CN117683669A

CN117683669A - 一株罗伊氏乳杆菌及其应用

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Publication number: CN117683669A
Application number: CN202311678074.6A
Authority: CN
Inventors: 韩冰; 王金全; 赵亚; 梁书坤; 王秀敏; 王振龙; 陶慧; 刘杰
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-12-08
Filing date: 2023-12-08
Publication date: 2024-03-12

Abstract

本发明提供了一株罗伊氏乳杆菌及其应用。本发明的罗伊氏乳杆菌，名称为罗伊氏乳杆菌20‑6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27590。该菌株具有良好的生长性能，对胃液、肠液的耐受性强，促进犬肠道有益菌的增殖，抑制有害菌的增长，有效调节脂质代谢，增强宠物犬机体免疫功能，对腹泻有一定的改善功能，效果优于市场同类产品，可作为益生菌制剂的备选菌株，应用前景十分广阔。

Description

一株罗伊氏乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种罗伊氏乳杆菌及其应用。

背景技术

益生菌通过改善宿主动物的肠道微生态平衡而有益地影响宿主动物健康，很多有益的益生菌菌株被成功开发和验证，其中大多来源与人类肠道、乳制品或植物表面，已在食品或饲料中广泛应用。现有专利对于罗伊氏乳杆菌应用有很多：在小鼠、猪、山羊上可以起到改善动物***品质，提高雄性动物繁殖力；以罗伊氏乳杆菌为主，添加双歧杆菌、卵形拟杆菌、屎肠球菌等做复合剂降低血糖；针对猫或犬改善腹泻作用大多是以益生菌复合剂应用为主，复合剂中包括乳杆菌、芽孢杆菌及其他营养物质，改善肠道菌群调控胃环境，提高乳酸菌在胃肠道的含量进而改善腹泻。2013年，我国农业部批准罗伊氏乳杆菌作为益生菌可用作饲料添加剂应用于动物养殖。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)广泛存在于人和动物肠道中，可抑制胃肠道病原菌繁殖，调节动物免疫机能，降低动物应激，减少动物发病率，调节肠道菌群，预防或减轻腹泻，同时还具有提高饲料利用率，促进动物生长，降低料重比等重要作用。目前，关于罗伊氏乳杆菌的研究主要是抑制有害菌、改善肠胃环境、预防肠道疾病，与其他菌联合促进生长、调节机体免疫，关于防治腹泻罗伊氏乳杆菌的研究多为复配几种乳酸杆菌益生菌，但对于罗伊氏乳杆菌单一针对腹泻的作用研究较少，且大多腹泻研究中罗伊氏乳杆菌为猪源、鸡源和猫源，犬源罗伊氏乳杆菌改善腹泻研究甚少。

益生菌是添加到日粮中以对宿主产生有益作用的微生物制剂。选择益生菌作为饲料添加剂的一个重要标准是宿主特异性。主要原因在于益生菌对上皮细胞的粘附具有宿主特异性，定植后的益生菌通过诱导后肠中短链脂肪酸(SCFA)的生成来实现最佳的粘膜免疫效果，同时促进宿主营养物质吸收以及抑制致病性微生物的定植，从而在肠道屏障功能中发挥重要的健康促进作用。同时，添加的微生物不应干扰肠道原籍菌，因为原籍菌已经适应了胃肠道环境，与宿主互惠互生。不同种属动物肠道微生物组成与食物属性高度相关，在大多数发展中国家宠物犬主要依靠不同成分的自制食物饲养，对犬科动物源有益微生物开发研究非常有限。目前在犬科动物，包括宠物犬饲养方面广泛使用的益生菌主要是非犬源益生菌，菌种主要依赖进口，应用效果差异巨大且不稳定。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一株罗伊氏乳杆菌及其应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案。

本发明的罗伊氏乳杆菌，名称为罗伊氏乳杆菌20-6，分离子健康成年犬粪便，菌株培养24h后，菌落中间凸起，边缘整齐，表面光滑；兼性厌氧，革兰氏阳性，细胞呈杆状。所述罗伊氏乳杆菌于2023年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.27590。

本发明还提供一种菌剂，所述菌剂包括本发明的罗伊氏乳杆菌。

本发明的罗伊氏乳杆菌或菌剂在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种用于调节肠道菌群的产品，活性成分包括本发明的罗伊氏乳杆菌或菌剂。

