CN114933997B - 一株珊瑚来源的共生链霉菌sh001及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001及包括所述共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001的防治水产病原菌的生防制品，该珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001及防治水产病原菌的生防制品对多种水产病原菌具有抑菌效果。本发明还公开了上述珊瑚来源的生防链霉菌(Streptomyces sp.)SH001或包括所述生防链霉菌(Streptomyces sp.)SH001的防治水产病原菌的生防制品在制备具有防治水产病原菌效果的药物方面的应用。

Description

一株珊瑚来源的共生链霉菌SH001及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株珊瑚来源的共生链霉菌SH001及其应用。
背景技术
水产养殖业早已发展为重要的经济支柱性产业。然而，水产养殖动物致病性细菌病害一直影响水产养殖业的健康发展。目前危害较大的致病菌是弧菌和链球菌，它们能感染鱼、贝、蟹以及甲壳类等多种水产动物，给水产养殖业带来严重危害，2019年该病害问题给我国水产行业带来了高达数百亿元的经济损失。部分弧菌对海洋无脊椎动物也有着一定的影响，例如溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)能够引起不同程度的珊瑚白化病，科学家预测，按照目前珊瑚礁的退化速度，到2100年全球的珊瑚礁生态***将基本消失。这些致病菌已经对渔业、生态、海岛与岛礁面积产生负面影响。在海水养殖动物弧菌病害防治中经常使用抗菌药物，然而随着抗菌药物的大量使用，许多病原弧菌耐药株不断增加，给水产动物病原弧菌的控制带来巨大挑战，今后很可能出现无药可用的境地。目前在防治海水养殖动物病原弧菌病害及其耐药性的综合措施中，研发新型抗菌药剂和微生物制剂仍是重要首要任务，这对有效防治海水养殖动物细菌病害发生、提高养殖效益以及增加渔民收入具有重要意义。
珊瑚(Croal)，属腔肠动物门(Coelenterata)珊瑚虫纲(Anthozoa)，是珊瑚虫分泌在先辈珊瑚的石灰质遗骨堆上的外壳，全世界约有7000种，均为海产。珊瑚不仅对海洋生态环境具有十分重要的影响，还具有十分高的药用价值，但据研究调查，其药用价值与珊瑚共生微生物代谢所产生的物质有关，其中，放线菌是一个重要分支，是抗生素的主要来源。海洋独特的高盐、高压、低温、低光或无光、寡营养的极端环境孕育了种类繁多的海洋放线菌，并具有丰富的化学多样性，珊瑚共生放线菌亦是如此。以海南三沙市西沙群岛海域的石珊瑚为研究对象，分离筛选可抑制珊瑚白化致病性弧菌、无乳链球菌和海豚链球菌的拮抗放线菌资源，为水产养殖动物弧菌病害及弧菌引起的珊瑚礁白化病防治和修复提供新资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一株珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001及包括所述共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001的防治水产病原菌的生防制品，该珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001及防治水产病原菌的生防制品对多种水产病原菌具有抑菌效果。
本发明的第二个目的在于提供上述珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001和/或包括所述共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001的防治水产病原菌的生防制品在制备具有防治水产病原菌效果的药物方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一株珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001，保藏编号为GDMCC No：62380，保藏日期为2022年04月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
本申请发明人采集海南省三沙市西沙海域的珊瑚，分离筛选获得一株能够有效抑制多种水产病原细菌的拮抗菌株，在本发明实施例中将其编号为链霉菌(Streptomycessp.)SH001。
本发明还提供了一种防治水产病原细菌的生防制品，包括所述珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001和/或所述珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001的发酵提取物。
优选的，所述的发酵提取物通过以下方法制备获得：
(1)将所述共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001经平板活化后接种至胰酪大豆胨液体培养基(TSB)中，在28℃以160rpm转速振荡培养3～5d；
(2)再分别以10％(体积百分含量)的接种量接种到对应的液体发酵培养基中，28℃，160rpm转速振荡培养12～15d，得到发酵液；
(3)用与发酵液同体积的乙酸乙酯萃取发酵液，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干，得到粗提取物，即得发酵提取物。
优选的，步骤(1)中所述的TSB培养基按照以下比例配备：胰酪胨17～19g/L,大豆木瓜蛋白酶水解物(市售)3～4g/L,氯化钠4～5g/L,磷酸氢二钾2～3g/L,葡萄糖2～3g/L，海盐17.5～35.0g/L，pH 7.0～7.3，以1L水作为基准，下文中培养基相同。
更佳的，步骤(1)中所述的菌株SH001的TSB培养基按照以下比例配备：胰酪胨17g/L,大豆木瓜蛋白酶水解物(市售)3g/L,氯化钠5g/L,磷酸氢二钾2.5g/L,葡萄糖2.5g/L，海盐17.5g/L，pH 7.3。
