；可见，引物SH5-F/R具有良好特异性(图3)。将特异性引物扩增片段克隆至pMD18-T载体，鉴定所构建质粒的浓度，根据公式Copies/μL＝6.02×10²³×DNA浓度(浓度(ng/μL)×10^-9/DNA长度×660，求得标准样品拷贝数。将标准样品按10倍梯度稀释作为模板，绘制标准曲线。而后，采用OMEGA DNA试剂盒提取各组斑马鱼肠道细菌总DNA，均一化初始浓度后，以总DNA为模板，SH5-F/SH5-R为特异性引物，通过RT-PCR实验鉴定斑马鱼肠道中SH5定植的具体数量。RT-PCR的反应体系如下：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10μL，引物SH5-F0.5μL，引物SH5-R 0.5μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 8μL。RT-PCR反应程序设置如下：95℃预变性5min，之后进入热循环(×40)：94℃，30s；58℃，30s；72℃，20s。熔解信号收集条件设置为：65℃至95℃，0.5℃/10s。结果证实，SH5能够在斑马鱼肠道中停留约4天，定植数量稳定在每条鱼约1×10^2.5CFU(图4B)。

(3)SH5抑制嗜水气单胞菌定植斑马鱼的作用效果。采用RT-PCR技术鉴定SH5于不同时间点影响嗜水气单胞菌定植斑马鱼肠道的具体效果，相关步骤如下：首先，采用嗜水气单胞菌特异性引物(aerA2-F：5′-CGCCAGCTGGTCAAGACTGT-3′，aerA2-R：5′-CCAGTTGGTGGCTGTGTCGT-3′)，利用PCR技术扩增DNA片段，并将其克隆至pMD18-T载体，依据上文所述方法求得标准样品拷贝数，绘制标准曲线。依据标曲计算不同时间点每条斑马鱼嗜水气单胞菌及SH5的数量。结果发现，SH5能有效抑制嗜水气单胞菌在斑马鱼肠道的定植(图5)。

实施例3

所述SH5菌株对斑马鱼免疫基因表达的影响。

(1)SH5预处理斑马鱼。SH5培养三天后，按SH5发酵液：养殖水＝1：100比例将SH5发酵液添加到斑马鱼幼鱼(3dfp)的养殖水中，每天换水并维持SH5发酵液在原浓度，处理3d。对照组添加与实验组同等量的ISP1液体培养基。每组设置3个平行。

(2)嗜水气单胞菌攻毒实验。在用SH5发酵液处理斑马鱼3d后，投入嗜水气单胞菌12h TSB培养液进行攻毒，终浓度1×10⁸CFU/mL。在攻毒后的0h、6h、12h，每组取50条斑马鱼幼鱼提取总RNA。

(3)斑马鱼总RNA提取。

样品处理：将斑马鱼用PBS清洗3次，吸尽PBS，然后用研磨棒将斑马鱼捣碎。向捣碎的样品中加入1mL Trizol，混合均匀静置5min。

氯仿抽提：向样品中加入400μL的氯仿，涡旋震荡涡旋震荡30s使溶液均匀混合，离心(12000rpm，10min，4℃)。小心地用移液器吸取大约400μL的上清至另一个干净的离心管中。

异丙醇沉淀：加入400μL的异丙醇，颠倒混匀后静置10min，离心(12000rpm，10min，4℃)，去上清。

乙醇洗涤：用75％乙醇对沉淀洗涤两次，离心去上清。将沉淀置于通风处以充分挥发乙醇。

向沉淀中加入适量的RNase-free水溶解，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用核酸定量仪鉴定浓度。

(4)qRT-PCR检测免疫基因表达量。以总RNA为模板，采用逆转录酶M-MLV ReverseTranscriptase(Promega)扩增cDNA。首先将总RNA：2μg，Oligo(dT)18：0.5μg混合，加DEPC处理水至15μL，而后升温至70℃，保持5min。冰上冷却后，向反应体系中加入M-MLV 5×Reaction Buffer 5μL，dNTPs Mixture(10mM)1μL，M-MLV Reverse Transcriptase 1μL，RNase Inhibitor 1μL，DEPC处理水至25μL。反应程序如下：42℃：1h，72℃：10min，4℃终止。样品置于-20℃保存。

