CN108277240B - 一种发酵制备柠檬酸的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种发酵制备柠檬酸的工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备发酵培养基，步骤2）活化黑曲霉种子液，步骤3）发酵产酸。本发明发酵工艺成本低廉，柠檬酸产量高。

Description

一种发酵制备柠檬酸的工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵制备柠檬酸的工艺。

背景技术

柠檬酸，又名枸橼酸，学名 2-羟基-l，2，3-丙三羧酸（2-hydroxy-1，2，3-propanetricanboxylic acid），为白色晶体粉末，无味，常含一分子结晶水或无结晶水，易溶于水。它是生物体内三接酸循环的主要中间产物之一，所以在几乎所有的生物体中有着重要的代谢意义。柠檬酸在食品、医药、化妆品、化工等领域具有广泛的应用。由于柠檬酸的口感为爽快的酸味，所以，普遍用作于各种饮料、点心的酸性调味剂，或者食用油的抗氧化剂。此外，柠檬酸具有防止或者消除皮肤色素沉着的作用，因此柠檬酸可用于制药和化妆品行业。柠檬酸溶液及其盐溶液还可以作为纺织品的助洗剂，可以沉淀纺织品上金属离子，同时，作为纯棉纺织物的无甲酸防皱整理剂。世界市场上大约有 70%的柠檬酸用于食品行业，10%用于医药和化妆品，化学工业占 15%，其他行业 5%。目前，柠檬酸全世界消耗量已经达到 120万吨，年产达 160 万吨，市场贸易量为 90 多万吨，而且以每年 7%的增长率逐年上升。中国作为世界上最大的柠檬酸出口国，生产技术居世界前列，年出口量超过世界贸易总量的一半，主要销往欧洲、日本等地。因此柠檬酸的生产对具有重要的意义。

柠檬酸的生产方法主要有天然提取法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法是最常用的方法。柠檬酸发酵方式分为：利用青霉属和曲霉真菌的固态表面发酵；利用曲霉真菌深层发酵；固态培养、连续培养、和多级发酵。目前，商业上主要以淀粉为底物通过黑曲霉发酵生产柠檬酸。黑曲霉发酵柠檬酸的过程主要包括：利用培养基中的碳源；经EMP途径后，积累柠檬酸；柠檬酸由线粒体分泌至胞质；柠檬酸由胞内分泌至培养基中。

柠檬酸发酵行业在工业生产上亟待解决的问题主要包括菌种、发酵培养基原料、提取三个方面。在发酵菌种方面，多种微生物可以积累柠檬酸，如黑曲霉、青霉、构巢曲霉等，此外，一些酵母也可以利用乙酸、烷烃等来制造柠檬酸。实际的工业生产中用到的菌种都是经过筛选选育的新菌种。分子生物工程的发展，为优良菌种的选育提供了更为广阔的空间，用基因重组菌种取代原有柠檬酸生产菌的报道已经有很多，20 世纪 70-90 年代是我国柠檬酸新菌种的高产期。黑曲霉是食品级安全的丝状真菌，黑曲霉具有酶系丰富，发酵效率高、副产物少等优势，能够很好的调控糖酵解的通量，以及柠檬酸从线粒体和细胞质的分泌，仍然是柠檬酸发酵发展的重要方向，也是提高柠檬酸生产率的重要途径。到目前为止，黑曲霉仍是工业上应用最为广泛的柠檬酸生产菌。对于已有高产菌株的产酸机理进行研究，分析菌株整个生长和代谢的生理过程，为产酸机理的阐释以及菌种改良提供依据，意义重大。“柠檬酸发酵菌黑曲霉的菌种改良述评，生物技术2005年”公开了柠檬酸发酵菌黑曲霉的改良方式，包括对菌株进行诱变以及转基因技术等方式，其在一定程度上提高了菌株的产酸量；“玉米粉原料的柠檬酸发酵初步研究，工业微生物2000年”研究了玉米粉为原料进行柠檬酸发酵的工艺参数，优化了产酸体系。如何对微生物发酵产酸体系进一步优化，以提高产酸量，同时降低发酵成本，是发酵产业需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术发酵培养基成本高，柠檬酸产率低等缺陷，提供了一种发酵制备柠檬酸的工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种发酵制备柠檬酸的工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备发酵培养基，步骤2）活化黑曲霉种子液，步骤3）发酵产酸。

