CN110591963B - 一株耐盐碱马氏芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱马氏芽孢杆菌及其应用。本发明的耐盐碱马氏芽孢杆菌(Bacillus marmarensis)分离自重度盐碱地区芦苇根际土壤，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18299。该菌株的耐盐碱能力较强，具有产生嗜铁素、分解蛋白质、溶解无机磷、拮抗多种植物病原真菌(玉米小斑病菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐皮镰刀菌)和促进作物生长的作用，可用于生产微生物肥料，特别是盐碱地专用微生物肥料。

Description

一株耐盐碱马氏芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一株耐盐碱马氏芽孢杆菌及其应用。

背景技术

盐碱地是我国重要的土地资源，具有巨大的开发潜力。据农科院南京土壤所报道，我国盐碱地和盐碱障碍耕地总面积超过5亿亩，其中具有农业利用潜力的多达2亿亩，占中国耕地面积的10％左右，主要分布在我国西北、东北及东部沿海地区。合理开发利用盐碱地，对保障我国粮食安全、促进农业可持续发展、改善生态环境及推动区域经济协调发展具有重要意义。

生物肥料在盐碱地生物改良中扮演着重要角色，它不仅具有促进植物生长、拮抗病原菌、缓解重茬效应、增加作物产量与质量等作用，还具有改良土壤、提高肥力、改善生态等作用。生物肥料中的有效微生物能否适应盐碱环境并在盐碱土壤中大量繁殖是决定其有效性的重要因素。针对盐碱土壤的特点，筛选能够耐受盐碱环境的功能性微生物，研发盐碱地专用生物肥料具有重要意义。

从盐碱土壤中分离耐盐碱抗病促生菌，可以提高功能菌在土壤中的定植率，提高防治效果。本发明从盐碱土壤中分离出了一株具有抗病促生功能的耐盐碱马氏芽孢杆菌(Bacillus marmarensis)YJJK-4，并将其用于制备盐碱地专用生物肥料。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有抗病与促生作用的耐盐碱马氏芽孢杆菌(Bacillusmarmarensis)YJJK-4及其应用。该菌株的耐盐碱能力强，具有拮抗玉米小斑病菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐皮镰刀菌等多种植物病原菌、分解蛋白质、产生嗜铁素、溶解无机磷、促进作物生长等作用，可以用于制备盐碱地专用生物肥料。

本发明提供了一株具有抗病促生作用的耐盐碱马氏芽孢杆菌(Bacillusmarmarensis)YJJK-4，该菌株分离自重度盐碱地区芦苇根际土壤，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.18299；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年7月26日。

所述耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4菌株的菌落及菌体特征：在DSMZ31培养基上于30℃培养24h后，菌落呈淡黄色，半透明，菌落较小，圆形或椭圆形，表面光滑，中间凸起，边缘整齐；菌体为杆状，大小为0.8-1.1×2-2.5μm，产芽孢，革兰氏阳性。

所述耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的生理生化特征：甲基红试验阳性、吲哚试验阴性、v-p试验阴性、淀粉水解试验阴性、酪素水解试验阳性、明胶液化试验阳性、甘露糖试验阳性、L-***糖试验阳性、D-木糖试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、氧化酶试验阴性、接触酶试验阳性、运动性试验阳性、厌氧生长试验阴性。

所述耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4具有产生嗜铁素、分解蛋白质、溶解无机磷、拮抗多种植物病原菌(玉米小斑病菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐皮镰刀菌)、促进作物生长的作用。

本发明公开了耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4作为农用微生物菌剂的制备方法与应用。所述的菌剂为以耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4为主要有效成分的活菌制剂。

上述活菌制剂的制备方法：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4经扩大培养(LB培养基)后，接种于固体发酵培养基，30～35℃培养48-72h，低温烘干、粉碎，即为活菌制剂。

