CN117947051B - 一种马铃薯StCuRG1基因、生物材料及过表达StCuRG1基因的应用 - Google Patents
一种马铃薯StCuRG1基因、生物材料及过表达StCuRG1基因的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯StCuRG1基因、生物材料及过表达StCuRG1基因的应用。本发明以强启动子35S和马铃薯StCuRG1基因构建载体，转化具有优良品质但不抗晚疫病的马铃薯商业品种Desiree，获得增强对铜离子诱导抗性响应且高抗晚疫病的转基因马铃薯新品种。晚疫病抗性检测发现，与野生型对照相比，超量表达StCuRG1基因的转基因马铃薯对晚疫病抗性显著增强，说明提高StCuRG1基因表达能够提高马铃薯对晚疫病的抗性。该基因可应用于马铃薯抗晚疫病的基因工程改良中。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种马铃薯StCuRG1基因、生物材料及过表达StCuRG1基因的应用。
背景技术
由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是严重危害全球马铃薯生产第一大卵菌病害。晚疫病在一般流行年份造成马铃薯产量损失10%-30%，严重流行年份可达50%以上，甚至绝产。培育抗晚疫病品种和提高对农药的高效利用成为马铃薯育种的主要目标之一。
铜制剂是一种保护性杀菌剂，具有杀菌范围广，对农产品和环境比较安全，残留期短，不产生抗药性等诸多优点，被广泛应用于晚疫病等植物病害的防治。传统理论认为，杀菌机制是铜制剂的防病原理，其中铜离子的重金属毒性直接干扰病原微生物胞内酶的活性，抑制真菌和细菌生长，从而发挥杀菌的作用。铜制剂的使用已有近两百年的历史，生产上发现大量对铜离子具有耐受性的病原微生物，但是喷施铜制剂仍能有效防治铜离子耐受的菌株。最近的研究揭示，在拟南芥-丁香假单胞菌***中，极低浓度（10nM）的铜离子就能够提高拟南芥对丁香假单胞菌DC3000的抗性。铜离子能够激活植物产生一系列抗病反应，如促进活性氧类物质的积累，促进胼胝质沉积，上调病程相关基因的表达，激活MAPK蛋白的磷酸化，促进乙烯的迅速释放等，增强拟南芥对细菌性病害的抗性。在马铃薯-晚疫病菌互作***中，铜离子更快更强的激活乙烯合成，抑制脱落酸合成相关基因StABA1、StNCED1等的转录，导致脱落酸水平降低，增强马铃薯对晚疫病的抗病性。在水稻-水稻条纹病毒（RSV）***中，微量元素铜能够通过抑制SPL9来增强水稻的抗病毒能力。铜离子发挥抗病毒功能依赖于SPL9-miR528-AO-ROS这一通路，铜离子一方面能够抑制SPL9的蛋白积累水平和SPL9结合miR528启动子能力，从而使得miR528表达量降低，进而增强抗坏血酸氧化酶（AO）的积累量和活性氧（ROS）水平；另一方面，铜离子能够直接影响AO的酶活，当AO的铜离子结合位点突变后，AO介导的抗病毒能力也会受到抑制。通过直接外源施加铜离子或者通过基因编辑技术敲除水稻铜离子转运基因（COPT7），均能提高铜离子积累并进而调控SPL9-miR528-AO通路增强水稻对病毒的抗性，为铜离子抗病毒的实际应用提供了潜在思路。重要的是，铜离子介导的上述抗病毒通路对不同水稻病毒（RSV和RDV）具有广谱抗性，暗示了铜离子的广阔应用前景。
但目前尚未有基于铜离子理论的基因工程技术的应用公开。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种马铃薯StCuRG1基因、生物材料及过表达StCuRG1基因的应用。本发明以强启动子35S和马铃薯StCuRG1基因构建载体，转化具有优良品质但不抗晚疫病的马铃薯商业品种Desiree，获得增强对铜离子诱导抗性响应且高抗晚疫病的转基因马铃薯新品种。
本发明的技术方案包括如下方面：
作为本发明的第一个方面，在于提供一种马铃薯StCuRG1基因，包括如下核苷酸序列的至少一种：
a，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
b，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
c，SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
d，编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经人为工程改造或自然核酸多态性所致的替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列编码所对应的核苷酸序列。
作为本发明的第二个方面，在于提供一种生物材料，包含所述的马铃薯StCuRG1基因以及pCXSN载体。
作为本发明的第三个方面，在于提供过表达马铃薯StCuRG1基因在增强马铃薯对晚疫病抗性方面的应用。
所述应用体现在，制备过表达马铃薯StCuRG1基因的生物材料，包括如下步骤：
