CN116606358A - GmTLP8蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了GmTLP8蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。本发明通过实验证明GmTLP8蛋白可以提高植物的耐盐性和耐旱性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物品种中发挥重要的作用。

Description

GmTLP8蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及GmTLP8蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。
背景技术
干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及大豆品种改良的重要任务之一。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
低温、干旱、土壤盐渍化是影响农业生产的严重问题。在有关植物抗逆境的众多研究中，科学家也克隆了许多不同来源的与抗逆境相关的功能基因并把它们转化到植物体中，但所取得的效果并不理想。植物的抗逆性状是多基因控制的复杂性状。植物对干旱、高盐及低温耐受性的强弱往往不取决于某一单一因子，其性状受许多因子影响。进一步对处于信号传导途径中的蛋白调节因子在植物多种信号途径相互作用中的调控机制进行研究，对深入理解植物的生物胁迫和非生物胁迫应答过程具有重要意义。因此，利用一个关键性蛋白调节因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了GmTLP8蛋白质的新用途。
本发明提供了GmTLP8蛋白质在调控植物耐逆性中的应用；
所述GmTLP8蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：
a)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
d)与a)-c)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
上述蛋白质中，所述标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪或纯化。具体可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具体可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了与上述GmTLP8蛋白质相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与上述GmTLP8蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用；
所述生物材料为下述C1)至C10)中的任一种：
C1)编码GmTLP8蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；
C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；
C8)含有C1)所述核酸分子的转基因植株、或含有C2)所述表达盒的转基因植株、或含有C3)所述重组载体的转基因植株；
C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体。
上述应用中，C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)序列2所示的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmTLP8蛋白质的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmTLP8蛋白质的DNA分子。
上述C1)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述C2)所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达GmTLP8蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GmTLP8基因转录的启动子，还可包括终止GmTLP8基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
C3)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码GmTLP8蛋白质的DNA分子。使用GmTLP8蛋白质的编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用GmTLP8蛋白质的编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
在本发明一个具体实施例中，所述重组表达载体具体可为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的载体。
C4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌GV3101。
C7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