优选的，步骤(2)中所述菌株SH001液体发酵培养基按照以下比例配备：酵母浸粉3.0～5.0g/L，麦芽浸粉9.0～11.0g/L，葡萄糖3.0～5.0g/L，海盐17.0～18.0g/L，pH7.2±0.2。
更佳的，步骤(2)中所述菌株SH001液体发酵培养基按照以下比例配备：酵母浸粉4.0g/L，麦芽浸粉10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，海盐17.5g/L，pH7.2±0.2。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyce sp.)SH001和/或所述的生防制品在制备具有防治水产病原细菌效果的药物方面的应用。
优选的，所述水产病原菌包括美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中的一种或几种。
本发明还提供了一种生物防治方法，采用所述共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001和/或所述共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001的发酵提取物对水产养殖动物细菌病害进行生物防治。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明获得的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001对多种病原细菌病害比如美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)等防治潜力大，可将其发酵提取物用于防治水产养殖动物细菌病害药剂的原创性研发；
(2)本发明中的共生链霉菌株(Streptomyces sp.)SH001及其生防制品如发酵提取物等与化学药物相比较，具有无耐药性、无公害、低毒性、对环境友好等优点，更符合当下绿色环保理念。
附图说明
图1为实施例1中菌株SH001的菌落形态图(培养21天)；
图2为实施例2中菌株SH001及相关菌株的***发育树；
图3为实施例3中菌株SH001对美人鱼发光杆菌的抑制效果；
图4为实施例5中菌株SH001发酵提取物对美人鱼发光杆菌的抑制效果；
图5为实施例6中菌株SH001发酵提取物在40℃、50℃、60℃水浴1h下对美人鱼发光杆菌的抑制效果。
具体实施方法
实施例1菌株分离
从中国海南省三沙市西沙群岛海域采集珊瑚样品，采用梯度稀释涂布法，选用高氏一号合成培养基进行分离培养1个月，挑取菌株SH001至新鲜的ISP2培养基平板上纯化，于甘油管-20℃保存。
高氏合成一号培养基按以下按质量体积比例的组分配备：可溶性淀粉20.0g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，KNO31g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4 0.5g/L，琼脂15.0g/L，重铬酸钾0.05g/L，海盐17.5g/L，最终pH 7.3±0.2。
ISP2培养基按以下按质量体积比例的组分配备：酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂20g/L，海盐17.5g/L，pH7.2±0.2。
菌株SH001在ISP2培养基上生长良好，28℃培养3～5d时，菌落光滑，无孢子生成，10d后开始产生孢子，培养21d后孢子堆颜色接近灰白色，其菌落形态图如图1所示。
实施例2菌株SH001的分子鉴定
将实施例1中获得的放线菌SH001接种至ISP2平板上，于28℃培养14d，挑取单菌落至新鲜ISP2培养基上进行二次纯化，直接送交北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行16S rRNA基因序列测定。
菌株SH001的16S rRNA基因序列(具体如SEQ ID NO：1所示)为：
cgacggctccctcccagggttgggccaccggcttcgggtgttaccgactt
tcgtgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgca
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ctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggcacttaatgc
gttagctgcggcacggacgacgtggaatgtcgcccacacctagtgcccaa
cgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgc
tttcgctcctcagcgtcagtatcggcccagagatccgccttcgccaccgg
tgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccgatc
tcccctaccgaactctagcctgcccgtatcgactgcagacccggggttaa
gccccgggctttcacaaccgacgcgacaagccgcctacgagctctttacg
cccaataattccggacaacgctcgcgccctacgtattaccgcggctgctg
gcacgtagttagccggcgcttcttctgcaggtaccgtcactcacgcttct
tccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggc
gtcgctgcatcaggcttccgcccattgtgcaatattccccactgctgcct
cccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcgccctc
tcaggccggctacccgtcgtcgccttggtaggccatcaccccaccaacaa
gctgataggccgcgggctcatcctgcaccgccggagctttccaccaccag
ggatgcccccgatggtcatatccggtattagaccccgtttccagggcttg
tcccagagtgcagggcagattgcccacgtgttactcacccgttcgccact