所述固体发酵培养基的配方为：金针菇菌糠30％、麸皮68％、硫酸铵1.0％、氢氧化钙1.0％、初始水分含量50～55％。

耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4活菌制剂的使用方法：每亩用菌剂200-1000克，加水稀释100-1000倍，可用于灌根、蘸根、拌种，也可作为底肥施入。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：本发明提供的耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4菌株耐盐碱能力强，具有促进作物生长、拮抗玉米小斑病菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐皮镰刀菌等多种植物病原菌、分解蛋白质、产生嗜铁素、溶解无机磷等的作用，适用于开发盐碱地专用微生物肥料。

附图说明

图1为耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4在碱性营养琼脂培养基上的生长状况。

图2为耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的分解蛋白的能力检测图片。

图3为耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的溶解无机磷的能力检测图片。

图4为耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4对植物病原真菌的拮抗作用；其中，A玉米小斑病菌；B串珠镰刀菌；C尖孢镰刀菌；D茄腐皮镰刀菌。

图5为耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4对玉米生长的促进作用。

图6为耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4基于16S rDNA部分序列构建的***发育树。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述试验中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述试验中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂。以下试验，均设置三次或三次以上重复实验，结果取平均值。

实施例1：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的分离

称取10g取自山东东营重度盐碱地区芦苇根际土壤，置于含有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，在培养摇床上剧烈振荡30min，吸取1mL悬液，用无菌水进行梯度稀释，然后涂布于高盐碱选择性培养基平板中，于30℃培养24-48h。挑取单菌落进行划线纯化，制成甘油保藏管于-80℃中保存。将筛选出的耐盐碱菌株命名为YJJK-4。

所述高盐碱选择培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、复合无机盐(NaCl∶KCl∶MgCl₂＝10∶1∶1)30g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH9.0，121℃灭菌20min。

实施例2：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的鉴定

(1)形态与生理生化特征

菌落及菌体特征：在DSMZ31培养基上于30℃培养24h后，菌落呈淡黄色，半透明，菌落较小，圆形或椭圆形，表面光滑，中间凸起，边缘整齐；菌体为杆状，大小为0.8-1.1×2-2.5μm，产芽孢，革兰氏阳性。所述DSMZ 31培养基为碱性营养琼脂，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml、用碳酸钠溶液调至pH 9.7。其在碱性营养琼脂培养基上的生长状况如图1所示。

生理生化特征：甲基红试验阳性、吲哚试验阴性、v-p试验阴性、淀粉水解试验阴性、酪素水解试验阳性、明胶液化试验阳性、甘露糖试验阳性、L-***糖试验阳性、D-木糖试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、氧化酶试验阴性、接触酶试验阳性、运动性试验阳性、厌氧生长试验阴性。

(2)16S rDNA序列分析

采用CTAB/NaCl方法提取分离菌株DNA。

根据原核生物16S rDNA保守序列通用引物，利用细菌通用引物27-F/1492-R对B6基因组模板进行16SrDNA基因PCR扩增。通用引物其正向序列为27-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向序列为1492-R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min(共30个循环)；72℃10min，4℃无限循环。将PCR所得产物送至上海生工进行DNA序列测定，所得序列如序列表SEQ-1所示。将序列在NCBI数据库中进行BLAST序列分析。同时，根据构建的***发育树(见图6)，确定菌株YJJK-4为马氏芽孢杆菌(Bacillus marmarensis)。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.18299；保藏日期为2019年7月26日。

实施例3：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4分解蛋白的能力测定

定性测定：采用透明圈法。将YJJK-4菌株点种到脱脂奶粉培养基平板上，30℃恒温培养24h，观察菌落周围是否有透明晕圈出现，出现透明晕圈则说明该菌有分解蛋白质的能力。所述脱脂奶粉培养基的配方为：磷酸二氢钾10.0g，氯化钾1.5g，蔗糖5.0g，胰蛋白胨5.0g，脱脂奶粉10.0g，琼脂15.0g，水1000mL，pH7.0。