C9)所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
C5)、C6)和C7)所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述GmTLP8蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物或植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。所述育种的目的是选育耐逆性高的植物。
上述应用中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性，具体体现为：当GmTLP8蛋白质在植物中的活性和/或含量提高时，所述植物耐逆性增加；当GmTLP8蛋白质在植物中的活性和/或含量降低或缺失时，所述植物耐逆性降低。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了b1或b2所示的物质在降低植物耐逆性或培育耐逆性降低的转基因植物或植物育种中的应用：
b1、抑制或降低植物中GmTLP8蛋白质活性和/或含量的物质；
b2、抑制或降低植物中GmTLP8蛋白质编码基因表达的物质或敲除植物中GmTLP8蛋白质编码基因的物质。
进一步的，所述抑制或降低植物中GmTLP8蛋白质活性和/或含量的物质可为任何能够使植物中上述GmTLP8蛋白质活性和/或含量降低或缺失的物质，如抑制上述GmTLP8蛋白质合成或促进上述GmTLP8蛋白质降解或抑制上述GmTLP8蛋白质功能的蛋白质、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制剂)。
所述抑制或降低植物中GmTLP8蛋白质编码基因表达的物质可为任何能够使植物中编码上述GmTLP8蛋白质的基因无法表达的物质，如沉默植物中上述GmTLP8蛋白质编码基因的物质，如miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA等。更进一步的，所述抑制或降低植物中GmTLP8蛋白质编码基因表达的物质可为抑制植物中GmTLP8基因表达的载体。在本发明的具体实施例中，所述抑制植物中GmTLP8基因表达的载体为含有序列3所示DNA分子的载体。
所述敲除植物中GmTLP8蛋白质编码基因的物质可以是以任何方式实现宿主细胞不产生GmTLP8基因的功能性蛋白质产物的物质，具体方式如去除全部或部分编码基因序列、引入移码突变使得不产生功能性蛋白质、去除或改变调节组分(例如启动子编辑)使得基因序列不被转录等。通常，敲除在基因组DNA水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中上述GmTLP8蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
进一步的，所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现为如下M1)-M6)任一种：
(M1)在盐或干旱胁迫下，转基因植物的存活率高于受体植物；
(M2)在盐或干旱胁迫下，转基因植物的脯氨酸含量高于受体植物；
(M3)在盐或干旱胁迫下，转基因植物的叶绿素含量高于受体植物；
(M4)在盐或干旱胁迫下，转基因植物的丙二醛含量低于受体植物；
(M5)在盐或干旱胁迫下，转基因植物的H2O2含量低于受体植物；
(M6)在盐或干旱胁迫下，转基因植物的O2-含量低于受体植物。
所述提高受体植物中GmTLP8蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达GmTLP8蛋白质。
所述过表达的方法为将GmTLP8蛋白质的编码基因导入受体植物。
更进一步的，所述GmTLP8蛋白质的编码基因通过重组表达载体导入受体植物中。所述GmTLP8蛋白质的编码基因为序列2所示的DNA分子。
在本发明一个具体实施例中，所述重组表达载体具体可为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的载体。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法。
本发明提供的培育耐逆性降低的转基因植物的方法包括降低受体植物中GmTLP8蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物。
进一步的，所述降低受体植物中GmTLP8蛋白质的含量和/或活性的方法是通过对所述受体植物中GmTLP8蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默表达来实现。
再进一步的，抑制受体植物中GmTLP8蛋白质的编码基因表达的方法为在受体植物中导入抑制受体植物中GmTLP8蛋白质的编码基因表达的载体。
更进一步的，所述抑制受体植物中GmTLP8蛋白质的编码基因表达的载体为含有序列3所示的DNA分子的载体。
在本发明的一个具体实施例中，所述含有序列3所示的DNA分子的载体具体为将pCAMBIA3301载体的NcoI和BstEII的酶切位点间的DNA片段替换为序列3所示的DNA分子后得到的载体。
在上述方法中，所述导入具体可为通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。
上述任一所述应用或方法中，所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。