具体地，所述工艺包括如下步骤：

步骤1）制备发酵培养基：将玉米秸秆破碎，然后与玉米皮按照2:1的质量比混合，粉碎至粒径大于50目，然后添加到5-7倍重量的水中，边搅拌边升温至80℃，保温30min，然后添加磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、一水硫酸锰0.01g/L，121℃湿热灭菌30min，冷却，得到木霉培养液；将里氏木霉按照10%的接种量接入到木霉培养液，培养72-96h，培养时控制搅拌速度为100rpm，培养温度为30-32℃，通过流加氨水控制培养酵过程的pH为4-5；培养完成后，进行过滤除去菌体，往所得液体中添加甲醇以及氢氧化钙，搅拌均匀，即得发酵培养基；

步骤2）活化黑曲霉种子液：将黑曲霉按照常规培养24h获得黑曲霉种子液，然后将种子液进行超声处理；

步骤3）发酵产酸：将步骤2）所得黑曲霉种子液按照8-10%的接种量接入到含有步骤1）所得发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵过程中通过流加氨水控制在pH在4-4.5，发酵时间为60h。

优选地，

所述步骤1）中，甲醇的添加量为0.2%，体积比，氢氧化钙的添加量为10wt%。

优选地，

所述超声处理参数为：超声频率30KHz，功率6W，超声间隔15s，超声时间1s，总超声时间为160s。

优选地，

所述步骤3）中，发酵参数为：发酵温度为34-36℃，罐压为0.03-0.04MPa，风量为500-600L/h。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

玉米是发酵企业的主要原料，玉米粉用于发酵以及制备糖类，玉米秸秆大多废弃，玉米皮大多作为饲料使用，附加值较低，造成一定的浪费；可将玉米秸秆和玉米皮进行综合处理，实现了变废为宝，提高了附加值；

直接采用黑曲霉对秸秆粉和玉米皮等农业废弃物进行发酵，柠檬酸产量仅为 10-20g/L，糖转化率低于60%，无法在产业上进行应用。里氏木霉降解玉米秸秆和玉米皮，得到含有还原糖的溶液，适用于黑曲霉进行发酵使用；然而试验发现，将里氏木霉和黑曲霉共同发酵，尽管两种菌株可以较好的共生，但是柠檬酸的产量降低，可能原因是，里氏木霉利用了较多的氮源，使得黑曲霉的营养物质相对不足，也或者里氏木霉产生了胞外分泌物对黑曲霉的柠檬酸途径产生了抑制作用，从而减少了柠檬酸的产量；因此，本发明在里氏木霉培养完成后，进行除菌，还可以产生菌体蛋白副产物；

黑曲霉可以利用里氏木霉分解纤维素产生的还原糖或非还原糖，但是其发酵过程中，伴随着柠檬酸积累，发酵 pH 急剧下降，特别当 pH 降至 2.00 以下时，糖化酶活性被破坏，造成葡萄糖供应速率减缓，产物合成速率降低，发酵残总糖含量偏高；发酵过程中需要流加氨水控制pH为4左右，否则柠檬酸的转化率会降低；较高的残糖问题明显降低了底物与产物之间转化比率，同时会进一步地加重产物分离与纯化步骤的困难；

本发明采用在培养基中添加低浓度的甲醇可以增加柠檬酸穿过细胞膜的能力，提高柠檬酸的分泌水平；低强度的超声波预处理种子液，促进了菌株水分渗透，能够激活菌株，缩短菌株的发酵培养时间，提高柠檬酸的产量，较与未采用超声波处理进行比较，柠檬酸产量可以提高5%左右。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种发酵制备柠檬酸的工艺，其包括如下步骤：

制备发酵培养基：将玉米秸秆破碎，然后与玉米皮按照2:1的质量比混合，粉碎至粒径50目，然后添加到5倍重量的水中，边搅拌边升温至80℃，保温30min，然后添加磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、一水硫酸锰0.01g/L，121℃湿热灭菌30min，冷却，得到木霉培养液；将里氏木霉ATCC 13631按照10%的接种量（接种密度为5×10⁶cfu/mL）接入到木霉培养液，培养72h，培养时控制搅拌速度为100rpm，培养温度为30-32℃，通过流加氨水控制培养酵过程的pH为4-5；培养完成后，进行过滤除去菌体，往所得液体中添加0.2%（体积比）的甲醇以及10wt%的氢氧化钙，搅拌均匀，即得发酵培养基（还原糖含量为68g/L，蛋白和多肽总含量为8.1g/L）；菌体可以用于制备菌体蛋白；

活化黑曲霉种子液：将黑曲霉Co827按照常规培养24h获得黑曲霉种子液，然后将种子液进行超声处理，控制超声频率30KHz，功率6W，超声间隔15s，超声时间1s，总超声时间为160s；

