CN117802150A - 水稻每穗粒数和粒重相关mog1蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

水稻每穗粒数和粒重相关mog1蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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CN117802150A
CN117802150A CN202410013545.XA CN202410013545A CN117802150A CN 117802150 A CN117802150 A CN 117802150A CN 202410013545 A CN202410013545 A CN 202410013545A CN 117802150 A CN117802150 A CN 117802150A
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plant
mog1
grain
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张战营
胡乾峰
韩迎春
李俊周
李自超
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China Agricultural University
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Abstract

本发明公开了水稻每穗粒数和粒重相关蛋白MOG1及其编码基因与应用，属于生物技术领域，具体公开了蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；A1)提高禾本科植物产量中的应用和/或制备提高禾本科植物产量产品中的应用；A2)提高禾本科植物每穗粒数中的应用和/或制备提高禾本科植物每穗粒数产品中的应用；A3)提高禾本科植物粒重中的应用和/或制备提高禾本科植物粒重产品中的应用，可用于产量和/或每穗粒数和/或粒重的育种和实验。

Description

水稻每穗粒数和粒重相关MOG1蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及遗传工程领域中水稻每穗粒数和粒重相关MOG1蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
产量性状一直是粮食作物育种研究的重要主题。目前，在有限的耕地资源下，世界人口数量依然呈增加趋势，尤其在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。水稻是最重要的粮食作物之一，世界上有超过一半以上人口以水稻为主食。因此，水稻产量性状相关基因的发掘与利用对世界粮食安全有着非常重要的意义。
水稻增产通常利用常规杂交技术或者基因编辑手段增加水稻每穗粒数来实现。近几十年的水稻育种实践证明，提高每穗粒数是增加水稻产量最有效的途径之一。但是，不同农艺性状之间往往存在着此消彼长的权衡效应。有效穗数、每穗粒数和粒重是水稻产量的主要三个核心要素，它们之间通常存在一定的负相关性，特别是每穗粒数和粒重之间。因此，通过图位克隆技术挖掘同时提高水稻每穗粒数和粒重的基因，不仅对提高水稻的收获指数有着重要的意义，也可以为选取合适的基因进行分子设计育种提供重要的理论指导。
发明内容
本发明解决的技术问题是提高植物产量、每穗粒数和粒重，尤其是水稻。
为了解决上述问题，本发明提供了一种提高植物产量和/或每穗粒数和/或粒重的方法。
所述方法包括将通过上调或增强或提高植物中蛋白质的编码基因的表达，和/或所述蛋白质的活性和/或含量来提高植物产量和/或每穗粒数和/或粒重；
所述蛋白质为如下任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
本申请中，所述植物可为水稻。
上文中，所述生物产量可为植物一生中生产和积累的有机物的总量，不包括根系。所述生物产量可为单株地上植株的风干重。
所述经济产量为栽培目的所需要的产品收获量。所述经济产量可为禾本科植物的主茎穗重。
为了解决上述问题，本发明还提供了一种培育高产量和/或每穗粒数和/或粒重植物的方法。
所述方法包括上调或增强或提高目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，和/或所述蛋白质的活性和/或含量得到高产量和/或每穗粒数和/或粒重植物，所述高产量和/或每穗粒数和/或粒重植物的产量和/或每穗粒数和/或粒重高于所述目的植物。
上述的方法中，所述上调或增强或提高植物中上述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入上述B1)所述的核酸分子、B2)所述的表达盒或B3)所述的重组载体。
上文中，所述核酸分子可为序列1所述的核酸分子。
为了解决上述问题，本发明还提供了下述应用。
蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；
A1)提高禾本科植物产量中的应用和/或制备提高禾本科植物产量产品中的应用；
A2)提高禾本科植物每穗粒数中的应用和/或制备提高禾本科植物每穗粒数产品中的应用；