所述植物为(X1)或(X2)或(X3)：
(X1)双子叶植物或单子叶植物；
(X2)豆科植物；
(X3)大豆。
所述大豆具体可为大豆中黄39。
实验表明，本发明的GmTLP8可以提高植物的耐盐性和耐旱性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物品种中发挥重要的作用。
附图说明
图1为侵染不同菌株大豆的表型观察结果。A：未处理对照；B：干旱胁迫处理7天后的大豆植株；C：150mM NaCl处理6天后的大豆植株。GmTLP8-OE、EV-Control和GmTLP8-RNAi分别表示侵染K599-35S：GmTLP8的大豆植株、侵染K599-pCAMBIA3301的大豆植株和侵染K599-GmTLP8-RNAi的大豆植株。
图2为侵染不同菌株大豆的存活率统计结果。**表示与EV-Control相比差异达到极显著水平(p<0.01)。
图3为侵染不同菌株大豆的大豆叶片染色结果。A：DAB染色；B：NBT染色。
图4为侵染不同菌株大豆的表达量检测和在干旱及盐胁迫条件下的生理指标检测。A：脯氨酸含量的测定；B：丙二醛含量的测定；C：叶绿素含量的测定；D：H2O2含量；E：O2-含量；F：侵染不同菌株大豆表达量检测。
图5为GmTLP8受胁迫诱导表达的荧光实时定量(Real-time)PCR图谱。
图6为GmTLP8亚细胞定位结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的pCAMBIA3301载体、发根农杆菌K599和大豆中黄39均由中国农业科学院作物科学研究所张辉研究员提供，均记载于文献“Sun et al.，Targetedmutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system，Scientific Reports，2015.5.29(DOi:10.1038/srep10342)”中，经张辉研究员同意后公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、GmTLP8蛋白质在提高毛状根大豆耐逆性中的应用
一、GmTLP8过表达载体的构建
1、根据大豆GmTLP8 cDNA序列和pCAMBIA3301载体中NcoI、BglII酶切位点两侧序列与同源重组要求[正向引物与载体左臂重叠区域(15-25nt)加上基因***片段正向序列(20-25nt左右)，反向引物与载体右臂重叠区域(15-25nt)加上基因***片段反向序列(20-25nt左右)]设计引物序列如下：
GmTLP8-3301-T-F：5'-GGACTCTTGACCATGATGTCCTTCCGCAGT-3'；
GmTLP8-3301-T-R：5'-ATTCGAGCTGGTCACCCTATTCACAAGCCAGTTT-3'。
2、以中黄39大豆cDNA模板，使用北京全式金生物技术有限公司的FastPfu PCR SurperMix进行PCR扩增，得到PCR产物。
3、将步骤2得到的PCR产物经琼脂糖电泳检测后，纯化回收PCR产物。
4、用NcoI与BglII内切酶酶切pCAMBIA3301载体，回收载体骨架。
5、用北京全式金生物技术有限公司的Quick-Fusion Clong Kit将步骤3回收的PCR产物克隆到步骤4回收的载体骨架中，得到重组载体，并将序列正确的重组载体命名为35S:GmTLP8。
重组载体35S:GmTLP8为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的酶切位点间的DNA片段替换为序列2所示的DNA分子后得到的载体。该重组载体能表达GmTLP8蛋白质，GmTLP8基因的表达由35S强启动子启动，由NOS强终止子终止。
二、GmTLP8干扰载体的构建
1、委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司人工合成序列表中序列3所示的DNA片段。该片段依次包括NcoI酶切位点、序列2第843-1042位所示的核苷酸序列、玉米alcoholdehydrogenase(Adh)基因序列(作为内含子)、序列2第843-1042位所示核苷酸序列的反向互补序列、BstEII酶切位点。
2、用NcoI酶和BstEII酶对pCAMBIA3301载体进行酶切，回收载体骨架。
3、将步骤1中的DNA片段和步骤2回收的载体骨架用Infusion重组酶在50℃条件下反应20min，得到连接产物。
4、将步骤3得到的连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆摇菌，用通用引物M13F(GTAAAACGACGGCCAG)和M13R(CAGGAAACAGCTATGAC)检测菌液，之后用M13F测序验证，并将序列正确的重组载体命名为GmTLP8-RNAi。
重组载体GmTLP8-RNAi为将pCAMBIA3301载体的NcoI和BstEII的酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子后得到的载体。
三、大豆毛状根的转化
分别将重组载体35S:GmTLP8、重组载体GmTLP8-RNAi和载体pCAMBIA3301导入发根农杆菌K599中，分别得到重组菌K599-35S:GmTLP8、重组菌K599-GmTLP8-RNAi和重组菌K599-pCAMBIA3301，并将其分别转化大豆毛状根。具体步骤如下：
1、将大豆中黄39种子播于混合土(营养土：蛭石＝1：1)中，播种深度为1-2cm。置于温室，白天28℃/晚上20℃，每天浇水。