上述应用和产品中，所述调节肠道菌群包括如下(a)-(c)中任一种：

(a)抑制大肠杆菌；

(b)抑制伤寒沙门氏菌；

(c)抑制金黄色葡萄球菌。

本发明的罗伊氏乳杆菌或菌剂在制备抗菌药物中的应用也属于本发明的保护范围。

进一步地，所述菌为细菌或真菌

优选地，所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性细菌；

优选地，所述细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或金黄葡萄球菌中的至少一种。

本发明中的罗伊氏乳杆菌或菌剂在制备食品添加剂或动物饲料添加剂中的应用。

本发明中的罗伊氏乳杆菌或菌剂在制备改善动物(如犬科动物、小鼠等)腹泻的药物的应用。

所述的罗伊氏乳杆菌在调节动物脂质代谢或制备调节动物脂质代谢的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的保藏编号为CGMCC NO.27590的罗伊氏乳杆菌20-6是发明人首次从健康犬粪便中分离获得的动物源罗伊氏乳杆菌菌株。该菌株具有良好的生长性能，对胃液、肠液的耐受性强，促进犬肠道有益菌的增殖，抑制有害菌的增长，增强宠物犬机体免疫功能，对腹泻有一定的改善功能，并能调节动物脂质代谢，效果优于市场同类产品，可作为益生菌制剂的备选菌株，应用前景十分广阔。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1罗伊氏乳杆菌菌落形态图；

图2为本发明实施例1中罗伊氏乳杆菌基于16S rRNA基因序列比对结果；

图3为本发明实施例3中罗伊氏乳杆菌生长曲线和产酸曲线。

生物材料保藏

保藏编号：CGMCC NO.27590

名称：罗伊氏乳杆菌20-6

分类命名：罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri

是否存活：存活

保藏时间：2023年06月09日

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明提供的罗伊氏乳杆菌于2023年6月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.27590，拉丁名：Lactobacillus reuteri。

本发明提供的罗伊氏乳杆菌在人工胃液、人工肠液以及胆盐环境中均具有较强的耐受性，同时，该菌株具有很强胃肠道定植能力，可以满足在机体内发挥作用的基本要求。此外，发明人研究发现，该菌株对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑制作用，可以降低犬血脂含量，减少犬发生高血脂等心脑血管疾病的风险，同时改善肝脏功能，同时，可以显著增加犬肠道有益菌数量，可以作为调节肠道菌群、改善肠道功能的益生菌应用于食品和药物等领域，应用前景十分广阔。

本发明的一种菌剂，包括本发明的罗伊氏乳杆菌。

本发的罗伊氏乳杆菌或菌剂在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种用于调节肠道菌群的产品，活性成分包括本发明的罗伊氏乳杆菌或菌剂。例如用于调节肠道菌群的产品具有如下(a)-(c)中任一种功能：(a)抑制大肠杆菌；(b)抑制鼠伤寒沙门氏菌；(c)抑制金黄色葡萄球菌。

本发明还保护罗伊氏乳杆菌或菌剂在制备抗菌药物中的应用。其中，菌为细菌或真菌；例如细菌为***或革兰氏阴性细菌。

进一步地，细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或金黄色葡萄球菌中的至少一种。

进一步地，抗菌药物中除了罗伊氏乳杆菌还包括辅料。辅料的作用可为赋形、充当载体、提高稳定性、增溶、助溶、缓释等等。

本发明还保护罗伊氏乳杆菌或菌剂在制备食品添加剂或动物饲料添加剂中的应用，以及，改善小鼠腹泻的应用。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于任何形式限制本发明。

实施例1、犬科动物源罗伊氏乳杆菌的分离鉴定

(Ⅰ)分离用培养基：MRS培养基，培养基成分(每升)如下：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,葡萄糖20.0g/L,吐温80 1.0ml/L,柠檬酸二铵2.0g/L,K₂HPO₄2.0g/L,NaAc 2.0g/L,MnSO₄·4H₂O 0.25g/L,MnSO₄·7H₂O 0.58g/L,琼脂20.0g/L，蒸馏水补足；培养基中添加0.5-2％碳酸钙，pH 5.8～6.5，121℃灭菌30min。