以逆转录合成的cDNA为模板，采用特异性引物(表1)，通过RT-PCR实验检测等免疫基因表达量。以管家基因EF-1α作为内参基因，每个样品设置5个生物学重复，同时设置不添加扩增模板的实验组作为空白对照组，以检验样品是否存在基因组DNA污染，进行相对荧光定量PCR实验体系及反应条件同上。实验结果发现，经过SH5处理，在嗜水气单胞菌攻毒后，斑马鱼的TLR3、Lysozyme及iNOs等免疫相关基因的表达量显著上调，而斑马鱼的1L-1β，1L-6，MyD88及TLR4a等炎症基因显著下调，说明益生菌株SH5有激活宿主免疫和降低炎症反应的功效(图6)。

实施例4

所述SH5菌株对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响。

(1)SH5与嗜水气单胞菌共培养体系的建立

将SH5及嗜水气单胞菌分别在ISP1和TSB液体培养基中发酵培养至平台期。而后，各取1mL菌液置于装有100mL TSB的挡板瓶中，28℃，180rpm培养48h，对照组用同体积ISP1培养基代替SH5发酵液。培养过程中在0h、6h、12h、24h不同时间点取样，用于提取总RNA。

(2)总RNA提取

具体步骤参考RNA提取试剂盒(北京酷莱博生物科技公司)提供的操作：

菌体裂解：取1mL菌液样品置于1.5mL EP管中离心(5000rpm，10min)，弃上清。向所得沉淀中加入0.5mL Trizol，混匀后室温放置约3min，直至细菌全部裂解。

氯仿抽提：向裂解物中加入0.1mL氯仿，涡旋震荡30s混匀。12000rpm室温离心3min，小心吸取上清至新的离心管中。

乙醇沉淀：在上清中加入200μL的无水乙醇，混匀后上样到RNA纯化柱中。12000rpm离心1min，弃穿透液。向纯化柱中加入0.5mL 75％乙醇，然后室温12000rpm离心30s，弃穿透液，洗涤步骤重复两次。

RNA收集：将结合有RNA的纯化柱12000rpm离心1min，将柱芯转移到1.5mL的RNase-free离心管中，加入30μL RNA溶解液，室温放置2min，12000rpm离心1min洗脱RNA。所得RNA经核酸电泳及核酸定量仪鉴定浓度和纯度后，置于-80℃保存。

(3)qRT-PCR检测毒力基因表达量。逆转录扩增cDNA以及qRT-PCR方法同上。所用特异性引物见表1。结果显示，当与SH5菌株共培养，嗜水气单胞菌的aerolysin(aerA)，cytotoxic enterotoxin(act)，heat-stable cytotonic enterotoxin(ast)，hemolysin A(hly)，heat labile cytotonic enterotoxin(alt)，serine protease(ahp)，LuxI/R-typeresponse regulator(ahyR)，outer membrane protein A(ompA)，ferric uptakeregulator(fur)九个毒力基因的表达量显著下调(图7)。

表1引物列表

实施例5

所述SH5菌株对嗜水气单胞菌的拮抗作用。

采用琼脂扩散法，用打孔器取用A1固体培养基培养了7d的SH5琼脂块(直径8mm)，以长有链霉菌的一面朝下，置于已涂布好100μL嗜水气单胞菌的TSB固体培养基上，28℃静置培养24h，测量并记录抑菌圈直径，每组实验重复三次。从图8可知，嗜水气单胞菌培养基上没有出现抑菌圈，说明SH5对嗜水气单胞菌不存在拮抗作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一株海洋链霉菌及其在防控嗜水气单胞菌感染水生动物中的应用