2、用注射器分别挑取重组菌K599-35S:GmTLP8、重组菌K599-GmTLP8-RNAi和重组菌K599-pCAMBIA3301侵染6天大子叶尚未展开的大豆幼苗的子叶节。
3、侵染完用塑料盒盖上。
4、待长出毛状根后，用蛭石将大豆子叶节侵染位点及其以下部分埋住，浇水浇透。28℃，14h光照/10h黑暗，白天28℃/晚上20℃，培养30天，每两天浇一次水，保持浸染部分的潮湿环境。
5、30天后，当毛状根长到5-10cm时，将主根减去(此时毛状根用于GmTLP8基因表达量检测)，得到的植株称为复合体植株，将复合体植株埋入混合土(营养土：蛭石＝1：1)中，每三天浇一次水。
各植株GmTLP8基因表达量检测结果见图4F。结果显示，侵染了K599-35S:GmTLP8的大豆毛状根中GmTLP8基因的表达量显著高于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根，侵染了K599-GmTLP8-RNAi的大豆毛状根中GmTLP8基因的表达量显著低于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根。
四、耐逆性分析
复合体植株培育7天后，待毛状根恢复健康时，将转基因毛状根复合大豆植株用于干旱和盐胁迫试验。作为干旱处理，大豆种植7天不浇水；作为盐处理，大豆植株用150mMNaCl处理6天，同时以正常条件作为对照。干旱处理和盐处理试验至少进行3次。处理和未处理的大豆毛状根均在RNA分离和生理/生化实验前用水冲洗。干旱处理和盐处理后观察植株表型，统计存活率，对叶片进行DAB染色与NBT染色，以及测定叶片中如下生理指标含量：叶绿素、脯氨酸、丙二醛、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)。
DAB染色方法具体如下：选取旱胁迫处理7天或盐处理6天的GmTLP8-OE、EV-Control和GmTLP8-RNAi大豆幼苗上大小相近的叶片，染色液按照DAB染色试剂盒说明进行配制，工作溶液现用现配，配好后避光保存，更大体积工作液按说明书比例等比放大。此时将选取的叶片浸入DAB染色液中12小时，接下来将染色的叶片完全浸入甘油、100％酒精混合液(3:7)，95℃水浴30min，每10min上下颠倒一次脱色液，以便叶片脱色完全。最后将脱色完全的叶片进行拍照记录，每个处理重复三次实验。
NBT染色方法具体如下：选取干旱胁迫处理7天或盐处理6天的GmTLP8-OE、EV-Control和GmTLP8-RNAi大豆幼苗上大小相近的叶片，染色液按照NBT底物染色试剂盒说明进行配制，此时将选取的叶片浸入NBT染色液中12h，接下来将染色的叶片完全浸入甘油、100％酒精混合液(3:7)，95℃水浴30min，每10min上下颠倒一次脱色液，以便叶片脱色完全。最后将脱色完全的叶片进行拍照记录，每个处理重复三次实验。
利用苏州科铭生物技术有限公司的植物叶绿素(chlorophyll)含量测试盒(Comin公司，货号为CPL-2-G)进行叶绿素含量测定。具体步骤如下：称取0.1g叶片去掉中脉，剪碎，用蒸馏水洗干净。加入1mL蒸馏水，少量试剂一(约50mg)，在黑暗或弱光条件下充分研磨，转入10mL玻璃试管。提取液准备：取400mL无水乙醇和800mL丙酮，充分混匀待用。用提取液冲洗研钵，将所有冲洗液转入玻璃试管，用提取液补充至10mL，玻璃试管置于黑暗条件浸提3h，直至试管底部组织残渣完全变白。取浸提液200μL于96孔板，提取液调零，测定663nm和645nm处吸光值，并计算叶绿素含量。
利用苏州科铭生物技术有限公司的脯氨酸(PRO)含量测试盒(Comin公司，货号为PRO-2-Y)进行脯氨酸含量测定。具体步骤如下：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。之后置90℃振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。取0.5mL样本+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min，每10min振荡一次。待冷却后在试管中加入1mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8mL-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，于520nm波长处比色，记录吸光值A，并计算脯氨酸含量。
利用苏州科铭生物技术有限公司的丙二醛(MDA)测试盒(Comin公司，货号为MDA-2-Y)进行MDA含量测定。具体步骤如下：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.2mL样本，混匀。95℃水浴中保温30min，置于冰浴中冷却。10000g，25℃离心10min，吸取上清液于200μL玻璃比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，记为A532和A600并计算MDA含量。
利用苏州科铭生物技术有限公司的过氧化氢含量(H2O2)试剂盒(Comin公司，货号为H2O2-1-Y)进行H2O2含量测定。具体步骤如下：称取约0.1g组织，加入1mL丙酮，进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心，10min，取上清，置冰上待测。测定管吸取样本250μL，对照管吸取试剂一250μL，之后分别加入试剂二25μL和试剂三50μL，4000g，25℃离心10min，弃上清，留沉淀。加入250μL试剂四溶解沉淀后，室温静置5min，取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中测定415nm处吸光值A。计算ΔA＝A测定-A对照。