A3)提高禾本科植物粒重中的应用和/或制备提高禾本科植物粒重产品中的应用；
所述蛋白质为如下任一种蛋白质：
F1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
F2)将F1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
F3)将F1)或F2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质为下述任一种：
B1)、编码利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B8)、抑制或降低或下调权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的核酸分子；
B9)、表达B8)所述核酸分子的编码基因；
B10)、含有B9)所述基因的表达盒；
B11)、含有B9)所述基因的重组载体、或含有B10)所述表达盒的重组载体；
B12)、含有B9)所述基因的重组微生物、或含有B10)所述表达盒的重组微生物、或含有B11)所述重组载体的重组微生物；
B13)、含有B9)所述基因的转基因植物细胞系、或含有B10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B11)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B14)、含有B9)所述基因的转基因植物组织、或含有B10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B11)所述重组载体的转基因植物组织；
B15)、含有B9)所述基因的转基因植物器官、或含有B10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B11)所述重组载体的转基因植物器官。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由236个氨基酸残基组成。将其命名为MOG1蛋白。其编码基因为MOG1基因。
本申请中，所述调控可为过表达上调或增强或提高，和/或敲除或降低或减少。
本申请中，所述过表达上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或所述蛋白质的活性或含量可提高禾本科植物产量和/或高禾本科植物每穗粒数和/或禾本科植物粒重。敲除或降低或减少所述蛋白质的编码基因表达的物质或所述蛋白质的活性或含量可降低禾本科植物产量和/或高禾本科植物每穗粒数和/或禾本科植物粒重。
本申请中，所述产量可为单株产量和/或单位面积产量/或亩产量。
上述的应用中，所述蛋白来源于水稻。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
B1)或B8)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质MOG1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质MOG1的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质MOG1且具有蛋白质MOG1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pROKII载体；
上述生物材料中，B2)或B9)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcids Res.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。
上述B3)或B11)中，所述重组载体可为用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为Gateway***载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、pMDC85或pCAMBIA1391-Xb。使用MOG1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。作为一个具体实施例，本申请使用pTCK303载体作为表达载体。作为一个具体实施例，本申请使用pC1300-Cas9载体作为基因敲除载体。
作为一个具体实施例，所述重组微生物中的微生物菌株可为农杆菌EHA105。
上述的应用中，B1)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列1所示的DNA分子。
上述的应用中，B8)所述核酸分子为靶向上述蛋白质编码基因的gRNA，所述gRNA的靶标序列为序列4或5。
为了解决上述问题，本发明提供了一种培育低产量和/或穗粒数和/或粒重植物的方法。
所述方法包括下调或减弱或降低目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，和/或所述蛋白质的活性和/或含量得到低产量和/或每穗粒数和/或粒重植物，所述低产量和/或每穗粒数和/或粒重植物的产量和/或每穗粒数和/或粒重低于所述目的植物。
如上任一所述的方法或任一所述的应用中，所述植物为如下任一种：
J1)禾本科植物；