(Ⅱ)分离方法：

(1)样品的采集与微生物分离：选择中国农业科学院饲料研究所犬饲养基地的健康成年犬，采集粪便，迅速放入自封袋中，带回实验室后立即进行梯度稀释，每个梯度三个平板，倾注法分离培养，于37℃倒置培养。

(2)分离纯化：取以上长有各种细菌的平板，选取明显水解圈的乳酸菌单菌落，采用连续划线法进行分离纯化。将有不同菌落形态的单菌落均进行纯化。重复3-4次，镜检，直至获得纯种。

(3)观察菌落特征，利用革兰氏染色、镜检，观察细菌形态。

(Ⅲ)罗伊氏乳杆菌的分离筛选鉴定：

经形态学观察，显微镜检，酶学分析以及碳水化合物利用实验，结合16SrRNA测序比对，鉴定为罗伊氏乳杆菌，16S rRNA基因序列如下所示。菌株培养24h后，菌落中间凸起，边缘整齐，表面光滑；兼性厌氧，革兰氏阳性，细胞呈杆状。菌落形态如图1所示，显微镜镜检形态如图2所示。

罗伊氏乳杆菌20-6的16S rRNA基因测序如序列表中序列1所示。

将前述罗伊氏乳杆菌的16S rRNA序列通过NCBI BLAST比对分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，选取具有较高相似度的同源菌株16S rDNA序列进行***发育分析，结果如图2所示,菌株与乳酸杆菌属的菌株聚为一大类，而且与罗伊氏乳杆菌分支进化距离最近，表明菌株与罗伊氏乳杆菌在进化上属于近缘物种(与Limosilactobacllus reuteri1502同一性达到99.80％)。结合其菌落与菌体形态特征，确定菌株为罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacllus reuteri)。

罗伊氏乳杆菌20-6，于2023年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.27590。

实施例2、罗伊氏乳杆菌20-6培养条件优化

一、培养基组分优化。

具体实施方式参见实施例1，区别在于步骤(1)中罗伊氏杆菌高密度培养基(MRS培养基)配制不同，将实施例1罗伊氏乳杆菌高密度培养基中的葡萄糖分别替换为蔗糖、红糖或葡萄糖，添加量均为20g/L。具体培养基配方为：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,蔗糖、红糖或葡萄糖20.0g/L,吐温80 1.0ml/L,柠檬酸二铵2.0g/L,K₂HPO₄2.0g/L,NaAc 2.0g/L,MnSO₄·4H₂O 0.25g/L,MnSO₄·7H₂O 0.58g/L,蒸馏水补足；培养基中添加0.5-2％碳酸钙，pH 5.8～6.5，121℃灭菌30min。

罗伊氏乳杆菌20-6以8％接种量接种到MRS培养基中，发酵培养条件为37℃、兼性厌氧，发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD_600nm)，确定最佳碳源种类。红糖作为碳源时，发酵液的菌体密度(OD_600nm)值最高，对罗伊氏乳杆菌生长有显著促进作用，说明红糖能够更好地被其利用。

二、培养基初始pH优化

按照步骤一中罗伊氏乳杆菌高密度培养基，初始pH不同，本实施例是将罗伊氏乳杆菌高密度培养基初始pH分别调节至5.8，6.5，对培养基初始培养基进行优化。

发酵培养24h后，测定发酵液的菌体密度(OD_600nm)，确定培养基最佳pH值。由表1中可知，pH值为5.8时，发酵液的菌体密度(OD600nm)值最高，对罗伊氏乳杆菌生长有显著促进作用。

