CN114214370B - 一种提高曲霉产有机酸效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高曲霉产有机酸效率的方法，所述方法将曲霉菌发酵培养基灭菌后，加入废弃的虫草发酵液至曲霉菌发酵培养基中，得改进的曲霉发酵培养基，接种10%的曲霉种子液于改进的曲霉发酵培养基中，充分混匀后于摇床震荡培养，即得曲霉产有机酸。本发明方法采用非基因工程的方法，通过外源添加废弃虫草发酵液，改变了曲霉菌发酵培养基营养成分组成，强化胞内合成途径，提高了有机酸生产强度，缩短发酵周期，提高有机酸生产效率，降低发酵成本。本发明通过简单的外源添加改善了现有技术条件中曲霉菌发酵生产有机酸周期长、效率低的问题。

Description

一种提高曲霉产有机酸效率的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种提高曲霉产有机酸效率的方法。

背景技术

有机酸是指广泛存在于生物中的含有羧基的酸性有机化合物（除氨基酸），包括苹果酸、柠檬酸和富马酸等。这些有机酸多参与动植物代谢的生命过程，能够作为代谢的中间产物，或者具有显著的生物活性，是有机合成和医药产品开发的重要原料，在食品、药品及化工等领域有着广泛用途，具有很大的市场应用价值。

大多数有机酸是微生物代谢途径中的中间产物，利用微生物以可再生生物质资源为原料发酵生产有机酸的工艺极具发展前途。曲霉菌因其发酵过程所需的营养源简单，可显著降低生产成本，被视为生产有机酸的理想微生物，但利用曲霉菌发酵生产有机酸还存在发酵周期较长，生产效率低的问题。现有的解决这一问题的方法主要是通过菌株的选育，而目前现有技术中对有机酸生产菌株的选育仍集中在提高菌株的产酸上，少有缩短发酵周期，提高有机酸生产效率的选育方法。

微生物发酵伴随着大量发酵副产物的产生，如有机酸、核苷、氨基酸和蛋白质等。常见的发酵液处理方法是将菌体经过简单处理后作为有机肥使用。这降低了产品的附加值，是对资源的浪费。采用适当的策略对发酵后产生的发酵液进行处理和再生，可以大大减少资源浪费和环境污染。若能通过回收利用废弃发酵液改变培养基成分，缩短菌株的发酵周期，提高生产效率，则有利于降低微生物发酵有机酸的生产成本，在微生物发酵产有机酸工业中将具有较好的应用前景。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种提高曲霉产有机酸效率的方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种提高曲霉产有机酸效率的方法，所述方法将曲霉菌发酵培养基灭菌后，加入废弃的虫草发酵液至曲霉菌发酵培养基中，得改进的曲霉发酵培养基，接种10%的曲霉种子液于改进的曲霉发酵培养基中，充分混匀后于摇床震荡培养，即得曲霉产有机酸。

进一步地，所述曲霉菌为米曲霉或黑曲霉。

进一步地，所述米曲霉为米曲霉NRRL 3488，所述黑曲霉为黑曲霉 ATCC 1015。

进一步地，所述曲霉菌发酵培养基为：8~11%葡萄糖，0.02~0.04%的金属离子，2~3%的氮源，115℃、30 min灭菌，即得；

其中，上述百分数为质量终浓度；

所述曲霉种子液的制备如下：

2~4%葡萄糖，0.01~0.02%的金属离子，1~2%的氮源，115℃、30 min灭菌，接种曲霉孢子1.5×10⁶个/mL，30℃、200 rpm培养14-20 h，即得；

其中，上述百分数为质量终浓度。

进一步地，所述废弃虫草发酵液和发酵培养基的体积比为：1-3：5。

进一步地，所述废弃的虫草发酵液为蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液中的一种或两种以上的混合液。

进一步地，所述废弃虫草发酵液和发酵培养基的体积比为：1-3：5，其中，所述废弃虫草发酵液为单种虫草发酵液或两种以上虫草发酵液的混合液；

或者，当同时添加蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液中的两种的混合液时，每种虫草发酵液的添加量为混合液总体积的1/2，当同时添加蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液时，每种虫草发酵液的添加量为混合液总体积的一半1/3。

