CN114292778A - 一种高效解钾解磷菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效解钾解磷菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的高效解钾解磷菌的分类学命名为枯草芽孢杆菌，菌株号为FTB‑K1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23346。本发明从牛粪中分离出的枯草芽孢杆菌FTB‑K1，具有较高的解钾解磷能力，可以增加土壤中有效钾、磷的含量，提高土壤中难溶性钾、磷的利用效率；能够分解钾长石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，能作为微生物肥料，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。在土壤中具有较高的存活率，能应用于实际农业生产中。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种高效解钾解磷菌及其应用。
背景技术
磷是植物生长发育过程中必不可少的元素之一，磷是构成磷脂和核蛋白的主要成分，是构建植物细胞的重要原料，植物许多生命活动如光合作用、呼吸作用、植物根对水分养分的吸收，以及糖、淀粉、油脂、蛋白质等多种物质的合成、转化等都必须有磷的参与。土壤中植物能够吸收利用的有效态磷只占全磷量的2％-3％，而大部分的磷不能直接被植物吸收，需要通过一系列的物理、化学和生物反应才能最终转化成能被植物利用的物质。土壤中磷是不可再生矿质资源，我国有1.3亿公顷的农田，74％的耕地中磷含量很高，但是有效磷的含量不到5％，而剩下的耕地则严重缺磷。
钾虽然不是构建植物体的必需元素，但钾是植物生命活动中一种极其重要的物质。钾主要集中在植物生命活动最活跃的器官或组织，如根尖、茎尖、幼叶、形成层等。钾可以促进碳水化合物的合成和运输，促进蛋白质的合成。植物体内含钾一般占干物质重的0.2％-4.1％，仅次于氮。然而，我国大部分耕地的土壤全氮含量都在0.2％以下，为缺氮土壤，土壤中可直接利用钾的含量只占全钾的2％-10％，其余90％以上的钾是以矿物钾的形式存在，如存在于长石和云母等硅酸盐矿物中，这些矿物化学性质稳定，只有从矿物中释放出来才能被植物吸收利用。
鉴于以上现实，本领域大多采用施用富含磷、钾化肥的方式以满足作物对营养元素的需求，但是大量施用化肥会造成环境污染、土壤板结、地力衰退、农产品品质降低、土壤微生物数量减少、生态恶化、耕地土壤生态***失衡等环境问题。因此，如何提高耕作田土壤中营养元素钾、磷的利用率，是本领域亟需解决的技术问题。从已有的文献报道来看，虽然已有相关解磷菌种和解钾菌种的报道，但是菌种的功效却差强人意，而且同时具备解钾、解磷功能的菌种较少，在土壤中的存活率也不高，不能应用于实际农业生产中。所以，筛选具有高效解钾解磷功能且可应用于实际农业生产中的野生菌株，对于我国农业的发展具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够降解土壤难溶无机磷、钾，为植物提供可以直接吸收的优质磷、钾素的一种高效解磷解钾菌，可应用于实际农业生产中。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种高效解钾解磷菌，所述高效解钾解磷菌的分类学命名为枯草芽孢杆菌，菌株号为FTB-K1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23346。
本发明还提供了一种上述高效解钾解磷菌在制备解钾和/或解磷微生物肥料中的应用。
本发明还提供了一种上述高效解钾解磷菌在土壤解钾和/或解磷中的应用。
优选的，使用所述高效解钾解磷菌的发酵液用于土壤解钾和/或解磷。
优选的，所述发酵液的施用量为0.4-0.8L/m2。
优选的，所述发酵液的制备方法包括如下步骤：将所述高效解钾解磷菌活化后，接种于发酵培养基中，29-33℃，培养23-30h。
优选的，所述活化的时间为24-28h。
优选的，所述活化用的活化培养基包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨10-14份，牛肉膏粉5-9份，氯化钠5-9份，琼脂12-16份，水1000-1400份，pH 7.2-7.4。
优选的，所述发酵培养基包括按照重量份数计的如下组分：豆饼粉12-18份、鱼粉4-10份、葡萄糖3-8份、复合无机盐2-4份、水1000-2000份，pH值6.8-7.3。
优选的，所述复合无机盐中(NH4)2SO4：K2HPO4：MnSO4·H2O：MgSO4·7H2O的重量比为8-12：1-4：1-3：1-3。
本发明的有益效果：
本发明从牛粪中分离出的枯草芽孢杆菌FTB-K1，具有较高的解钾能力，同时也具有很好的解磷能力，可以增加土壤中有效钾、磷的含量，提高土壤中难溶性钾、磷的利用效率；能够分解钾长石等不溶性的硅铝酸盐无机矿物质，促进难溶性的钾、硅、镁等养分元素转化成可溶性养分，能作为微生物肥料，增加土壤中速效养分的含量，促进作物生长发育，提高产量。
本发明枯草芽孢杆菌FTB-K1在土壤中具有较高的存活率，能应用于实际农业生产中，使用后有益微生物能够迅速定殖，分解活化难溶矿质元素，能将土壤中难溶性无机磷、钾转化为可供植物直接吸收利用的优质磷、钾素化合物，能大幅度提高土壤中难溶性磷、钾的生物有效性和磷、钾肥料养分利用率。
保藏说明
本发明枯草芽孢杆菌FTB-K1(Bacillus subtilis FTB-K1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年9月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23346。