由表1可知pH为5.8、碳源为红糖、厌氧、37℃时OD最大，此时促进生长。

表1.不同培养条件培养的菌体密度

实施例3、罗伊氏乳杆菌20-6菌株生长曲线及产酸能力

按照实施例2中优化后的培养条件进行发酵，发酵培养48h，测定发酵液不同时间的菌体密度(OD_600nm)，得到其生长曲线及产酸能力

表2、不同时间菌株菌体密度及产酸能力

从表2中可以看出培养24h时，菌株密度达到最大，产酸能力最强。由图3所示的菌株生长曲线及产酸能力，说明，该菌株具有良好的生长性能促进犬肠道有益菌的增殖。

实施例4、罗伊氏乳杆菌20-6菌株抑菌能力

取不同培养时间的罗伊氏乳杆菌20-6进行抑菌能力测定，致病菌为金黄葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌E1、大肠杆菌E1560，致病菌在LB液体培养基中，200rmp37℃振荡培养18h，用无菌PBS将致病菌上清稀释10³，取稀释液100μL用无菌棉棒涂布于LB固体培养基中，放置牛津杯(外径×内径×高度＝8mm×6mm×10mm)。罗伊氏乳杆菌20-6厌氧培养24h，在牛津杯中加入200μL菌液，每组做三个平行，37℃恒温培养箱培养24h后，测量抑菌圈直径大小。

表3.菌株不同培养时间抑菌圈直径

结果如表3所示，由表中可知，罗伊氏乳杆菌20-6菌株培养20h时对金黄葡萄球菌抑菌效果最好，菌株培养12h时对沙门氏菌和大肠杆菌E1抑菌效果最好，菌株培养16h时对大肠杆菌E1560效果最好。表明，罗伊氏乳杆菌20-6可抑制有害菌的增长。

实施例5、罗伊氏乳杆菌耐酸能力

罗伊氏乳杆菌20-6培养24h，将1mL罗伊式乳杆菌20-6菌液分别接种于pH＝2、pH＝3、pH＝4的9mLPBS中，37℃有氧培养4h，测定菌液0h与4h的OD₆₀₀值，同时平板菌落计数。

表4.罗伊氏乳杆菌耐酸能力

0h	pH＝2	pH＝3	pH＝4
				OD₆₀₀	0.16	0.13	0.19
活菌数	1.1×10⁵	1.1×10⁶	1.7×10⁷
				4h	pH＝2	pH＝3	pH＝4
OD₆₀₀	0.19	0.12	0.22
				活菌数	1.0×10⁵	1.1×10⁶	1.7×10⁷

结果如表4所示，在37℃下，检测了罗伊氏乳杆菌20-6在pH＝2、pH＝3、pH＝4培养条件下的活菌数与OD₆₀₀值，结果表明，在pH＝2的时候，该菌仍有一定的存活率，说明该菌对pH具有很强的耐受能力。

实施例6、罗伊氏乳杆菌20-6对小鼠抗炎的影响

一、试验方法

1、选用品系Bal B/C6周龄公鼠44只，12只进行腹泻模型造模试验，饲喂大肠杆菌CVCC195，稀释倍数为10⁶ 10⁷ 10⁸ 10⁹各3只，空白对照组3只，共15只，攻毒3天，每日观察小鼠体征变化，粪便评分及便隐血，达到造模要求(粪便评分4/5)视为造模成功，剖检小鼠观察病理变化并记录，确定大肠杆菌剂量，剩余32只进行正式试验。

2、将小鼠随机分为4组(每组8只小鼠)，空白对照组(Con组)，腹泻组(M组)，抗生素治疗组(K组)、LR组。连续灌胃大肠杆菌三天进行造模，然后进行治疗。Con组：在试验过程中，每天灌胃1次0.2mL的PBS，为期24天；腹泻组(M组)：在实验过程中，每天灌胃一次0.2mL浓度为1×10¹¹CFU/mL的大肠杆菌CVCC195菌液，为期3天，然后每天灌胃一次0.2mL的PBS，为期21天；抗生素治疗组(K组)：在实验过程中，每天灌胃一次0.2mL浓度为1×10¹¹CFU/mL的大肠杆菌CVCC195菌液，为期3天，然后每天灌胃一次0.2mL的阿莫西林克拉维酸钾(按照体重给药)，为期21天；LR组：在实验过程中，每天灌胃一次0.2mL浓度为1×10¹¹CFU/mL的大肠杆菌CVCC195菌液，为期3天，然后每天灌胃一次0.2mL浓度为1×10¹¹CFU/mL的LR冻干粉稀释液，为期21天；试验过程中，每三天测量小鼠体重，观察并记录小鼠状态，粪便状态、被毛状态及摄食量记录。总计24天后，第24天，解剖小鼠，收集样品进行分析。