步骤1，提取马铃薯品种Desiree的总RNA，反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，以StCuRG1特异引物F1：5’-GATGGAGAAGAATAAGATTATTAAGAG-3’，R1：5’-TCATAAACACATCGATGGATCG-3’为引物扩增StCuRG1编码区序列，连接至经XcmI酶切的pCXSN载体，得到载体pCXSN：StCuRG1；
优选的，步骤1中，先以正常土培的马铃薯品种Desiree为材料，喷施硫酸铜溶液（10μM）对马铃薯进行处理，处理后采集叶片，采用TRIZOL法提取总RNA；
步骤2，将pCXSN：StCuRG1转化农杆菌感受态细胞AGL1，经活化、培养，采用茎段转化法将该载体转化栽培种Desiree，获得转pCXSN：StCuRG1基因植株。
本发明实施例中，晚疫病抗性检测发现，与野生型对照相比，超量表达StCuRG1基因的转基因马铃薯对晚疫病抗性显著增强。
所述应用体现在，采用过表达马铃薯StCuRG1基因的生物材料修饰马铃薯细胞。
本发明提供的方法具体为：采用生长21d~28d健壮的马铃薯Desiree无菌苗，剪取无腋芽茎段，与包含转有pCXSN：StCuRG1的农杆菌AGL1菌液充分接触，得到转化材料，进行共培养，共培养茎段经愈伤组织分化、出芽愈伤、再生后得到再生植株。
所述应用还体现在，在于提供一种增强植物抗性的方法，包括过表达马铃薯StCuRG1基因，并施加铜制剂。
进一步的，所述铜制剂为硫酸铜溶液。本发明的实施例中表明，抑制该基因的表达技术削弱铜制剂的防治效果，组成型表达该基因增强铜制剂的防治效果。本发明提供了所述的基因在植物抗性改良及配合铜制剂防治中的应用。
本发明实施例中，所述植物为马铃薯。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
综上所述，本发明获得了超量表达StCuRG1基因的转基因马铃薯，晚疫病抗性检测发现，与野生型对照相比，超量表达StCuRG1基因的转基因马铃薯对晚疫病抗性显著增强，说明提高StCuRG1基因表达能够提高马铃薯对晚疫病的抗性。该基因可应用于马铃薯抗晚疫病的基因工程改良中。本发明公开了基于铜离子理论的基因工程技术的应用，为该理论的实施提供了新的思路。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中铜离子激活马铃薯中StCuRG1基因转录试验相对表达水平图。
图2为实施例2中StCuRG1基因沉默植株的产生和抗病性鉴定结果图，其中，（a）为利用VIGS技术沉默马铃薯中StCuRG1基因的表达；（b）为台盼蓝染色检测对照pTV00及StCuRG1沉默材料经硫酸铜、硫酸镁处理后接种晚疫病3天后的细胞坏死情况，以硫酸镁作为对照；（c）为对照pTV00及StCuRG1沉默材料经硫酸铜、硫酸镁处理后接种晚疫病3天的病情指数统计结果，其中，**：t-test，与对照组（pTV00，MgSO4处理）相比P<0.01。
图3为实施例4中StCuRG1超量表达载体的构建图，其中，（a）为StCuRG1的CDS区扩增；（b）为StCuRG1农杆菌PCR检测。
图4为实施例4中茎段法转化马铃薯阶段图，其中，（a）为分化的愈伤；（b）为出芽的愈伤；（c）为再生马铃薯苗。
图5为实施例4中StCuRG1转基因马铃薯分子水平检测图，其中，（a）为转基因马铃薯DNA水平检测；（b）为转基因马铃薯RNA水平检测，以Desiree为对照。
图6为实施例5的抗性鉴定试验图，其中，（a）为StCuRG1转基因马铃薯与Desiree接种晚疫病3天的发病情况；（b）为StCuRG1转基因马铃薯与Desiree接种晚疫病3天的病情指数统计结果，其中*：t-test，与野生型叶相比P<0.05，**：t-test，与野生型相比P<0.01。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中，术语“CDS序列”是指编码序列（Coding sequence）。DNA转录成mRNA，mRNA经剪接等加工后翻译出蛋白质，所谓CDS就是与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列，不考虑mRNA加工等过程中的序列变化，其与蛋白质的密码子完全对应。
本发明中，术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段。“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调节基因产物产生的所有DNA区域，无论这种调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调节序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘体、边界元件、复制起点、基质附着位点、内含子和基因座控制区。