附图说明
图1为FTB-K1的菌落形态图；
图2为显微镜下FTB-K1菌体图。
具体实施方式
本发明提供了一种高效解钾解磷菌，所述高效解钾解磷菌的分类学命名为枯草芽孢杆菌，菌株号为FTB-K1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23346。
本发明枯草芽孢杆菌FTB-K1是从河北省唐山市玉田县恒天然牧场牛粪中筛选获得的。对筛选获得的FTB-K1菌株经形态鉴定和16S rRNA测序分析，确定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FTB-K1。在琼脂营养培养基上30℃有氧培养18h，菌体可以大量生长，菌落形态结果如图1所示，菌落颜色为微黄色，表面粗糙不透明，边缘锯齿状，不规则。显微镜观察发现菌体椭圆，单个细胞0.7-0.8μm×2-3μm，无荚膜，周生鞭毛，能运动，芽孢0.6-0.9μm×1.0-1.5μm，位于菌体中央或稍偏，如图2所示。采用细菌16S rDNA通用引物如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示：
27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)
1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，其中M代表简并碱基，M＝A/C，即表明M为A或C，对菌株FTB-K1进行扩增和正向测序，得到的序列长度为1390bp，具体序列如SEQ IDNO.1所示。
将测序结果在NCBI数据库中进行比对，最终鉴定筛选获得的样品为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FTB-K1。
本发明还提供了一种上述高效解钾解磷菌在制备解钾和/或解磷微生物肥料中的应用。
本发明还提供了一种上述高效解钾解磷菌在土壤解钾和/或解磷中的应用。
使用本发明高效解钾解磷菌进行土壤解钾和/或解磷时，优选的是使用本发明枯草芽孢杆菌FTB-K1的发酵液，所述发酵液的施用量优选为0.4-0.8L/m2，更优选为0.5-0.7L/m2。
在本发明中，枯草芽孢杆菌FTB-K1发酵液的制备方法优选的包括如下步骤：将本发明高效解钾解磷菌活化后，接种于发酵培养基中，29-33℃，培养23-30h。
在本发明中，对枯草芽孢杆菌FTB-K1进行活化的时间优选为24-28h，更优选为25-27h。枯草芽孢杆菌FTB-K1菌种活化所用的活化培养基优选的包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨10-14份，牛肉膏粉5-9份，氯化钠5-9份，琼脂12-16份，水1000-1400份，pH7.2-7.4，更优选的包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨12-13份，牛肉膏粉7-8份，氯化钠7-8份，琼脂13-15份，水1100-1300份，pH 7.3。本发明对于上述各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
在本发明中，所述发酵培养基优选的包括按照重量份数计的如下组分：豆饼粉12-18份、鱼粉4-10份、葡萄糖3-8份、复合无机盐2-4份、水1000-2000份，pH值6.8-7.3，更优选的包括按照重量份数计的如下组分：豆饼粉14-16份、鱼粉6-8份、葡萄糖5-6份、复合无机盐3份、水1400-1600份，pH值7.1-7.2。本发明所述复合无机盐优选的由(NH4)2SO4、K2HPO4、MnSO4·H2O和MgSO4·7H2O组成，且四者的重量比优选为8-12：1-4：1-3：1-3，更优选为9-11：2-3：2：2。本发明对于上述各组分的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
在本发明中，所述发酵培养的温度优选为30-32℃，所述发酵培养的时间优选为25-28h，更优选为26-27h。本发明所述发酵培养优选的采用摇床培养，所述摇床的转速优选为90-130r/min，更优选为100-120r/min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
枯草芽孢杆菌FTB-K1的解钾能力测定
将枯草芽孢杆菌FTB-K1接种于蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂12g，水1000g，pH 7.2的活化培养基中，活化24h，然后接种于豆饼粉12g、鱼粉4g、葡萄糖3g、复合无机盐((NH4)2SO4：K2HPO4：MnSO4·H2O：MgSO4·7H2O)的重量比为8：1：1：1)2g、水1000g，pH值6.8的发酵培养基中，29℃，90r/min培养25h，得菌悬液。
配制解钾培养基(无水溶性钾离子)：葡萄糖5g、硫酸铵0.5g、酵母粉0.5g、硫酸镁0.3g、磷酸氢二钠2g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.03g、钾长石2g(含钾量11％-13％)、蒸馏水1L，搅拌均匀，调pH值至7.2，121℃高温灭菌15min。
500mL三角瓶，每瓶分装100mL解钾培养基，加入5mL菌悬液，以未接种菌悬液的为对照，每个处理重复5次。29℃、90r/min摇床培养10d后结束培养，培养液经4500r/min离心20min，收集上清液，加2mL 6％H2O2消煮1h，再离心，取上清液。用电感耦合等离子体光谱法测定上清液中水溶性钾含量，与对照处理进行比较，计算解钾菌的解钾量。