定量测定：对其产生的透明圈及菌落半径进行测量，并计算透明圈与菌落半径比值(HC)。

检测结果表明，耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4菌落周围能形成无色透明晕圈(如图2所示)。透明圈与菌落的半径比(HC)值为5.89，说明其具有较强的分解蛋白质的能力。

实施例4：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4溶解无机磷的能力测定

定性测定：将菌株点接种到NBRIP培养基固体平板上，30℃培养2-3d，观察菌落周围是否有透明晕圈出现，出现透明晕圈则说明该菌有溶解无机磷的能力。所述NBRIP培养基即解磷培养基，其配方为：葡萄糖10g、磷酸钙5g、氯化镁5g、七水硫酸镁0.25g、氯化钾0.2g、硫酸铵0.1g、水1000mL、pH7.0。

定量测定：采用钼锑抗法。将菌株接种到NBRIP液体培养基中，30℃摇床培养(180r/min)5d，菌液于10000r/min离心10min，取上清50μL，加入2.5mL钼锑抗混合显色剂，定容至50mL，反应30min，660nm测吸光值。对照为去离子水与钼锑抗混合显色剂反应。

检测结果表明，耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的菌落周围能形成无色透明晕圈(如图3所示)。发酵液内有效磷含量为82.05μg/mL，这说明菌株YJJK-4具有溶解无机磷的能力。

实施例5：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4产嗜铁素的能力测定

本发明在研究中发现耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4可以产嗜铁素，为了验证其产嗜铁素的能力，本发明采用王平等(1994)描述的定量检测法(王平,董飚,李阜棣,胡正嘉.小麦根圈细菌铁载体的检测[J].微生物学通报,1994(06):323-326)对耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4产嗜铁素的能力进行测定，样品中嗜铁素的相对含量为A/Ar，该值越小，说明合成嗜铁素的能力越强。

检测结果：A/Ar值为0.48，说明菌株YJJK-4合成嗜铁素的能力较强。

实施例6：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4对植物病原真菌的拮抗作用

采用对峙培养法。在PDA平板中央接种直径为8mm的病原真菌的菌饼(A玉米小斑病菌；B水稻恶苗病病原菌——串珠镰刀菌；C番茄枯萎病病原菌——尖孢镰刀菌；D茄腐皮镰刀菌)，在以菌饼中心为圆心，半径为3cm的圆周上均匀点种YJJK-4菌株3-5个，以不接种YJJK-4菌株的处理为对照，28℃培养7-8d，测定真菌菌落直径或半径。抑菌活性采用抑制率来表示，其计算公式如下：

抑菌率＝[(R-r)/R]×100％。

式中：R为对照平板上病原菌菌落半径；r为YJJK-4菌株与病原菌对峙处的病原菌菌落半径。

结果如图4所示，耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4对受试的四种病原真菌均有不同程度的拮抗作用，统计结果如表1：

表1耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4对植物病原真菌的抑制作用

实施例7：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4活菌制剂的制备

1)制备一级种子：将所述耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的试管斜面菌种转接至LB固体培养基中，30℃培养20-24h，即为一级种子。所述LB固体培养基的配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂20g、水1000mL，pH7.0。

2)制备二级种子：将一级种子转接入LB液体培养基中，于30-35℃培养20-24h，即为二级种子。所述LB液体培养基的配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、水1000mL，pH7.0。

3)发酵培养：将二级种子以2-5％的接种量转接入固体发酵培养基中，30～35℃培养48-72h，然后于40～45℃低温烘干，粉碎至60-80目，即为耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的活菌制剂。菌剂中耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4的活菌数为(5～6)×10⁹cfu/g，芽孢生成率为86％～93％。所述固体发酵培养基的配方为：金针菇菌糠30％、麸皮68％、硫酸铵1％、氢氧化钙1.0％、初始水分含量50～55％。