可以以各种方式改变本发明的蛋白质，包括氨基酸取代、缺失、截短和***。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域熟知的。
在本发明中，术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。从DNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽是指转录和翻译编码序列以产生蛋白质或多肽，而从RNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽是指翻译RNA编码序列以产生蛋白质或多肽。
实施例1
本实施例描述了硫酸铜处理激活马铃薯中StCuRG1基因转录。
以正常土培的马铃薯品种Desiree为材料，用手持小型喷雾器喷施硫酸铜溶液（10μM）对生长4周的马铃薯进行喷施处理，在处理后0h、2h、24h对叶片进行采集，采用TRIZOL法（购自康为世纪生物科技股份有限公司）提取总RNA，采用逆转录酶MMLV（购自爱博泰）将总RNA逆转录合成cDNA第一链，反应条件为：42℃，1h；65℃，20min。然后以此cDNA为模板，以StEF1a（PGSC0003DMG400023272）为内参基因，StEF1a基因扩增引物为F3：5’-CAAGGATGACCCAGCCAAG-3’，R3：5’-TTCCTTACCTGAACGCCTGT-3’，利用StCuRG1基因特异性引物F4：5'-ATGGGTTCATTGATAGGAGTAA-3'和R4：5'-ATCTATGTCAGGTCCTTCAGC-3'进行实时定量PCR，反应条件：95℃预变性3min；95℃，10sec；60℃，10sec，72℃，30sec，40个循环。结果如图1所示。
实施例2
本实施例描述了StCuRG1基因沉默植株的产生和抗病性鉴定。
以马铃薯叶片cDNA为模板，以StCuRG1基因特异性引物StCuRG1-VIGS-F2：5’-CGGGATCCAAAGATGGAGGAGTTCTCGC-3’（其中下划线序列为限制性内切酶BamH I识别序列），StCuRG1-VIGS-R2：5’-GGGGTACCGATGTGGTGTTGGCATTTCG-3’（其中下划线序列为限制性内切酶KpnI识别序列），扩增出StCuRG1基因特异片段，将PCR产物和载体pTV00用限制性内切酶BamH I、KpnI进行酶切，然后经T4 DNA ligase作用下在16℃反应，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自上海唯地生物技术有限公司），筛选测序正确的阳性克隆，命名为TRV-CuRG1，三组平行试验分别为TRV-CuRG1-1、TRV-CuRG1-2、TRV-CuRG1-3。TRV-CuRG1转化农杆菌GV3101感受态细胞，与含TRV2的GV3101等比例混合，采用无针头的注射器注射Desiree叶片，四周后检测StCuRG1基因的表达水平，如图2中（a）所示，明确StCuRG1基因被沉默。
对TRV-CuRG1叶片和对照组pTV00叶片（n=10）分别接种马铃薯晚疫病EC1孢子悬浮液，于20℃培养箱中避光静置，3天后进行表型观察、统计并拍照，结果如图2所示。结果显示，TRV-CuRG1基因沉默的马铃薯叶片（TRV-CuRG1）比对照组（pTV00）叶片对晚疫病更加感病，如图2中（b）所示，病情指数也高于对照组，如图2中（c）所示，表明沉默StCuRG1基因表达的马铃薯对晚疫病更感病，且在StCuRG1基因沉默的马铃薯材料上铜离子不能激发对晚疫病的抗性。可见，抑制StCuRG1基因降低马铃薯对晚疫病的抗性，且削弱铜制剂诱发的植物抗病性。
实施例3
本实施例描述了马铃薯StCuRG1基因的分离克隆。
以正常土培的马铃薯品种Desiree为材料，用手持小型喷雾器喷施硫酸铜溶液（10μM）对生长4周的马铃薯进行喷施处理，在处理后0h、2h、24h对叶片进行采集，采用TRIZOL法（购自康为世纪生物科技股份有限公司）提取总RNA，采用逆转录酶SuperScript IV（购自ThermoFisher Scientific）将总RNA逆转录合成cDNA第一链，反应条件为：50℃，15min；80℃，10min。然后以此cDNA为模板，利用StCuRG1基因特异性引物F1：5’-GATGGAGAAGAATAAGATTATTAAGAG-3’和R1：5’-TCATAAACACATCGATGGATCG-3’进行PCR扩增，扩增出含有StCuRG1基因全长编码框的DNA片段，如图3中（a）所示，反应条件为：95℃预变性3min；95℃，10sec，55℃，10sec，72℃，1min，35个循环；72℃终延伸5min。将获得的PCR产物与经XcmI（购自NEB）处理的pCXSN载体在T4 DNA ligase作用在16℃反应，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自上海唯地生物技术有限公司），筛选测序正确的阳性克隆，命名为pCXSN：StCuRG1，扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。强启动子35S位于载体pCXSN上，以35S强启动子驱动目的基因表达。