<160> 59

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Streptomyces sp. SH5菌株的16S rDNA序列

<400> 1

cgaacgatga agccgcttcg gtggtggatt agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggca 60

atctgccctt cactctggga caagccctgg aaacggggtc taataccgga taacactctg 120

tcccgcatgg gacggggttg aaagctccgg cggtgaagga tgagcccgcg gcctatcagc 180

ttgttggtgg ggtaatggcc taccaaggcg acgacgggta gccggcctga gagggcgacc 240

ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt 300

gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg 360

taaacctctt tcagcaggga agaagcgaaa gtgacggtac ctgcagaaga agcgccggct 420

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaag cgttgtccgg aattattggg 480

cgtaaagagc tcgtaggcgg cttgtcacgt cggatgtgaa agcccggggc ttaaccccgg 540

gtctgcattc gatacgggct agctagagtg tggtagggga gatcggaatt cctggtgtag 600

cggtgaaatg cgcagatatc aggaggaaca ccggtggcga aggcggatct ctgggccatt 660

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 720

gccgtaaacg ttgggaacta ggtgttggcg acattccacg tcgtcggtgc cgcagctaac 780

gcattaagtt ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg 840

gggcccgcac aagcagcgga gcatgtggct taattcgacg caacgcgaag aaccttacca 900

aggcttgaca tataccggaa agcatcagag atggtgcccc ccttgtggtc ggtatacagg 960

tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1020

caacccttgt tctgtgttgc cagcatgccc ttcggggtga tggggactca caggagactg 1080

ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtcttg 1140

ggctgcacac gtgctacaat ggccggtaca atgagctgcg atgccgcgag gcggagcgaa 1200

tctcaaaaag ccggtctcag ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat gaagtcggag 1260

ttgctagtaa tcgcagatca gcattgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1320

cgcccgtcac gtcacgaaag tcggtaacac ccgaagccgg tggcccaacc cctt 1374

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 27F

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1492R

<400> 3

tacggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> aerA-F

<400> 4

gagaaggtga ccaccaagaa ca 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> aerA-R

<400> 5

arctgacatc ggccttgaac tc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ast-F

<400> 6

ctatgagctg agcgatggca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ast-R

<400> 7

tcccgtcgaa cttgaagtgg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ahp-F

<400> 8

tctatgcgct ggagtcgttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ahp-R

<400> 9

aggacatgcc cacgttgtag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> act-F

<400> 10

tcaaggccga tgtcagctat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> act-R

<400> 11

gtcccactgg taacgaatgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hly-F

<400> 12

tctacctcaa cgtcaaccgc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hly-R

<400> 13

tccgcactat cttggcatcc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ompA-F

<400> 14

tggatctgca agctcgttac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ompA-R

<400> 15

ctacgtagga agtgcggaac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ompW-F

<400> 16

tacttcggtg atgccaacag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ompW-R

<400> 17

cattgatcgc catgtccaga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> fur-F

<400> 18

attggtctcg ctaccgtcta 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> fur-R

<400> 19

cggagaactc gatcaccttg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ahyR-F

<400> 20

gcggtgatga acgacagtat 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ahyR-R

<400> 21

gcagaccttg cccatttact 20

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> alt-F

<400> 22

tggatgccga gcagaacat 19

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> alt-R

<400> 23

ctctttcacc gaagtcacgc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ela-F

<400> 24

taccgcaact ggtacaacac 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ela-R

<400> 25

cggagttctg ctcggtaaag 20

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EF1α-F

<400> 26

aacagctgat cgttggagtc aa 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EF1α-R

<400> 27

ttgatgtatg cgctgacttc ct 22

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-1β-F

<400> 28

tggacttcgc agcacaaaat g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-1β-R

<400> 29

cacttcacgc tcttggatga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-6-F

<400> 30

tcaacttctc cagcgtgatg 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IL-6-R

<400> 31

tctttccctc ttttcctcct g 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Lysozyme-F