利用苏州科铭生物技术有限公司的超氧阴离子(Superoxide anion，OFR)试剂盒(Comin公司，货号为SA-1-G)进行O2-含量测定。具体步骤如下：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心20min，取上清置于冰上待测。测定管吸取样本200μL，空白管吸取200μL提取液，加入160μL的试剂一，混匀，37℃水浴20min。之后分别加入120μL试剂二和120μL试剂三，混匀，37℃水浴20min。之后加入200μL试剂四，混匀。8000g，25℃离心5min，小心吸取上层水相200μL于微量石英比色皿/96孔板中，测定A530。ΔA＝A测定-A空白。
大豆发根表型观察结果见图1。结果显示，在正常生长条件下，GmTLP8-OE、EV-Control和GmTLP8-RNAi株系间差异不显著(图1A)。然而，干旱(图1B)和盐(图1C)处理后，GmTLP8-OE、EV-Control和GmTLP8-RNAi植株之间存在显著的表型差异。与EV-Control相比，GmTLP8-RNAi植株表现出更严重的叶片脱水和萎蔫胁迫表型，而GmTLP8-OE植株表现出更少的卷叶和延迟的叶片萎蔫表型。
大豆发根存活率统计结果见图2。结果显示，GmTLP8-OE、EV-Control和GmTLP8-RNAi株系在干旱胁迫下的存活率分别为93％、67％和40％；这些存活率与植物在盐胁迫下相当。
大豆发根叶片染色结果见图3。染色包括DAB染色(图3A)和NBT染色(图3B)。结果显示，在正常条件下，GmTLP8-OE、EV-Control和GmTLP8-RNAi株系的叶片染色最小，株系间差异不显著。干旱和盐胁迫下，与EV-Control相比，GmTLP8-OE叶片染色较浅，而GmTLP8-RNAi叶片染色较深。这些结果表明，与EV-Control相比，GmTLP8-OE株系在外源非生物胁迫下叶片损伤程度较低，而GmTLP8-RNAi株系叶片损伤程度较重。
生理指标测定结果见图4。结果显示，与EV-control相比，GmTLP8-OE株系中的脯氨酸和叶绿素含量较高，丙二醛、H2O2和O2-含量较低。相比之下，GmTLP8-RNAi株系中的脯氨酸和叶绿素含量均低于EV-Control，丙二醛、H2O2和O2-含量均高于EV-Control。
上述结果表明，与EV-control(侵染K599-pCAMBIA3301的大豆)相比，GmTLP8-OE(侵染K599-35S:GmTLP8的大豆)表现出了更强的耐盐性和耐旱性，而GmTLP8-RNAi(侵染K599-GmTLP8-RNAi的大豆)则表现出了更弱的耐盐性和耐旱性。说明GmTLP8基因及其所编码的GmTLP8蛋白质可以用来提高大豆的耐盐性和耐旱性。
实施例2、实时荧光定量PCR分析GmTLP8的表达特性
一、胁迫处理
取室温生长14d左右的大豆中黄39幼苗进行以下处理：
(1)干旱处理(图5中A)：将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，分别于自然干旱0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。
(2)高盐处理(图5中B)：将大豆幼苗置于200mM的NaCl水溶液中，分别于光照培养0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。
(3)对照处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。
二、RNA提取
采用Trizol法(TianGen)提取大豆叶片总RNA。
三、反转录为cDNA
将纯化的mRNA反转录为cDNA。
四、实时荧光定量PCR
将cDNA稀释50倍后用作qRT-PCR的模板。采用用于扩增GmTLP8基因的特异引物对(引物序列为TLP8-qRTF：AACAGGGGCAAGTCACGTAG和TLP8-qRTR：CCTATGCCCAGGCTGTTTCA)对样品进行qRT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin作为内参，用于扩增actin基因的特异引物对序列如下：RT-GmactinF：ACATTGTTCTTAGTGGTGGCT和RT-GmactinR：CTGTTGGAAGGTGCTGAG。qRT-PCR在7500实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用LivakKJ和SchmittgenTD(2001)报道的方法，即2-ΔΔCT计算相对表达量。
ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Actin)Timex－(CT.Target－CT.Actin)Time0。
Timex表示任意时间点，Time0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。
结果见图5。结果显示，干旱和高盐处理均使GmTLP8基因的表达升高。
实施例3、GmTLP8亚细胞定位分析
一、GmTLP8-GFP载体构建
设计带有BamHI酶切位点的引物，以GmTLP8-pEASY-Blunt Zero载体为模板扩增带有接头的GmTLP8线性片段，同时用BamHI酶将GFP载体酶切，并回收骨架载体。然后利用Infusion酶将GmTLP8线性片段克隆到骨架载体上，得到GmTLP8-GFP重组载体。