LR冻干粉稀释液：罗伊氏乳杆菌20-6以1％浓度接种于实施例2中最优培养基，恒温箱37℃培养24h后进行离心，在25℃下，转速为6000r/min，离心10min，离心后倒掉上清加入无菌水进行二次离心，在25℃下，转速为6000r/min，离心10min，沉淀以1:5比例加入冻干保护剂，即1份菌泥加入5份冻干保护剂，罗伊氏乳杆菌冻干保护剂为15％脱脂奶粉和5％海藻糖，加入冻干保护剂后在-80℃冰箱中预冻12h，在冻干机中冻干24h后取0.1g溶于900μLPBS，稀释10¹⁰、10¹¹、10¹²进行涂布，根据结果得到一定浓度稀释液。

3、指标检测

收集空白对照组(Con组)，腹泻组(M组)，阳性对照组(K组)、LR组小鼠的肠道组织和血清样本，通过Elisa试剂盒分别检测血清中及肠道中炎性指标肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素IL-6(表5)。

实验结果表明，罗伊氏乳杆菌缓解小鼠大肠杆菌攻毒引起的炎症反应。从表5空白对照Con组，腹泻M组，抗生素治疗组K组、LR组可以看出，腹泻模型组炎性因子显著高于其他处理组，而LR益生菌使用组炎性因子TNF-α优于抗生素处理组，同时LR益生菌使用组的IL-6低于抗生素组，与对照组和抗生素使用组无显著差异说明该益生菌可以明显改善动物的腹泻状况，降低炎症反应的发生。

表5炎性因子

注：上标不同小写字母代表显著差异性，p<0.05。

实施例7、罗伊氏乳杆菌对小鼠脂质代谢调节的作用

将小鼠随机分为3组(每组6只小鼠)，空白对照组(Con组)，M组(肥胖模型组)，LR组(本专利益生菌)。其中M组和LR组饲喂的是高脂饮食，试验周期60天，空白对照组为正常饮食。试验结束，分别测定血清和肝脏中脂质代谢相关指标，包括TG(甘油三酯)、LDL(低密度脂蛋白)等。结果表明，与其他组相比，本专利中的LR菌罗伊氏乳杆菌20-6可以显著降低肝脏中的LDL(P<0.05)，降低血清中的TG含量(P<0.05)。说明LR菌对高脂饮食条件下的脂质代谢具有很好的调节作用。

表6不同处理对脂肪代谢相关指标的影响

注：上标不同小写字母代表显著差异性，p<0.05。

上述结果表明，罗伊氏乳杆菌20-6能增强动物机体免疫功能，对腹泻有一定的改善功能，且同时具有脂质代谢调节的作用，效果优于市场同类产品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种罗伊氏乳杆菌，其特征在于，名称为罗伊氏乳杆菌20-6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27590。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌。

3.一种用于调节肠道菌群的产品，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌或权利要求2所述的菌剂。

4.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于,所述调节肠道菌群包括如下(a)-(c)中任一种：

(a)抑制大肠杆菌；

(b)抑制伤寒沙门氏菌；

(c)抑制金黄色葡萄球菌。

6.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备抗细菌药物中的应用；优选的，所述细菌为***或革兰氏阴性细菌；最优选的，所述细菌包括大肠杆菌、伤寒沙门氏菌或金黄色葡萄球菌中的至少一种。

7.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌的培养方法，其特征在于，将罗伊氏乳杆菌接种于罗伊氏乳杆菌的培养基，在厌氧条件下、30℃-37℃下发酵培养；

所述罗伊氏乳杆菌的培养基的配方为蛋白胨10.0g/L,牛肉膏10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,蔗糖、红糖或葡萄糖20.0g/L,吐温80 1.0ml/L,柠檬酸二铵2.0g/L,K₂HPO₄ 2.0g/L,NaAc 2.0g/L,MnSO₄·4H₂O 0.25g/L,MnSO₄·7H₂O0.58g/L,余量蒸馏水；培养基中添加0.5-2％碳酸钙，pH 5.8～6.5，121℃灭菌30min；

优选的，所述培养基pH为5.8、碳源为红糖；

发酵培养温度优选为37℃。

8.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备食品添加剂或动物饲料添加剂中的应用。

9.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备改善动物腹泻和/或降低动物炎症反应的药物中的应用。

10.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在调节动物脂质代谢或制备调节动物脂质代谢的药物中的应用。