J2)稻属植物；
J3)水稻。
上述的蛋白质或所述的核酸分子。
有益效果
bHLH是一类在植物生长发育过程中非常重要的转录因子，通常包含两个结构域：碱性结构域和螺旋环螺旋结构域。其中包含完整的bHLH结构域的称为典型bHLH转录因子，只含有HLH结构域的称为非典型bHLH转录因子。目前在水稻中，已经鉴定到多个bHLH转录因子能够调控水稻每穗粒数和粒重。例如，bHLH123表型温和的突变体枝梗数目减少，穗粒数减少，表型严重的突变体甚至没有穗粒数；bHLH170可以编码非典型bHLH蛋白，正向调控水稻籽粒重量。
本发明发现了一个与产量和/或每穗粒数和/或粒重相关联的基因，将其命名为MOG1基因。
本发明所涉及的水稻每穗粒数和粒重相关蛋白MOG1及其编码基因已经被发表过参与调控水稻根长和根粗。bHLH120能够被PEG、盐和脱落酸强烈诱导，并且在PEG和盐胁迫条件下，近等基因系IL392根中bHLH120的表达量要高于轮回亲本Yuefu。
本发明构建了MOG1基因过表达载体,利用农杆菌EHA105导入野生型Yuefu，获得MOG1基因过表达植株Ubi:MOG1IR109-1、Ubi:MOG1IR109-3；构建了MOG1基因敲除载体，利用农杆菌EHA105导入野生型IRAT109，获得MOG1基因敲除植株MOG1-cas9-4、MOG1-cas9-9。
分别考察野生型Yuefu、Ubi:MOG1IR109-1、Ubi:MOG1IR109-3和野生型IRAT109、MOG1-cas9-4、MOG1-cas9-9的穗部表型，结果显示：过表达植株(Ubi:MOG1IR109-1、Ubi:MOG1IR109-3)的每穗粒数、粒长、粒宽(只有Ubi:MOG1IR109-3)和千粒重显著高于野生型Yuefu；敲除植株(MOG1-cas9-4、MOG1-cas9-9)的每穗粒数、粒长、粒宽和千粒重显著低于野生型IRAT109。
附图说明
图1MOG1基因图位克隆结果及近等基因系表型统计图；
图2过表达株系表达量、敲除株系敲除位点示意图；
图3过表达转基因株系表型及统计图；
图4敲除转基因株系表型及统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用GraphPad Prism 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-wayANOVA检验，多重比较不同字母间具有显著性差异P＜0.05(*)。
实例1、培育高或低产量和/或每穗粒数和/或粒重的水稻
提取IRAT109幼穗的总RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，使用MOG1-OE-F/MOG1-OE-R引物对IRAT109中MOG1的CDS进行克隆，得到带有重组臂的MOG1-CDS的PCR产物。
所用引物如下所示：
MOG1-OE-F:5’-CGGGGTACCATGGACTTCGACTTGTTCAAT-3’(划线部分为重组臂序列)
MOG1-OE-R:5’-CGGACTAGTCCTACCACGGAGCGTGGTGCT-3’。(线部分为重组臂序列)
将带有重组臂的MOG1-CDS的PCR产物通过同源重组的方法连接至植物过表达载体pTCK303(载体pTCK303记载于下属文献中：Zhang et al.；Natural variation in CTB4aenhances rice adaptation to coldhabitats.Nat Commun.2017Mar 23；8:14788.doi:10.1038/ncomms14788.PMID:28332574；PMCID:PMC5376651.)，具体方法如下：
超表达载体MOG1-OE是将载体pTCK303的限制性内切酶SacI与kpnI识别位点之间的片段替换为MOG1的CDS(序列1)的DNA片段，保持载体pTCK303其他序列不变得到的重组载体，得到重组载体，将重组载体命名为超表达载体MOG1-OE。
SEQ ID No.1(序列1)具体如下：
ATGGACTTCGACTTGTTCAATTCCTACCCGGAATCGCAGCTTGACCTGATGAGCACGATGCTTCAGCTGGAGCAGCTCACTACGCTCAGTGACCAGTCGCTGTTCATGGCGGCGCCGACGTCGCCGCCGGTATCACCCATGGGGACCCCTTCTCCCCAGTTCTCACCACCGCCGCAGATGTCGGTCACCACCACCACCGCCGGTGGCGGTTACCAGGATCAGTATAACTCCATGCCGGCAACGTACGGCGCCGGTGCGGGCGTGCACCAGCTGGACTTCGCGATGTCGTCACCGGGCTCCGACTCCGGCGCGCCGCAGGGCTCGTCGTCGTCGTCCTCGTCGGAGGCGATGCGGGAGATGATCTTCCACATCGCGGCGCTGCAGCCGGTGGAGATCGACCCGGAGGCCGTGCGGCCGCCGAAGCGGCGCAACGTGCGCATCTCCAAGGACCCGCAGAGCGTGGCGGCGCGGCTGCGGCGGGAGCGCATCAGCGAGCGCATCCGCATCCTGCAGCGGCTCGTCCCGGGCGGCACCAAGATGGACACCGCCTCCATGCTCGACGAGGCCATCCACTACGTCAAGTTCCTCAAGTCCCAGGTGCAGTCCCTCGAGCGTGCCGCCGCCGCCCACCGCGCCGCCGCATTCGGCGCCGCCTACCCAGCTGCCTTACCCATGCAGCACCACGCTCCGTGGTAG。