<400> 32

cgtggatgtc ctcgtgtgaa g 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Lysozyme-R

<400> 33

ccaatggaga atccctcaaa 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TLR1-F

<400> 34

cagagcgaat ggtgccacta t 21

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TLR1-R

<400> 35

gtggcagagg ctccagaaga 20

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TLR3-F

<400> 36

tggagcatca cagggataaa ga 22

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TLR3-R

<400> 37

tgatgcccat gcctgtaaga 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOD1-F

<400> 38

gtcgtctggc ttgtggagtg 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOD1-R

<400> 39

tgtcagcggg ctagtgctt 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gpx1a-F

<400> 40

gctttgaggc acaacagtca 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gpx1a-R

<400> 41

tctcccataa gggacacagg 20

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HSP70-F

<400> 42

aagcgacgaa ggatgcagga g 21

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HSP70-R

<400> 43

cacgttgcgc tctgaggatt 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TLR4a-F

<400> 44

tttcacaaga acaagccttt g 21

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TLR4a-R

<400> 45

tccacaagaa caagcctttg 20

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IAP-F

<400> 46

atgggagtgc cacggtttca g 21

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IAP-R

<400> 47

cgatgccaac agactttcct tg 22

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Bcl-2-F

<400> 48

aggaaaatgg aggttgggat g 21

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Bcl-2-R

<400> 49

tgttaggtat gaaaacgggt gga 23

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TNFα-F

<400> 50

accaggcctt ttcttcaggt 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TNFα-R

<400> 51

tgcccagtct gtctccttct 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> iNOs-F

<400> 52

ggagatgcaa ggtcagcttc 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> iNOs-R

<400> 53

ggcaaagctc agtgacttcc 20

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MyD88-F

<400> 54

aacaacttcg ctggataa 18

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MyD88-R

<400> 55

gttactggaa tcgcctca 18

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> aerA2-F

<400> 56

cgccagctgg tcaagactgt 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> aerA2-R

<400> 57

ccagttggtg gctgtgtcgt 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SH5-F

<400> 58

taacactctg tcccgcatgg 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SH5-R

<400> 59

ttaccccacc aacaagctga 20

Claims (9)

1.一株海洋链霉菌，其特征在于：名称为海洋链霉菌(Streptomyces sp.)SH5，于2021年11月12日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：62057。

2.一种基于权利要求1所述的海洋链霉菌制备得到的生物制剂。

3.根据权利要求2所述的生物制剂，其特征在于：

所述的生物制剂由权利要求1所述的海洋链霉菌经液体培养制备得到。

4.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于：

将权利要求1所述的海洋链霉菌接种至ISP1液体培养基中培养，即获得生物制剂。

5.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于：

所述的培养指在28～30℃，180～200rpm下培养48～72h。

6.权利要求1所述的海洋链霉菌或权利要求2～5任一项所述的生物制剂的应用，其特征在于：所述应用为下列应用之一：

1)所述的海洋链霉菌或所述的生物制剂在防控嗜水气单胞菌感染水生动物中的应用；

2)所述的海洋链霉菌或所述的生物制剂在水生动物肠道定植能力分析中的应用；

3)所述的海洋链霉菌或所述的生物制剂在提高水生动物免疫应答中的应用；

4)所述的海洋链霉菌或所述的生物制剂在调节嗜水气单胞菌在水生动物炎症反应过程中的应用；

5)所述的海洋链霉菌或所述的生物制剂在抑制嗜水气单胞菌在水生动物肠道定植中的应用；

6)所述的海洋链霉菌或所述的生物制剂在病原菌胁迫下降低水生动物炎症反应中的应用；

7)所述的海洋链霉菌或所述的生物制剂在抑制嗜水气单胞菌毒力因子生产及毒力基因表达中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述的水生动物为斑马鱼。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：

所述的病原菌为嗜水气单胞菌。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：

所述的毒力基因为aerA，act，ast，hlyA，alt，ahp，ahyR，ompA，fur。

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