实施例4
本实施例描述了马铃薯StCuRG1超量表达转基因材料的制备。
将pCXSN：StCuRG1转化农杆菌感受态细胞AGL1，如图3中（b）所示。利用农杆菌介导法转化马铃薯品种Desiree，将转有pCXSN：StCuRG1的农杆菌AGL1在含有抗生素（Rif 50mg/L和Kan 50mg/L）的LA固体培养基上活化，28℃培养48h，挑取单克隆在液体LB培养基（另加抗生素Rif 50mg/L和Kan 50mg/L）中扩大培养，28℃，200r/min培养16h-18h。待OD600值达0.6-0.8，取100μL菌液加入到20mL的液体MS0培养基中，选择生长21d~28d健壮的马铃薯Desiree无菌苗，剪取无腋芽茎段（长约0.5cm），放置于农杆菌菌悬液中，每20mL菌悬液放入30个左右的茎段，于黑暗条件下，24℃，42rpm摇床上混合，使外植体与菌液充分接触，20分钟后取出转化材料，用灭菌滤纸拭去表面菌液，转入共培养培养基M0中，于18℃暗处共培养3d；共培养茎段全部转到M1愈伤分化培养基后置于人工气候箱21℃±1℃、16h/d、光照强度2000lx条件下进行愈伤组织分化，12d后选择愈伤发育良好的茎段，转入M2分化培养基进行选择性培养，以后每14d转接1次；约转接到第3次时愈伤组织开始长出再生芽，当待再生苗长到约2cm高时，转移到含潮霉素和特美丁的生根培养基MR上进行生根筛选。当根长好后，取生长状态与非转基因植株无明显差异的再生植株的顶端茎段，重新转到选择性生根培养基上筛选确认，过程如图4所示，包括图4中（a）所示的分化的愈伤、图4中（b）所示的出芽的愈伤、图4中（c）所示的再生马铃薯苗。
共获得转pCXSN：StCuRG1基因植株（T0代）7株。将7株植株提取DNA，进行PCR检测。结果表明，结果表明，共有编号为2、3、6、7的4株扩增出了长度大约1620bp的StCuRG1基因特异性片段，证明目的基因已经成功转入到马铃薯Desiree中，如图5中（a）所示，阳性率达到57.14%（阳性植株/接种茎段为4/7）。
为了进一步鉴定转基因阳性植株中StCuRG1基因的转录水平，对生长4周的阳性植株和Desiree分别采集叶片，采用TRIZOL法（购自康为世纪生物科技股份有限公司）提取总RNA，采用逆转录酶MMLV（购自爱博泰）将总RNA逆转录合成cDNA第一链，反应条件为：42℃，1h；65℃，20min。然后以此cDNA为模板，以StEF1a为内参基因，StEF1a基因扩增引物为F3：5’-CAAGGATGACCCAGCCAAG-3’，R3：5’-TTCCTTACCTGAACGCCTGT-3’，利用StCuRG1基因特异性引物F4：5’-ATGGGTTCATTGATAGGAGTAA-3’和R4：5’-ATCTATGTCAGGTCCTTCAGC-3’进行实时定量PCR，反应条件：95℃预变性3min；95℃，10sec；60℃，10sec，72℃，30sec，40个循环。结果如图5中（b）所示，过表达组OE-2、OE-3、OE-6转基因阳性植株中StCuRG1基因转录水平达到对照Desiree的约20-25倍，证明目的基因StCuRG1在马铃薯Desiree中已超量表达。
实施例5
本实施例描述了StCuRG1超量表达转基因马铃薯对晚疫病的抗性鉴定。
对转基因马铃薯叶片和对照组Desiree叶片（n=10）分别接种马铃薯晚疫病EC1孢子悬浮液，于18℃培养箱中静置，3天后观察表型，并统计晚疫病病情指数。结果显示，超量表达StCuRG1的转基因马铃薯叶片OE-2、OE-3、OE-6比对照组Desiree叶片更加抗病，如图6中（a）所示；如图6中（b）所示，过表达组OE-2、OE-3、OE-6病情指数也显著低于对照组。综上所述，超量表达StCuRG1基因提高马铃薯对晚疫病的抗病能力，StCuRG1超量表达马铃薯对晚疫病更加抗病。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.过表达马铃薯StCuRG1基因在增强马铃薯对晚疫病抗性方面的应用，所述马铃薯StCuRG1基因，选自如下核苷酸序列的至少一种：
a，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
b，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
c，SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
d，编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
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