SEQ ID No.1编码氨基酸序列是SEQ ID No.2(序列2)的蛋白质。基因MOG1的核苷酸序列为SEQ ID No.3，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNo.2。将其命名为MOG1蛋白；其CDS序列为SEQ ID No.1。
SEQ ID No.2(序列2)具体如下：
MDFDLFNSYPESQLDLMSTMLQLEQLTTLSDQSLFMAAPTSPPVSPMGTPSPQFSPPPQMSVTTTTAGGGYQDQYNSMPATYGAGAGVHQLDFAMSSPGSDSGAPQGSSSSSSSEAMREMIFHIAALQPVEIDPEAVRPPKRRNVRISKDPQSVAARLRRERISERIRILQRLVPGGTKMDTASMLDEAIHYVKFLKSQVQSLERAAAAHRAAAFGAAYPAALPMQHHAPW*。
SEQ ID No.3(序列3)具体如下：
AACAGCACATACCATTGCAAGAAACCCTTCACATCTTACTGAAACAGCTACTACTCCTGCTAGCTAGCTCAAGCTCAAGCTCAATCTCAAGCTCTTTCCACTAAGCTCCGTATGGACTTCGACTTGTTCAATTCCTACCCGGAATCGCAGCTTGACCTGATGAGCACGATGCTTCAGCTGGAGCAGCTCACTACGCTCAGTGACCAGTCGCTGTTCATGGCGGCGCCGACGTCGCCGCCGGTATCACCCATGGGGACCCCTTCTCCCCAGTTCTCACCACCGCCGCAGATGTCGGTCACCACCACCACCGCCGGTGGCGGTTACCAGGATCAGTATAACTCCATGCCGGCAACGTACGGCGCCGGTGCGGGCGTGCACCAGCTGGACTTCGCGATGTCGTCACCGGGCTCCGACTCCGGCGCGCCGCAGGGCTCGTCGTCGTCGTCCTCGTCGGAGGCGATGCGGGAGATGATCTTCCACATCGCGGCGCTGCAGCCGGTGGAGATCGACCCGGAGGCCGTGCGGCCGCCGAAGCGGCGCAACGTGCGCATCTCCAAGGACCCGCAGAGCGTGGCGGCGCGGCTGCGGCGGGAGCGCATCAGCGAGCGCATCCGCATCCTGCAGCGGCTCGTCCCGGGCGGCACCAAGATGGACACCGCCTCCATGCTCGACGAGGCCATCCACTACGTCAAGTTCCTCAAGTCCCAGGTGCAGTCCCTCGAGCGTGCCGCCGCCGCCCACCGCGCCGCCGCATTCGGCGCCGCCTACCCAGCTGCCTTACCCATGCAGCACCACGCTCCGTGGTAGCTGCACGCTACTAGCTCCCACATGGATAGATGGTGATGAGACAATCGTTTCCCATTACTATCGCGTCTCACATGCTTGTCGCCGTCGTCGTCGTCGATCGATCAATCACCACTGCTGCTGCTGCAGCATGCATGATCACATGCATGTGTAAATTAGTAGTACAAGATGTAGGAGACTACCTGATTACTAGTACCATTTATTATTGCTGTTGTTACCGCATGCTAGCTCGTACGTACGTGGCTGCTCCGAGCTTTTGTTGGACTCGCAGCCCGTACGTGCATGCGCGTTTCATTCGACCGTAGGCTTGTACTGTACTGTACACATTTCCTTCTATTCTACCCCCCTGTTCAATGCAGTACGTTTCCCGT。
一、超表达载体的构建
提取IRAT109幼穗的总RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，使用MOG1-OE-F/MOG1OE-R引物对IRAT109中MOG1的CDS进行克隆，得到带有重组臂的MOG1-CDS的PCR产物，所用引物如下所示：
MOG1-OE-F:5’-CGGGGTACCATGGACTTCGACTTGTTCAAT-3’
MOG1-OE-R:5’-CGGACTAGTCCTACCACGGAGCGTGGTGCT-3’
反应体系如下：
表1
成分 体积
2×buffer 25μL
DNA模板 1μL
引物(F+R) 2μL
Gflex酶 1μL
ddH2O 21μL
PCR程序如下：
94℃1min(98℃10s，60℃15s，68℃1-kb/min)34cycles，68℃10min，20℃2min。
将载体pTCK303载体使用限制性内切酶进行酶切，获得线性载体。
将上述带有重组臂的MOG1-CDS的PCR产物与上述线性载体进行重组酶连接，获得超表达载体MOG1-OE。重组酶连接体系如下：
表2
超表达载体MOG1-OE是将载体pTCK303的限制性内切酶SacI与kpnI识别位点之间的片段替换为MOG1的CDS(序列1)的DNA片段，保持载体pTCK303其他序列不变得到的重组载体，将重组载体命名为超表达载体MOG1-OE。