进一步地，所述有机酸为苹果酸、柠檬酸。

进一步地，所述废弃的虫草发酵液的制备方法是：

（1）收集虫草经液体深层发酵并提取菌丝后产生的废液，采用两层纱布进行过滤，收集滤液a；

（2）采用WSW-6型微生物薄膜过滤器将滤液a进行过滤，得到滤液b；

（3）将滤液b浓缩至其原体积的1/3，得到浓缩发酵液c；

（4）将浓缩发酵液c经滤膜过膜，即得所用的废弃的虫草发酵液。

进一步地，所述曲霉发酵培养的条件是：温度25~35℃，转速180~220r/min，培养48~96h。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明方法采用非基因工程的方法，通过外源添加废弃虫草发酵液，改变了曲霉菌发酵培养基营养成分组成，提高了有机酸的生物合成能力，提高了有机酸生产强度，缩短发酵周期，提高有机酸生产效率，降低发酵成本。本发明通过简单的外源添加改善了现有技术条件中曲霉菌发酵生产有机酸周期长、效率低的问题。

2、本发明所用的虫草发酵液，含有少量的糖类、脂肪和生长因子以及丰富的以大分子形式存在的蛋白质、肽类等迟效氮源，进一步降解成小分子的肽和氨基酸后才被微生物吸收利用，其利用速度缓慢，有利于代谢产物的形成。通过在曲霉发酵培养基中添加废弃的虫草发酵液，调控速效氮源和迟效氮源的比例，控制菌体生长期和代谢产物形成期的协调，达到了缩短发酵周期和提高产量的目的。

3、本发明所用的虫草发酵液在本发明所加量的限制的范围内具有抑制细菌的作用。

4、本发明方法步骤简单，方便可行，仅需在曲霉菌发酵培养基中添加一定比例废弃的虫草发酵液，适于大范围绿色高效工业生产有机酸。

5、本发明对废弃的发酵液进行再利用，提高了产品的附加值，且不受季节限制，大大减少资源浪费和环境污染。

附图说明

图1为本发明中米曲霉发酵培养基中添加不同废弃虫草发酵液糖耗图；

图2为本发明中米曲霉发酵培养基中添加不同废弃虫草发酵液苹果酸生产强度图；

图3为本发明中黑曲霉发酵培养基中添加不同废弃虫草发酵液糖耗图；

图4为本发明中黑曲霉发酵培养基中添加不同废弃虫草发酵液柠檬酸生产强度图；

图5为本发明中米曲霉发酵培养基中叠加不同废弃虫草发酵液共同作用的糖耗图；

图6为本发明中米曲霉发酵培养基中叠加不同废弃虫草发酵液共同作用的苹果酸生产强度图；

图7为本发明中黑曲霉发酵培养基中叠加不同废弃虫草发酵液共同作用的糖耗图；

图8为本发明中黑曲霉发酵培养基中叠加不同废弃虫草发酵液共同作用的柠檬酸生产强度图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

一种提高曲霉产有机酸效率的方法，所述方法将曲霉菌发酵培养基灭菌后，加入废弃的虫草发酵液至曲霉菌发酵培养基中，得改进的曲霉发酵培养基，接种10%的曲霉种子液于改进的曲霉发酵培养基中，充分混匀后于摇床震荡培养，即得曲霉产有机酸。

较优地，所述曲霉菌为米曲霉或黑曲霉。

较优地，所述米曲霉为米曲霉NRRL 3488，所述黑曲霉为黑曲霉 ATCC 1015。

较优地，所述曲霉菌发酵培养基为：8~11%葡萄糖，0.02~0.04%的金属离子，2~3%的氮源，115℃、30 min灭菌，即得；

其中，上述百分数为质量终浓度；

所述曲霉种子液的制备如下：

2~4%葡萄糖，0.01~0.02%的金属离子，1~2%的氮源，115℃、30 min灭菌，接种曲霉孢子1.5×10⁶个/mL，30℃、200 rpm培养14-20 h，即得；

其中，上述百分数为质量终浓度。

较优地，所述废弃虫草发酵液和发酵培养基的体积比为：1-3：5。

较优地，所述废弃的虫草发酵液为蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液中的一种或两种以上的混合液。