所述发酵培养基的制备方法为：将金针菇菌糠与麸皮按比例混匀，硫酸铵和氢氧化钙分别配成溶液，先将氢氧化钙溶液倒入金针菇菌糠与麸皮的混合物中，搅拌均匀，再将硫酸铵溶液倒入，搅拌均匀。

所述金针菇菌糠为金针菇采收后剩余的培养基，其营养成分为：粗蛋白11-13％、粗纤维20-24％、粗脂肪2-4％、灰分10-13％、水分10-15％。

耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4活菌制剂的使用方法：每亩用菌剂200-1000克，加水稀释100-1000倍，可用于灌根、蘸根、拌种，也可作为底肥施入。

实施例8：耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4菌剂的促生作用

供试土壤取自山东省东营市垦利区，土壤类型为滨海盐渍土，pH8.01，全盐含量2.21‰，有机质含量7.4g/kg，全氮含量719mg/kg，速效氮含量52.6mg/kg，速效磷含量22.54mg/g，速效钾含量79.54mg/g。盆栽试验设菌剂处理组(T)和对照组(CK)等2个处理，每个处理设3个平行，每个平行设10个盆栽幼苗。以玉米为供试作物。

选取大小基本一致颗粒饱满的玉米种子，用0.5％(体积比)的次氯酸钠进行表面消毒，然后用蒸馏水冲洗干净、播种。出苗后，菌剂处理组T每株幼苗灌根耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4活菌制剂500倍稀释液50mL(活菌浓度1×10⁷cfu/mL)；对照组CK每株幼苗灌根预灭菌的耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4活菌制剂500倍稀释液50mL。10d后，测定株高、干重和叶绿素含量，结果如表2所示。与对照相比，施用耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4活菌制剂的处理，玉米幼苗的株高、干重和叶绿素含量均显著提高(如图5所示)，这说明该菌剂对玉米具有较好的促生作用。

表2耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4菌剂对玉米幼苗株高、干重及叶绿素含量的影响

注：同列不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东佐田氏生物科技有限公司

<120> 一株耐盐碱马氏芽孢杆菌及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 马氏芽孢杆菌（Bacillus marmarensis）的16S rDNA 序列

<400> 1

tgcagtgggg gagctataat gcagtcgagc ggactgatgg gagcttgctc cctgatgtta 60

gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120

aaccggggct aataccggat aacccgttcc acctcatggt ggagcggtaa aagatggcct 180

ctggctatca cttacagatg ggcccgcggc gcattagcta gttggtaagg taacggctta 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gtttgaataa ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagcgcg cgcaggcggt ctcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 600

gggtcattgg aaactgggag acttgagtac agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtatatatgt ggacgaacac cactggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

cctgaccctg acgcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tacataccct ggtagtccac 780

gccgtaaaca ttgag 795

Claims (9)

1.一株耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.18299。

2.权利要求1所述的耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4在拮抗植物病原菌方面的应用，所述植物病原菌包括玉米小斑病菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐皮镰刀菌。

3.权利要求1所述的耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4在产生嗜铁素、分解蛋白质、溶解无机磷方面的应用。

4.权利要求1所述的耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4在促进玉米生长方面的应用。

5.一种以权利要求1所述的耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4为主要有效成分的活菌制剂。

6.权利要求5所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，权利要求1所述的耐盐碱马氏芽孢杆菌YJJK-4经扩大培养后，接种于固体发酵培养基，30~35℃培养48-72h，低温烘干、粉碎，得到活菌制剂；

所述固体发酵培养基为：按重量比计，金针菇菌糠30%、麸皮68%、硫酸铵 1.0%、氢氧化钙 1.0%，初始水分含量 50~55%。

7.权利要求5所述的活菌制剂在拮抗植物病原菌方面的应用，所述植物病原菌包括玉米小斑病菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐皮镰刀菌。

8.权利要求5所述的活菌制剂在产生嗜铁素、分解蛋白质、溶解无机磷方面的应用。

9.权利要求5所述的活菌制剂在促进玉米生长方面的应用。

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