上述引物均为5’到3’方向书写。
二、敲除载体的构建
(1)登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选靶位点。靶位点最好带酶切位点【Cas9切割点(离PAM/NGG3bp)位于酶切位点中】。也可以手动设计靶位点，然后到http://www.rgenome.net/cas-offinder/网站评估脱靶情况。预测靶位点编辑效率可使用http://www.crisprscan.org/？page＝sequence网站。本研究设计的靶位点序列为：5’-GATGAGCACGATGCTTCAGC-3’(SEQ ID No.4)。
(2)设计两个互补DNA序列分别为：在正向靶序列前加GGCA，在反向互补靶序列前加AAAC。(如下：)
F：5’-GGCAGATGAGCACGATGCTTCAGC-3’；
R：5’-AAACGCTGAAGCATCGTGCTCATC-3’。
(3)中间载体的构建：
a.SK-gRNA载体(载体SK-gRNA记载于下属文献中：Li et al.；RGN1controlsgrain number and shapes panicle architecture in rice.Plant BiotechnolJ.2022Jan；20(1):158-167.doi:10.1111/pbi.13702.Epub 2021Sep 22.PMID:34498389；PMCID:PMC8710824.)进行AarI酶切(Ferment公司)，形成带有粘性末端的载体；
b.F链与R链混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段；
c.将载体和片段进行连接(摩尔浓度1:3-10)，转化DH5，得到连接质粒；可用引物T3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)与R链搭配进行菌落PCR阳性检测。
d.利用公共引物T7(TAATACGACTCACTATAGGG)或T3进行测序检测，验证是否正确，正确载体命名为SK-gRNA-MOG1。
(4)构建至最终载体：pC1300-Cas9载体(载体SK-gRNA记载于下属文献中：Li etal.；RGN1 controls grain number and shapes panicle architecture in rice.PlantBiotechnol J.2022Jan；20(1):158-167.doi:10.1111/pbi.13702.Epub2021Sep 22.PMID:34498389；PMCID:PMC8710824.)用KpnI和BamHI进行酶切。将步骤(3)中构建的SK-gRNA-MOG1用KpnI和BglII进行酶切并回收片段。并将片段连接到pC1300-Cas9载体上，所得重组载体经测序验证正确命名为MOG1-CR。
三、转基因水稻的获得
(1)重组菌
将上述一、二制备的超表达载体MOG1-OE与敲除载体MOG1-CR冻融法转化根癌农杆菌EHA105，得到EHA105/超表达载体MOG1-OE和EHA105/敲除载体MOG1-CR。EHA105/超表达载体MOG1-OE是含有超表达载体MOG1-OE根癌农杆菌EHA105，EHA105/敲除载体MOG1-CR是含有敲除载体MOG1-CR的根癌农杆菌EHA105。用于侵染转基因受体品种的愈伤。
(2)转水稻
采取经典的农杆菌介导的愈伤侵染方法，具体步骤如下：
a、胚性愈伤的获得：将成熟的野生型Yuefu/IRAT109种子去壳后用酒精消毒，再用消毒无菌水漂洗一次，风干3h。接种于NB培养基，28℃暗培养2周，将胚性愈伤剥下，继代至新的NB培养基，继代培养2周(继代两次)。
b、制备侵染液：分别吸取保存的EHA105/超表达载体MOG1-OE和EHA105/敲除载体MOG1-CR，涂布到含利福平和相应抗生素固体培养基上，28℃倒置暗培养2d，刮取少量农杆菌至AAM液体培养基中，菌液浓度OD600约为0.3。
c、共培养挑选自然分散、颜色鲜黄、直径约为3～5mm的颗粒状愈伤组织至三角瓶中，加入制备好的侵染液，侵染10min，用无菌滤纸吸取多余的侵染液，置于铺有一层滤纸的共培养培养基上，20℃共培养2～3d。
d、抗性愈伤组织的筛选：将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗5～6次，再用含头孢霉素和羧苄青霉素的无菌水清洗20min，最后置于无菌滤纸上沥干3h。然后移到延迟筛选培养基上。一周后移至到第一轮筛选培养基上，两周后再移至到第二轮筛选培养基上，继续培养两周。
e、分化将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，28℃暗培养2周，然后转移至分化培养基上，光照培养2-3周，得到再生转基因幼苗植株。
f、将幼苗移至壮苗培养基上，待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基，炼苗1-2周，移至大田栽种，直至成熟，以野生型Yuefu/IRAT109为对照，使用过表达株系PCR鉴定引物检测过表达植株，确认正确后，获得EHA105/超表达载体MOG1-OE转化的T0代幼苗20株，分别将其命名为Ubi:MOG1IR109-1-Ubi:MOG1IR109-20。获得EHA105/敲除载体MOG1-CR转化的T0代幼苗20株，分别将其命名为MOG1-cas9-1-MOG1-cas9-20。