具体引物如下：
GmTLP8-GFP-F：5’-TATCTCTAGAGGATCCATGTCCTTCCGCAGT-3’；
GmTLP8-GFP-R：5’-TGCTCACCATGGATCCCTATTCACAAGCCAGTTT-3’。
二、拟南芥原生质体的制备与转化
1、用于原生质体瞬时表达实验的野生型拟南芥在室温25℃培养室生长21天。
2、在100mL的小烧杯中配制15mL的纤维素酶解液。
3、用刀片割取拟南芥生长茁壮的叶片，并将其用刀片切成1-2mm宽叶条。
4、将切好叶条置于提前配置好的酶解液中，并用镊子将附着在杯壁上的叶条收集到酶解液中，并且使叶子完全浸入酶解液。
5、将摇床设置为25℃，50rpm，用铝箔纸包裹小烧杯酶解约3h，直至酶解液变为绿色。
6、将变成绿色的酶解液用筛子过滤，过滤后的酶解液小心的分装到2mL的离心管中。
7、然后200g离心2min，弃上清，收集原生质体。
8、加入预冷的W5溶液将原生质体进行重悬。然后冰上静置30min。
9、重复步骤7。
10、然后用适量的MMG溶液对其进行重悬。
11、取一个干净的2.0mL离心管，加入10μg的质粒，再加入100μL步骤10制备的原生质体，并且轻柔混匀。
12、加入110μLPEG4000诱导转化溶液，轻轻颠倒混匀。
13、放到25℃加热块避光诱导转化25min。
14、加入500μL W5溶液，然后轻柔混匀以终止转化反应。
15、200g离心1min，收集原生质体；再次加入500μL W5溶液，200g离心2min，弃上清。
16、在22℃的培养箱避光诱导原生质体12h。
17、使用激光共聚焦显微镜，观察融合蛋白GmTLP8-GFP的表达情况。
上述方法中的纤维素酶解液、PEG4000诱导转化溶液、W5溶液和MMG溶液的配置方法分别如表1-表4所示。
表1、纤维素酶解液配置方法
表2、PEG4000诱导转化溶液配置方法
表3、W5溶液配置方法
表4、MMG溶液配置方法
结果如图6所示。结果显示，GmTLP8-GFP位于细胞的细胞质和细胞核中。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> GmTLP8蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 430
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Ser Phe Arg Ser Ile Val Arg Glu Val Arg Asp Gly Phe Gly Ser
1 5 10 15
Leu Ser Arg Arg Ser Phe Glu Val Arg Leu Pro Gly His Asn Arg Gly
20 25 30
Lys Ser Arg Ser Leu Val His Glu Leu Gln Asp Gln Pro Pro Val Ile
35 40 45
Gln Asn Ser Arg Trp Ala Ser Leu Pro Pro Glu Leu Leu Arg Asp Val
50 55 60
Ile Asn Arg Leu Glu Ala Ser Glu Ser Thr Trp Pro Gly Arg Lys His
65 70 75 80
Val Val Ala Cys Ala Ala Val Cys Lys Ser Trp Arg Glu Met Cys Lys
85 90 95
Glu Ile Val Ser Ser Pro Glu Phe Cys Gly Lys Ile Thr Phe Pro Val
100 105 110
Ser Leu Lys Gln Pro Gly His Arg Asp Gly Pro Ile Gln Cys Phe Ile
115 120 125
Lys Arg Asp Lys Ser Lys Leu Thr Tyr His Leu Phe Leu Gly Leu Ser
130 135 140
Pro Ala Leu Leu Val Glu Asn Gly Lys Phe Leu Leu Ser Ala Lys Arg
145 150 155 160
Thr Arg Arg Thr Thr Cys Thr Glu Tyr Val Ile Ser Met Asp Ala Asp
165 170 175
Asn Ile Ser Arg Ser Ser Ser Thr Tyr Ile Gly Lys Leu Arg Ser Asn
180 185 190
Phe Leu Gly Thr Lys Phe Ile Ile Tyr Asp Thr Gln Pro Pro Tyr Asn
195 200 205
Asn Ala Met Leu Ser Pro Pro Gly Arg Ser Arg Arg Phe Ser Lys Lys
210 215 220
Val Ser Pro Lys Val Pro Ser Gly Ser Tyr Asn Ile Ala Gln Val Thr
225 230 235 240
Tyr Glu Leu Asn Val Leu Gly Thr Arg Gly Pro Arg Arg Met Asn Cys
245 250 255
Thr Met Tyr Ser Ile Pro Ala Ser Ser Met Glu Pro Asn Gly Val Val
260 265 270
Pro Gly Gln Pro Glu Leu Leu Pro Arg Ala Leu Glu Asp Ser Phe Arg
275 280 285