解钾量(mg/L)＝菌悬液中K+含量-对照液中K+含量。
得出实验组水溶性钾离子含量为150-170mg/L，对照组水溶性钾离子含量趋近于0，解钾率达68％以上，具有较强的解钾能力。
实施例2
枯草芽孢杆菌FTB-K1的解磷能力测定
枯草芽孢杆菌FTB-K1菌悬液的制备过程同实施例1。在250ml三角瓶中分别加入100ml无机磷液体培养基，培养基成分为葡萄糖10g、硫酸镁0.5g、硫酸氨0.5g、碳酸钙0.1g、氯化亚铁0.005g、磷酸三钙5g、水1000ml。再接种2ml菌悬液作为实验组，对照组不接种菌悬液，接种2ml水，所有处理均进行3次重复。在32℃，140rpm分别振荡5d，将培养液在12000r/min下离心10min，通过钼锑抗比色法测定解磷量(水溶性磷含量)。结果如表1所示。
表1枯草芽孢杆菌FTB-K1解磷量
由表1可以看出，枯草芽孢杆菌FTB-K1能够用于解磷且解磷效果好。
实施例3
将枯草芽孢杆菌FTB-K1接种于蛋白胨14g，牛肉膏粉9g，氯化钠9g，琼脂16g，水1400g，pH 7.4的活化培养基中，活化28h，然后接种于豆饼粉18g、鱼粉10g、葡萄糖8g、复合无机盐((NH4)2SO4：K2HPO4：MnSO4·H2O：MgSO4·7H2O)的重量比为12：4：3：3)4g、水2000g，pH值7.3的发酵培养基中，33℃，130r/min培养28h，得实验组发酵液。
对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加枯草芽孢杆菌FTB-K1。
在唐山市玉田县选取100m2小麦种植田，平均分成四块试验田，其中2块设定为实验组(按照0.4L/m2的施用量施用实验组发酵液)，2块设定为对照组(按照0.4L/m2的施用量施用对照组发酵液)，实验组和对照组均在小麦分蘖期进行施肥，实验组与对照组除了施用的发酵液不同外，其余田间管理等条件均相同。在小麦成熟期检测小麦产量等各指标，结果如表2所示。
表2枯草芽孢杆菌FTB-K1对小麦产量的影响
由表2可以看出，本发明发酵液可以提高农作物产量。
实施例4
将枯草芽孢杆菌FTB-K1接种于蛋白胨13g，牛肉膏粉8g，氯化钠8g，琼脂15g，水1300g，pH 7.3的活化培养基中，活化25h，然后接种于豆饼粉16g、鱼粉8g、葡萄糖6g、复合无机盐((NH4)2SO4：K2HPO4：MnSO4·H2O：MgSO4·7H2O)的重量比为9：2：2：2)3g、水1600g，pH值7.2的发酵培养基中，32℃，120r/min培养26h，得实验组发酵液。
对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加枯草芽孢杆菌FTB-K1。
在唐山市玉田县选取50m2甜瓜种植田，平均分成5块试验田，其中3块设定为实验组(按照0.7L/m2的施用量施用实验组发酵液)，2块设定为对照组(按照0.7L/m2的施用量施用对照组发酵液)，实验组和对照组均在甜瓜坐果3天后施肥，实验组与对照组除了施用的发酵液不同外，其余田间管理等条件均相同。在甜瓜成熟期检测甜瓜维生素C和硝酸盐含量，结果如表3所示。
表3枯草芽孢杆菌FTB-K1对甜瓜产量和品质的影响
| 处理 | 维生素C含量(mg/100g) | 硝酸盐含量(mg/100g) | 产量(kg/亩) |
| 实验组 | 9.2±0.4 | 13.2±0.3 | 4333.6±19 |
| 对照组 | 4.0±0.3 | 22.5±0.1 | 1800.1±22 |
由表3可以看出，本发明发酵液在提高农作物产量的同时还能提高农作物的品质，与未使用本发明菌剂的对照组相比，本发明的枯草芽孢杆菌FTB-K1可使甜瓜的维生素C含量提高一倍多，可使硝酸盐含量降低41.3％。
实施例5
实验组发酵液的制备过程同实施例3，对照组发酵液的制备过程与实验组发酵液相同，区别仅在于对照组中未添加枯草芽孢杆菌FTB-K1。
在唐山市玉田县选取100m2玉米种植田，平均分成5块试验田，试验设5个处理，其中处理1未施肥料即为空白对照，处理2按照0.9L/m2的施用量施用对照组发酵液，处理3施用本领域普通玉米专用肥0.05kg/m2，处理4施用本领域普通玉米专用肥0.05kg/m2和按照0.9L/m2的施用量施用实验组发酵液，处理5施用本领域玉米专用肥0.025kg/m2和按照0.9L/m2的施用量施用实验组发酵液。上述玉米专用肥由尿素70kg，磷酸二氢钾30kg，硝酸钾60kg，2,4-D 1kg，4-碘苯氧乙酸1kg、硼砂1kg，钼酸铵1kg，硫酸锌1kg，硫酸铜1kg，硫酸锰1kg，硫酸亚铁1kg组成。5个处理组均在春播时进行一次性施肥，除了施肥不同外，其余田间管理等条件均相同。在玉米成熟期检测玉米产量，结果如表4所示。
表4枯草芽孢杆菌FTB-K1对玉米产量的影响
| 组别 | 产量(kg/亩) |
| 处理1 | 533.4 |
| 处理2 | 733.4 |
| 处理3 | 1400.1 |
| 处理4 | 2133.4 |
| 处理5 | 1533.4 |
由表4可知，本发明枯草芽孢杆菌FTB-K1菌剂与肥料混施，能够提高玉米的产量，当减施50％质量的普通玉米专用肥时，依然能够提高玉米的产量，说明本发明菌剂可以有效减少化肥的施用量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 沣田宝农业科技有限公司
<120> 一种高效解钾解磷菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc 120
acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac 180
ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240
ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt 300
agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360
cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgcccccga 420
agggggacgt cctattctct agggattggt cagaggatgt caagacctgg taaggttctt 480
cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt 540
tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca 600
ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg 660
tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag 720
tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt 780
ccactctcct cttctgcact caagttcccc agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg 840
ggggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgagccc tttacgccca ataattccgg 900
acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct 960
ggttaggtac cgtcaaggta ccgccctatt cgaacggtac ttgttcttcc ctaacaacag 1020
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attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140
tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgttgc cttggtgagc cgttacctca 1200
ccaactagct aatgcgccgc gggtccatct gtaagtggta gccgaagcca ccttttatgt 1260
ttgaaccatg cggttcaaac aaccatccgg tattagcccc ggtttcccgg agttatccca 1320
gtcttacagg caggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaacat cagggagcaa 1380
gctcccatac 1390
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> mutation
<222> (10)..(10)
<223> m=A/C
<400> 2
agtttgatcm tggctcag 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (10)
1.一种高效解钾解磷菌，其特征在于，所述高效解钾解磷菌的分类学命名为枯草芽孢杆菌，菌株号为FTB-K1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23346。
2.权利要求1所述高效解钾解磷菌在制备解钾和/或解磷微生物肥料中的应用。
3.权利要求1所述高效解钾解磷菌在土壤解钾和/或解磷中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，使用所述高效解钾解磷菌的发酵液用于土壤解钾和/或解磷。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液的施用量为0.4-0.8L/m2。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括如下步骤：将所述高效解钾解磷菌活化后，接种于发酵培养基中，29-33℃，培养23-30h。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述活化的时间为24-28h。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述活化用的活化培养基包括按照重量份数计的如下组分：蛋白胨10-14份，牛肉膏粉5-9份，氯化钠5-9份，琼脂12-16份，水1000-1400份，pH 7.2-7.4。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括按照重量份数计的如下组分：豆饼粉12-18份、鱼粉4-10份、葡萄糖3-8份、复合无机盐2-4份、水1000-2000份，pH值6.8-7.3。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述复合无机盐中(NH4)2SO4：K2HPO4：MnSO4·H2O：MgSO4·7H2O的重量比为8-12：1-4：1-3：1-3。
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| CN114292778B (zh) | 2023-06-06 |
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