上述转基因过程中所用培养基配方如表3所示。
表3转基因过程中所用各培养基配方
注：NB培养基基本成分包括N6大量元素，B5微量元素，B5有机成分，150mg/L肌醇，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，600mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶。
四、各转基因植株的阳性株系筛选
将上述Ubi:MOG1IR109-1、Ubi:MOG1IR109-3和MOG1-cas9-4、MOG1-cas9-9分别自交获得Ubi:MOG1IR109-1、Ubi:MOG1IR109-3和MOG1-cas9-4、MOG1-cas9-9的T2代纯合植株种子，即Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株种子、Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株种子、MOG1-cas9-4的T2代纯合植株种子、MOG1-cas9-9的T2代纯合植株种子。
结果如图2(图2为过表达植株表达量鉴定和敲除位点示意图)所述，图2中(b)为MOG1-cas9-4、MOG1-cas9-9的突变区序列，WT为IRAT109。
MOG1-cas9-4的T2代杂合植株与WT(IRAT109)相比，水稻一条染色体中MOG1基因发生了如下突变：在MOG1基因(序列3)的第241至242位核苷酸之间有一个核苷酸T***，对应于MOG1基因的cDNA(序列1)的第64至65位核苷酸之间有一个核苷酸T***，从而将MOG1基因敲除。
MOG1-cas9-9的T2代杂合植株与WT(IRAT109)相比，水稻一条染色体中MOG1基因发生了如下突变：在MOG1基因(序列3)的第241至242位核苷酸之间有一个核苷酸A***，对应于MOG1基因的cDNA(序列1)的第64至65位核苷酸之间有一个核苷酸A***，从而将MOG1基因敲除。
将WT(Yuefu)种子、Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株种子、Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株种子和WT(IRAT109)、MOG1-cas9-4的T2代纯合植株种子、MOG1-cas9-9的T2代纯合植株种子进行鉴定：
将上述WT(Yuefu)种子、Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株种子、Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株种子和WT(IRAT109)、MOG1-cas9-4的T2代纯合植株种子、MOG1-cas9-9的T2代纯合植株种子进行种植，孕穗期，提取水稻叶片植株的总RNA，反转录成cDNA，利用组成性表达的Ubiquitin基因作为内参(Ubi-F:ACCAGCTGAGGCCCAAGA；Ubi-R:ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA)，将样品cDNA浓度均一化。然后用MOG1基因的特异引物MOG1-RT-F(5’-AGCTTGACCTGATGAGCACG-3’)和MOG1-RT-R(5’-GCCGGCATGGAGTTATACTGA-3’)进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析，用2-△△CT法(LivakKJ,SchmittgenTD.2001.Analysis ofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2-△△CTmethod.Methods.25:402-408)分析MOG1基因在RNA水平上的表达情况，每组样品重复3次，结果如图2中(a)所示，WT为Yuefu，Ubi:MOG1IR109-1为Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株，Ubi:MOG1IR109-3为Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株。
以WT(Yuefu)为对照，Ubiquitin基因作为内参，使用过表达植株表达量鉴定荧光定量引物，检测Ubi:MOG1IR109-1、Ubi:MOG1IR109-3的表达量：
表4
SYBR Premix Ex Taq 5μl
引物(F+R) 0.4μl
Dye 2 0.2μl
cDNA 1μl
ddH2O 3.4μl
实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems 7500Real TimePCR system(ABI,USA)上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和SchmittgenTD(2001)报道的方法，即2-ΔΔCT计算相对表达量。
ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Ubiquitin)Time x－(CT.Target－CT.Ubiquitin)Time 0；Time x表示任意时间点，Time 0表示经Ubiquitin校正后1倍量的目标基因表达。
结果如图2所示，(图2为过表达植株表达量鉴定、敲除位点示意图)所述，图2中(a)，WT为WT(Yuefu)，Ubi:MOG1IR109-1为Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株，Ubi:MOG1IR109-3为Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株，纵坐标为荧光定量检测结果，表明这两个过表达纯合株系的表达量显著高于野生型，用于下述实验。
五、各转基因水稻相关性状鉴定
人工调查步骤四获得的各转基因水稻阳性株系以及其对应受体品种的每穗粒数、粒重和单株产量。
材料与方法
试验地概况
北京气候属暖温带半湿润半干旱季风气候。年平均气温，平原地区为11～13℃，年极端最高气温一般在35～40℃之间。年极端最低气温一般在－14～－20℃之间。年降水量空间分布不均匀，西北部和北部深山区少于500毫米，平原及部分山区在500～600毫米之间。夏季降水量约占年降水量的3/4。试验具体地点位于北京市海淀区上庄镇辛力屯村东，中国农业大学试验站，坐标：116.192123,40.143353，西侧临近西山山脉，属于旱田种植区，需要灌溉。将上述WT(IRAT109)、MOG1-cas9-4的T2代纯合植株种子、MOG1-cas9-9的T2代纯合植株种子和WT(Yuefu)种子、Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株种子、Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株种子进行下述种植。
试验设计
实验采用随机区组设计，每个栽培区3次重复。每个小区的面积均为4m2(2m×2m)。
栽培水稻
预处理土地
于2022年4月26日对土地进行深耕翻，疏松土壤除杂草，对土地进行灌溉，
播种育秧
本实施例于2022年5月1日播种，本实施例所有试验区播种在一天内完成。
拔秧插秧
于2022年6月1日，在灌溉好的平整的试验地，平作栽培区中，进行插秧。行距23.3cm，株距13.3cm。
田间管理
定期灌溉；定期进行杂草防除，采用人工拔除的方式，整个实验阶段没有施肥。
指标检测
当上述植株(WT(IRAT109)、MOG1-cas9-4的T2代纯合植株种子、MOG1-cas9-9的T2代纯合植株种子和WT(Yuefu)种子、Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株种子、Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株种子)生长至籽粒黄熟期时(本实施例中的具体日期为2022年10月26日)对上述各植株进行种植情况、表型及枝梗数进行拍照记录，并检测每穗粒数、粒重、单株产量、单位面积产量。
每穗粒数：单个穗子上着生的所有籽粒数为穗粒数。每个株系考查10个单株，每个单株考查3个穗子。
粒重：随机选取约100粒饱满的水稻籽粒测量粒长(单位为mm)、粒宽(单位为mm)和千粒重(单位为g)。每个株系考查10个单株，每个单株考查3个穗子。
单株产量：单个植株上所有实粒的重量为单株产量，单位为g。每个株系考查25个单株
单位面积产量：将小区内所有植株脱粒，除去瘪粒后进行称重，得到小区产量。将其换算成单位面积产量，单位Kg/ha。每个小区有三个重复。
数据处理
用Excel对数据进行初步整理，用GraphPadPrism 8软件中的ANOVA模型进行显著性分析，结果用平均值±标准误表示。用GraphPadPrism 8软件进行作图。
结果与分析
WT(Yuefu)种子、Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株、Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株每穗粒数、粒重、单株产量和单位面积产量检测结果如图3所示。图3中WT为Yuefu，Ubi:MOG1IR109-1为Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株、Ubi:MOG1IR109-3为Ubi:MOG1IR109-3的T2代纯合植株；(a)为黄熟期过表达系株型图，(b)为收种后过表达系穗型图，(c)为每穗粒数，(d)为粒长，单位为mm，(e)为粒宽，单位为mm，(f)为千粒重，单位为g，(g)为大田种植状态图，(h)为单株产量，单位为g，(i)为小区面积产量，单位为Kg/ha。
WT(IRAT109)、MOG1-cas9-4的T2代纯合植株、MOG1-cas9-9的T2代纯合植株每穗粒数、粒重、单株产量和单位面积产量检测结果如图4所示。图4中WT为IRAT109，MOG1-cas9-4为MOG1-cas9-4的T2代纯合植株、MOG1-cas9-9为MOG1-cas9-9的T2代纯合植株；(a)为黄熟期过表达系株型图，(b)为收种后过表达系穗型图，(c)为每穗粒数，(d)为粒长，单位为mm，(e)为粒宽，单位为mm，(f)为千粒重，单位为g，(g)为大田种植状态图，(h)为单株产量，单位为g，(i)为小区面积产量，单位为Kg/ha。