Ser Ile Ser Phe Ser Lys Ser Ile Asp Asn Ser Thr Glu Phe Ser Ser
290 295 300
Ser Arg Phe Ser Asp Ile Met Gly Thr Gly Ile Glu Asp Glu Glu Gly
305 310 315 320
Lys Val Arg Pro Leu Val Leu Lys Asn Lys Ser Pro Arg Trp His Glu
325 330 335
Gln Leu Gln Cys Trp Cys Leu Asn Phe Arg Gly Arg Val Thr Val Ala
340 345 350
Ser Val Lys Asn Phe Gln Leu Ile Ala Ser Thr Pro Pro Ala Ala Val
355 360 365
Ala Pro Thr Gly Thr Gly Pro Thr Pro Ser Gln Pro Thr Gln Ser Ser
370 375 380
Ser Asp Pro Asp Lys Ile Ile Leu Gln Phe Gly Lys Val Gly Lys Asp
385 390 395 400
Met Phe Thr Met Asp Tyr Arg Tyr Pro Leu Ser Ala Phe Gln Ala Phe
405 410 415
Ala Ile Cys Leu Thr Ser Phe Asp Thr Lys Leu Ala Cys Glu
420 425 430
<210> 2
<211> 1293
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgtccttcc gcagtatagt tcgtgaagta agggatggat ttggaagcct atcaaggagg 60
agttttgagg taaggcttcc tggccataac aggggcaagt cacgtagttt ggtccacgag 120
ttgcaggatc agccaccagt tatacagaac agccggtggg ctagccttcc tcctgagctt 180
cttcgcgatg ttattaatag attggaagca agcgagagta catggcctgg tcgtaagcat 240
gtggttgcgt gtgctgccgt gtgcaagtcc tggagagaaa tgtgcaaaga aattgtcagc 300
agtcctgaat tctgtgggaa gattactttc cctgtttcct tgaaacagcc tgggcatagg 360
gatggaccca tccagtgttt catcaagaga gacaaatcta agctgacata ccacctcttc 420
cttggcctta gccctgcctt gcttgttgaa aatggaaagt ttcttctctc tgcaaaacgg 480
acaagaagaa caacttgcac agagtatgtt atatcaatgg atgcagataa catatcgaga 540
tctagtagta cttatattgg aaaactgagg tctaattttc ttggcaccaa gtttataatt 600
tatgatacgc aacctcccta caacaatgct atgctgtctc cacctggccg cagccgtagg 660
ttttcaaaaa aggtttctcc aaaggtccct agcggcagct acaatattgc ccaggtcacc 720
tatgagttga atgtccttgg tactaggggg ccacgaagga tgaattgcac aatgtactca 780
attcctgcat catccatgga gcctaatggc gttgtcccag gccagccaga gctccttccc 840
cgtgcccttg aggattcttt ccggagtata tccttctcaa aatcaatcga caattcaacc 900
gagtttagca gctctaggtt ctctgacata atgggaactg gcattgaaga cgaggaggga 960
aaggtgagac cactagttct caagaacaag tctccaaggt ggcatgaaca gctgcaatgt 1020
tggtgcctca actttagagg aagggtcact gttgcctctg tcaagaattt tcagctgatt 1080
gcctcaacac cgccagcagc cgttgctcct acaggaacag gacctacacc atctcagcca 1140
acacagtctt cttctgaccc tgacaagatt attcttcagt ttggcaaggt tggcaaggat 1200
atgtttacaa tggactatcg ataccccctt tctgcatttc aggcttttgc catatgcttg 1260
actagttttg acacaaaact ggcttgtgaa tag 1293
<210> 3
<211> 564
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
catgccatgg tgcccttgag gattctttcc ggagtatatc cttctcaaaa tcaatcgaca 60