aatcccctcccgaaagagg1369。
对上述序列进行BLAST相似性比对，选择相似度大于98％的菌株16S rRNA基因序列作为参比对象，在MEGA-X软件中进行多序列比对，通过邻接法进行聚类分析和构建***发育树(如图2所示)，鉴定为链霉菌属Streptomyces sp.，保藏编号为GDMCC No：62380，保藏日期为2022年04月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
实施例3菌株SH001的抗菌活性测定
以美人鱼发光杆菌、溶藻弧菌、无乳链球菌等病原细菌作为抗菌谱测定的供试菌。分别接种于LB液体培养基中，于恒温震荡箱中160r/min，28℃培养1d后，调整菌体浓度至OD600＝0.6～0.8，制成菌悬液备用。
LB液体培养基按以下按质量体积比例的组分配备：胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠5.0g/L，海盐35.0g/L，pH7.2±0.2。
将实施例1中获得的菌株SH001转入ISP2培养基培养，待菌株产生足量孢子后，通过平板对峙法培养测定抑菌活性：取0.5mL病原菌菌悬液与15mL的冷却至55℃的LB培养基倾注于平皿中充分混合，制备含菌平板。待平板凝固后，制备直径7mm的放线菌菌饼接种在含菌平板上，28℃恒温培养24h，每个处理重复3次。采用十字交叉法测量透明抑菌圈直径，求出菌株对病原细菌的抑菌圈大小。部分菌株的抑菌效果如图3所示，对各病原细菌的抑菌直径如下表1所示。
表1菌株SH001的抗菌活性
病原细菌 抑菌直径(mm)
美人鱼发光杆菌 14.5±0.4
溶藻弧菌 13.0±0.4
无乳链球菌 11.5±0.4
美人鱼发光杆菌、溶藻弧菌和无乳链球菌是引起海水养殖鱼虾病害的重要致病菌。从表1可以看出，菌株SH001对它们均具有较强的抑菌效果，其中对美人鱼发光杆菌抑制作用最强，抑制直径达到了14.5±0.4mm，表明该菌在防治上述病菌的绿色微生态制剂关键技术研发中具有重要开发前景。
实施例4菌株SH001的发酵及发酵提取物的制备
将实施例1中获得的菌株SH001经ISP2培养基平板活化，接种于TSB培养基中，于恒温振荡箱中28℃，160rpm振荡培养3d；按照10％(体积百分含量)接种量接种到1L ISP2液体发酵培养基中，28℃、160rpm振荡培养10d，得到发酵液；用等体积的乙酸乙酯(1L)萃取发酵液，反复萃取3遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，并在50℃下将其减压浓缩至干品，得到提取物(0.73g)，即为菌株SH001发酵提取物。
TSB培养基按以下按重量体积比例的组分配备：胰酪胨17.0g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L，海盐17.5g/L，pH 7.3±0.2(在1L水中加入这些成分，并调节pH值到7.3±0.2。其它培养基也是如此，下同)。
ISP2液体发酵培养基按以下按重量体积比例的组分配备：酵母浸粉4.0g/L，麦芽浸粉10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，海盐17.5g/L，pH7.2±0.2。
实施例5菌株SH001发酵提取物抗菌谱测定
以美人鱼发光杆菌、溶藻弧菌作为抗菌谱测定的指示菌。取20mg的实施例4制备的菌株SH001发酵提取物制成20mg/mL的待测样品。取0.5mL病原菌菌悬液与15mL的冷却至55℃的LB培养基倾注于无菌平皿中并充分混合，制备带菌平板。待平板凝固后，用100μL的灭菌枪头(直径5mm)在含菌平板上打3个孔，在3个孔内用移液枪分别滴加20μL的提取物，20μL的阳性对照卡那霉素(20mg/mL)以及20μL的阴性对照二甲基亚砜(DMSO)。部分抑菌效果如图4所示，对病原细菌的抑菌直径如下表2所示。
表2菌株SH001发酵提取物的抗菌活性
Figure BDA0003690327540000071
从表2可以看出，菌株SH001的发酵提取物对美人鱼发光杆菌和溶藻弧菌具有较强的抑菌活性，与阳性对照药的活性相当，其中对美人鱼发光杆菌的抑菌效果最强，达到18.33±0.23mm，表明菌株SH001的发酵提取物在防治上述病菌的抗菌药剂研发中具有重要潜力和开发前景。
测试菌株SH001发酵提取物对美人鱼发光杆菌，溶藻弧菌，无乳链球菌和海豚链球菌的最低抑菌浓度(MIC值)。将菌株SH001发酵提取物配置为1.3mg/mL的溶液，选用96孔板，每行第一孔打入160μLLB液体培养基和40μL待测溶液，其余孔洞加入100μL液体培养基。采用二倍稀释法依次稀释，最后每孔加入100μL病原菌液。放入恒温培养箱，28℃培养24～48h后观察记录。结果如表3所示。
表3菌株SH001发酵提取物的最低抑菌浓度(MIC值)
Figure BDA0003690327540000072
从表3可以看出，SH001发酵提取物对4种病原细菌均具有较强的抑菌活性，其中对美人鱼发光杆菌、溶藻弧菌和海豚链球菌的抑菌活性微弱于阳性对照；虽然该菌发酵提取物的活性与卡那霉素相当，但随着实际生产中的病原菌对卡那霉素以及其他药物的抗药性越来越强，水产养殖动物病害的防治越来越困难，挖掘新活性菌株和研发新抗菌药剂的急迫性越来越强，因此该菌的发现也为这些病原细菌的防治药剂研发提供了新机遇和基础资源。
实施例6菌株SH001发酵提取物抗菌活性的热稳定性
将实施例4获得的菌株SH001的发酵提取物配制成浓度为10mg/mL的待测样品，分别置于40℃、50℃、60℃下水浴1h。以美人鱼发光杆菌为指示菌，通过平板滤纸片法测定其抑菌活性：取0.5mL病原菌悬液与15mL的冷却至55℃的LB培养基倾注于平皿中充分混合，制备含菌平板。待平板凝固后，用灭菌的镊子将3个滤纸片(直径7mm)放在含菌平板上，在每个滤纸片上分别用移液枪滴加10μL的待测样品，10μL阳性对照卡那霉素(10mg/mL)和10μL阴性对照DMSO。每个温度测三个平行，放置于恒温培养箱中28℃培养24h，采用十字交叉法测量透明抑菌圈直径，求出菌株对病原细菌的抑菌圈大小。每个温度下的抑菌直径如下表4所示：
表4不同温度处理的发酵提取物的抑菌直径
Figure BDA0003690327540000081
菌株SH001发酵提取物在40℃、50℃、60℃水浴处理1h下对美人鱼发光杆菌的抑制效果如图5所示。