较优地，所述废弃虫草发酵液和发酵培养基的体积比为：1-3：5，其中，所述废弃虫草发酵液为单种虫草发酵液或两种以上虫草发酵液的混合液；

或者，当同时添加蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液中的两种的混合液时，每种虫草发酵液的添加量为混合液总体积的1/2，当同时添加蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液时，每种虫草发酵液的添加量为混合液总体积的一半1/3。

较优地，所述有机酸为苹果酸、柠檬酸。

较优地，所述废弃的虫草发酵液的制备方法是：

（1）收集虫草经液体深层发酵并提取菌丝后产生的废液，采用两层纱布进行过滤，收集滤液a；

（2）采用WSW-6型微生物薄膜过滤器将滤液a进行过滤，得到滤液b；

（3）将滤液b浓缩至其原体积的1/3，得到浓缩发酵液c；

（4）将浓缩发酵液c经滤膜过膜，即得所用的废弃的虫草发酵液。

较优地，所述曲霉发酵培养的条件是：温度25~35℃，转速180~220r/min，培养48~96h。

具体地，相关的制备及检测如下：

本发明中涉及的培养基配制、发酵液残糖和有机酸含量的测定方法可以如下：

（1）培养基的配制：

种子培养基配制：2~4%葡萄糖，0.01~0.02%的金属离子，1~2%的氮源，115℃、30min灭菌，接种孢子1.5×10⁶个/mL，30℃、200 rpm培养14-20 h。

发酵培养基：8~11%葡萄糖，0.02~0.04%的金属离子，2~3%的氮源，115℃、30 min灭菌后，向发酵培养基中添加一定体积的废弃虫草发酵液，得到改进的发酵培养基，标记为P1，P2，接入种子液10%，发酵条件为温度30-35℃，搅拌速率200 rpm，使培养基P1，P2的残糖量至个位数时终止发酵，得到有机酸发酵液。

（2）发酵液中葡萄糖浓度的测定：取适量发酵液，于 12000×g 离心 5 min，将上清液用去离子水稀释 100 倍后使用 SBA-40E 生物传感分析仪测定。

（3）发酵液中有机酸含量的测定：充分混匀发酵液，迅速取 2 mL 于 10 mL EP 管中，缓慢加入等体积的 2 M 浓度的 HCl 充分酸解；然后 12000×g 离心 5 min，取上清液，稀释 20-50 倍后经 0.22 μm 孔径水系滤膜过滤待测。经高效液相色谱（HPLC）紫外检测法测定，使用伯乐 Aminex HPX-87H 色谱柱，流动相为 5 mM 稀硫酸，设置柱温 65°C，流动相流速 0.8 mL/min，波长 210 nm。

实施例1 通过外源添加废弃虫草发酵液提高曲霉菌生产苹果酸效率的方法

多个实验组的操作步骤基本相同，不同之处仅在于废弃虫草发酵液种类及用量不同，具体详见表1：

记录实验组1-3中发酵培养的时间（残糖量至个位数的时间），检测发酵培养过程中葡萄糖含量变化，计算有机酸生产效率。

无添加组A：该组为实验组1-3的对照组，采用与实验组相同的方法发酵生产有机酸，区别仅在于发酵培养基中不添加废弃虫草发酵液。

比较实验组1-3与对照组A有机酸生产效率，来验证外源添加废弃虫草发酵液对曲霉菌生产有机酸效率的提高作用。其中，对照组A和实验组1-3的结果见图1和图2。

如图1和图2所示，无添加照组A发酵时间96h，实验组1-3发酵时间分别是60 h、48h及60 h，发酵培养基外源添加废弃虫草发酵液后，相较于无添加对照组，发酵时间均显著缩短，生产效率显著提高；其中，实验组1提高了67.86%，实验组2提高了110.71%，实验组3提高了64.29%。

为了验证实验组1-3之间的叠加协同作用，按照上述废弃虫草发酵液添加量占比的50%添加，验证叠加废弃虫草发酵液对曲霉菌生产有机酸效率的提高作用。其中，对照组C和实验组1+2、1+3、2+3、1+2+3的结果见图5和图6。

如图5和图6所示，无添加对照组C发酵时间96h，实验组1+2、1+3、2+3、1+2+3发酵时间分别是60 h、48 h、48 h及36h，发酵培养基叠加废弃虫草发酵液后，相较于无添加对照组和单一添加组，发酵时间缩短，生产效率显著提高；其中，实验组1+2、1+3、2+3、1+2+3分别提高了78.57%、103.57%、96.43%、132.14%。