attcaaccga gtttagcagc tctaggttct ctgacataat gggaactggc attgaagacg 120
aggagggaaa ggtgagacca ctagttctca agaacaagtc tccaaggtgg catgaacagc 180
tgcaatgttg gtgcctcaac tttagaggaa gatccgatcg aaaaacggga gtctgcccct 240
aagacagata agccgccaag aaggcgcaag tcaaccgcga gttgttgtat catatctact 300
gacaaagatc acaaatggga tggctgatta gataccttgg cctcccagat cgattcttcc 360
tctaaagttg aggcaccaac attgcagctg ttcatgccac cttggagact tgttcttgag 420
aactagtggt ctcacctttc cctcctcgtc ttcaatgcca gttcccatta tgtcagagaa 480
cctagagctg ctaaactcgg ttgaattgtc gattgatttt gagaaggata tactccggaa 540
agaatcctca agggcaggtg accc 564

Claims (10)

1.GmTLP8蛋白质在调控植物耐逆性中的应用；
所述GmTLP8蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：
a)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
d)与a)-c)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
2.与权利要求1中所述GmTLP8蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用；
所述生物材料为下述C1)至C10)中的任一种：
C1)编码权利要求1中所述GmTLP8蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；
C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；
C8)含有C1)所述核酸分子的转基因植株、或含有C2)所述表达盒的转基因植株、或含有C3)所述重组载体的转基因植株；
C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)序列2所示的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述GmTLP8蛋白质的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述GmTLP8蛋白质的DNA分子。
4.权利要求1中所述的GmTLP8蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物或植物育种中的应用。
5.b1或b2所示的物质在降低植物耐逆性或培育耐逆性降低的转基因植物或植物育种中的应用：
b1、抑制或降低植物中GmTLP8蛋白质活性和/或含量的物质；
b2、抑制或降低植物中GmTLP8蛋白质编码基因表达的物质或敲除植物中GmTLP8蛋白质编码基因的物质。
6.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的GmTLP8蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述的GmTLP8蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的GmTLP8蛋白质；
或，所述过表达的方法为将权利要求1中所述的GmTLP8蛋白质的编码基因导入受体植物；
或，所述GmTLP8蛋白质的编码基因为序列2所示的DNA分子。
8.一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述的GmTLP8蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中权利要求1中所述的GmTLP8蛋白质的含量和/或活性的方法是通过对所述受体植物中权利要求1中所述的GmTLP8蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默表达来实现。
10.根据权利要求1-5任一所述的应用或权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；
或，所述植物为(X1)或(X2)或(X3)：
(X1)双子叶植物或单子叶植物；
(X2)豆科植物；
(X3)大豆。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118064453A (zh) * 2024-04-22 2024-05-24 河南大学三亚研究院 GhTLP8基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用
CN118064453B (zh) * 2024-04-22 2024-06-28 河南大学三亚研究院 GhTLP8基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用

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