结果表明：过表达植株(Ubi:MOG1IR109-1的T2代纯合植株、MOG1-cas9-9的T2代纯合植株)每穗粒数、粒长、粒宽(只有Ubi:MOG1IR109-3)和千粒重显著高于WT(Yuefu/日本晴)。敲除植株(MOG1-cas9-4的T2代杂合植株、MOG1-cas9-9的T2代杂合植株)每穗粒数、粒长、粒宽和千粒重显著低于WT(IRAT109)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种提高植物产量和/或每穗粒数和/或粒重的方法，其特征在于，包括将通过上调或增强或提高植物中蛋白质的编码基因的表达，和/或所述蛋白质的活性和/或含量来提高植物产量和/或每穗粒数和/或粒重；
所述蛋白质为如下任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.一种培育高产量和/或每穗粒数和/或粒重植物的方法，其特征在于，包括上调或增强或提高目的植物中权利要求要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或所述蛋白质的活性和/或含量得到高产量和/或每穗粒数和/或粒重植物，所述高产量和/或每穗粒数和/或二次枝梗数植物的产量和/或每穗粒数和/或粒重高于所述目的植物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述上调或增强或提高植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入权利要求4中B1)所述的核酸分子、B2)所述的表达盒或B3)所述的重组载体。
4.蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下任一种中的应用；
A1)提高禾本科植物产量中的应用和/或制备提高禾本科植物产量产品中的应用；
A2)提高禾本科植物每穗粒数中的应用和/或制备提高禾本科植物每穗粒数产品中的应用；
A3)提高禾本科植物粒重中的应用和/或制备提高禾本科植物粒重产品中的应用；
所述蛋白质为如下任一种蛋白质：
F1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
F2)将F1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
F3)将F1)或F2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质为下述任一种：
B1)、编码利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B8)、抑制或降低或下调权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的核酸分子；
B9)、表达B8)所述核酸分子的编码基因；
B10)、含有B9)所述基因的表达盒；
B11)、含有B9)所述基因的重组载体、或含有B10)所述表达盒的重组载体；
B12)、含有B9)所述基因的重组微生物、或含有B10)所述表达盒的重组微生物、或含有B11)所述重组载体的重组微生物；
B13)、含有B9)所述基因的转基因植物细胞系、或含有B10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B11)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B14)、含有B9)所述基因的转基因植物组织、或含有B10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B11)所述重组载体的转基因植物组织；
B15)、含有B9)所述基因的转基因植物器官、或含有B10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B11)所述重组载体的转基因植物器官。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白来源于水稻。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，B1)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列1所示的DNA分子。
7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，B8)所述核酸分子为靶向权利要求1中所述蛋白质编码基因的gRNA，所述gRNA的靶标序列为序列4。
8.一种培育低产量和/或每穗粒数和/或粒重的方法，其特征在于，包括下调或减弱或降低目的植物中权利要求要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到低产量和/或每穗粒数和/或粒重植物，所述低产量和/或每穗粒数和/或粒重植物的产量和/或每穗粒数和/或粒重低于所述目的植物。
9.如权利要求1-3或8任一所述的方法或权利要求4-7任一所述的应用，其特征在于，所述植物为如下任一种：
J1)禾本科植物；
J2)稻属植物；
J3)水稻。
10.权利要求4中所述的蛋白质或所述的核酸分子。
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