实施例2 通过外源添加废弃虫草发酵液提高曲霉菌生产柠檬酸效率的方法

多个实验组的操作步骤基本相同，不同之处仅在于废弃虫草发酵液种类及用量不同，具体详见表2：

记录具体实验组4-6中发酵培养的时间（残糖量至个位数的时间），检测发酵培养过程中葡萄糖含量变化，计算有机酸生产效率。

无添加组B：该组为实验组4-6的对照组，采用与实验组相同的方法发酵生产有机酸，区别仅在于发酵培养基中不添加废弃虫草发酵液。

比较实验组4-6与对照组B有机酸生产效率，来验证外源添加废弃虫草发酵液对曲霉菌生产有机酸效率的提高作用。其中，对照组B和实施例4-6的结果见图3和图4。

如图3和图4所示，对照组无添加发酵时间96 h，实施例4-6发酵时间分别是60 h、72 h及72 h。发酵培养基外源添加废弃虫草发酵液后，相较于对照组，发酵时间均显著缩短，生产效率显著提高；其中，实施例4提高了79.31%，实施例5提高了51.72%，实施例6提高了62.07%。

为了验证实验组4-6之间的协同作用，按照上述废弃虫草发酵液添加量占比的50%添加，验证叠加废弃虫草发酵液对曲霉菌生产有机酸效率的提高作用。其中，对照组D和实验组4+5、4+6、5+6、4+5+6的结果见图7和图8。

如图7和图8所示，无添加照组D发酵时间96h，实验组4+5、4+6、5+6、4+5+6发酵时间分别是60 h、48 h、48 h及36h，发酵培养基叠加添加废弃虫草发酵液后，相较于无添加对照组和单一添加的，发酵时间缩短，生产效率显著提高；其中，实验组4+5、4+6、5+6、4+5+6提高了96.4%、89.29%、85.71%、107.14%。由此可见叠加废弃虫草发酵液时结果显著优于各个组合单一使用时的结果，证明物质叠加有协同作用。

结果表明，通过外源添加废弃的虫草发酵液可显著提高曲霉菌生产有机酸效率，且叠加添加效果优于单一添加。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (1)

1.一种提高曲霉产有机酸效率的方法，其特征在于：所述方法将曲霉菌发酵培养基灭菌后，加入废弃的虫草发酵液至曲霉菌发酵培养基中，得改进的曲霉发酵培养基，接种10%的曲霉种子液于改进的曲霉发酵培养基中，充分混匀后于摇床震荡培养，即得曲霉产有机酸；

所述曲霉菌为米曲霉或黑曲霉；

所述米曲霉为米曲霉NRRL 3488，所述黑曲霉为黑曲霉 ATCC 1015；

所述曲霉菌发酵培养基为：8~11%葡萄糖，0.02~0.04%的金属离子，2~3%的氮源，115℃、30 min灭菌，即得；

其中，上述百分数为质量终浓度；

所述曲霉种子液的制备如下：

2~4%葡萄糖，0.01~0.02%的金属离子，1~2%的氮源，115℃、30 min灭菌，接种曲霉孢子1.5×10⁶个/mL，30℃、200 rpm培养14-20 h，即得；

其中，上述百分数为质量终浓度；

所述废弃的虫草发酵液为蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液中的一种或多种；

所述废弃虫草发酵液和发酵培养基的体积比为1-3：5；

当同时添加蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液中的两种的混合液时，每种虫草发酵液的添加量为混合液总体积的1/2，当同时添加蛹虫草发酵液、新疆虫草发酵液、凉山虫草发酵液时，每种虫草发酵液的添加量为混合液总体积的1/3；

所述有机酸为苹果酸、柠檬酸；

所述曲霉发酵培养的条件是：温度25~35℃，转速180~220r/min，培养36~96h；

所述废弃的虫草发酵液的制备方法是：

（1）收集虫草经液体深层发酵并提取菌丝后产生的废液，采用两层纱布进行过滤，收集滤液a；

（2）采用WSW-6型微生物薄膜过滤器将滤液a进行过滤，得到滤液b；

（3）将滤液b浓缩至其原体积的1/3，得到浓缩发酵液c；

（4）将浓缩发酵液c经滤膜过膜，即得所用的废弃的虫草发酵液。

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