从表4和图5可以看出，菌株SH001的发酵提取物对美人鱼发光杆菌的抑菌作用比较稳定，温度变化对其影响较低。表明该发酵提取物抗美人鱼发光杆菌病菌活性具有较好的热稳定性，在防治水产病原细菌病害中可发挥稳定防效。
需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应认为是包括在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 一株珊瑚来源的共生链霉菌SH001及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1369
<212> DNA
<213> 共生链霉菌(Streptomyces sp.)
<400> 1
cgacggctcc ctcccagggt tgggccaccg gcttcgggtg ttaccgactt tcgtgacgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca gcaatgctga tctgcgatta 120
ctagcgactc cgacttcatg gggtcgagtt gcagacccca atccgaactg agaccggctt 180
tttgagattc gctccacctc acggcatcgc agctcattgt accggccatt gtagcacgtg 240
tgcagcccaa gacataaggg gcatgatgac ttgacgtcgt ccccaccttc ctccgagttg 300
accccggcgg tctcctgtga gtccccggca tgacccgctg gcaacacagg acaggggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca 420
cctgtacacc gaccacaagg ggggcaccat ctctgatgct ttccggtgta tgtcaagcct 480
tggtaaggtt cttcgcgttg cgtcgaatta agccacatgc tccgccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt tagccttgcg gccgtactcc ccaggcgggg cacttaatgc 600
gttagctgcg gcacggacga cgtggaatgt cgcccacacc tagtgcccaa cgtttacggc 660
gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt 720
atcggcccag agatccgcct tcgccaccgg tgttcctcct gatatctgcg catttcaccg 780
ctacaccagg aattccgatc tcccctaccg aactctagcc tgcccgtatc gactgcagac 840
ccggggttaa gccccgggct ttcacaaccg acgcgacaag ccgcctacga gctctttacg 900
cccaataatt ccggacaacg ctcgcgccct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960
agccggcgct tcttctgcag gtaccgtcac tcacgcttct tccctgctga aagaggttta 1020
caacccgaag gccgtcatcc ctcacgcggc gtcgctgcat caggcttccg cccattgtgc 1080
aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc 1140
ggtcgccctc tcaggccggc tacccgtcgt cgccttggta ggccatcacc ccaccaacaa 1200
gctgataggc cgcgggctca tcctgcaccg ccggagcttt ccaccaccag ggatgccccc 1260
gatggtcata tccggtatta gaccccgttt ccagggcttg tcccagagtg cagggcagat 1320
tgcccacgtg ttactcaccc gttcgccact aatcccctcc cgaaagagg 1369

Claims (4)

1.一株珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001，保藏编号为GDMCC No：62380，保藏日期为2022年04月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
2.一种防治水产病原细菌的生防制品，其特征是：包括权利要求1所述珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001和/或权利要求1所述珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001的发酵提取物；所述发酵提取物是将珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyces sp.)SH001的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，反复萃取3遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，并在50℃下将其减压浓缩至干品得到。
3.权利要求1所述的珊瑚来源的共生链霉菌(Streptomyce sp.)SH001或权利要求2所述的生防制品在制备具有防治水产病原细菌效果的药物方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述水产病原细菌包括美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中的一种或几种。
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