发酵产酸：将步骤2）所得黑曲霉种子液按照8%的接种量（接种密度为1×10⁷cfu/mL）接入到含有30L步骤1）所得发酵培养基的50L发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为34℃，罐压为0.03MPa，风量为600L/h，发酵过程中通过流加氨水控制在pH在4，发酵时间为60h；产酸为151g/L，平均转化率为96%，残糖量0.18%。

实施例2

一种发酵制备柠檬酸的工艺，其包括如下步骤：

制备发酵培养基：将玉米秸秆破碎，然后与玉米皮按照2:1的质量比混合，粉碎至粒径100目，然后添加到6倍重量的水中，边搅拌边升温至80℃，保温30min，然后添加磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、一水硫酸锰0.01g/L，121℃湿热灭菌30min，冷却，得到木霉培养液；将里氏木霉按照10%的接种量（接种密度为5×10⁶cfu/mL）接入到木霉培养液，培养96h，培养时控制搅拌速度为100rpm，培养温度为30-32℃，通过流加氨水控制培养酵过程的pH为4-5；培养完成后，进行过滤除去菌体，往所得液体中添加0.2%（体积比）的甲醇以及10wt%的氢氧化钙，搅拌均匀，即得发酵培养基（还原糖含量为73g/L，蛋白和多肽总含量为8.7g/L）；菌体可以用于制备菌体蛋白；

活化黑曲霉种子液：将黑曲霉（ATCC1015）按照常规培养24h获得黑曲霉种子液，然后将种子液进行超声处理，控制超声频率30KHz，功率6W，超声间隔15s，超声时间1s，总超声时间为160s；

发酵产酸：将步骤2）所得黑曲霉种子液按照10%的接种量（接种密度为1×10⁷cfu/mL）接入到含有30L步骤1）所得发酵培养基的50L发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为35℃，罐压为0.04MPa，风量为500L/h，发酵过程中通过流加氨水控制在pH在4.3，发酵时间为60h；产酸量为143g/L，平均转化率为94%，残糖量0.27%。

对比例1

黑曲霉发酵罐培养基：玉米粉 3kg、α-淀粉酶2000U/g、CaCl2 30g、其余为水。制备方法为：玉米粉添加到水中，调节pH至 6.0-6.5，加入耐高温α-淀粉酶，加热到 70℃保温1h，迅速加热到 90℃，保温45-60 min；再加热煮沸 5-10min，添加5%的硫酸铵，10%的氢氧化钙，10%消泡剂。发酵工艺同实施例1；产酸产柠檬酸量为137g/L，发酵周期为68h。

实施例3

以实施例1为例，将里氏木霉和黑曲霉混合发酵产酸情况进行对比，具体对比结果见表1：

表1

发酵方式	产酸量g/L，	残糖量%	发酵周期h
				混合发酵	129	0.21	60
实施例1	151	0.18	60

如上表1所示，将里氏木霉和黑曲霉共同发酵，尽管两种菌株可以较好的共生，但是柠檬酸的产量降低了16%，可能原因是里氏木霉利用了较多的氮源，使得黑曲霉的营养物质相对不足，也可能是里氏木霉产生了胞外分泌物对黑曲霉的柠檬酸途径产生了抑制作用，从而减少了柠檬酸的产量；因此，本发明在里氏木霉培养完成后需要除去菌体。

实施例4

发酵培养基中甲醇添加量对发酵产酸效果的影响，设置甲醇的添加量为0、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%，其余发酵体系同实施例1，具体见表2：

表2

添加量v/v%	产酸量g/L，	发酵周期h
			0	140	60
0.1	147	60
			0.2	151	60
0.4	145	60
			0.8	137	60

如表2所示，随着甲醇添加量的增加，产酸量有所提高，添加量为0.2%时，达到最大值，随着甲醇添加量的增加，产酸量有所降低，因此，选择0.2%的添加量最为合适。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (1)

1.一种发酵制备柠檬酸的工艺，所述工艺包括如下步骤：

步骤1）制备发酵培养基：将玉米秸秆破碎，然后与玉米皮按照2:1的质量比混合，粉碎至粒径50-100目，然后添加到5-6倍重量的水中，边搅拌边升温至80℃，保温30min，然后添加磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、一水硫酸锰0.01g/L，121℃湿热灭菌30min，冷却，得到木霉培养液；将里氏木霉按照10%的接种量接入到木霉培养液，培养72-96h，培养时控制搅拌速度为100rpm，培养温度为30-32℃，通过流加氨水控制发酵过程的pH为4-5；培养完成后，进行过滤除去菌体，往所得液体中添加甲醇以及氢氧化钙，搅拌均匀，即得发酵培养基；

步骤2）活化黑曲霉种子液：将黑曲霉按照常规培养24h获得黑曲霉种子液，然后将种子液进行超声处理；

步骤3）发酵产酸：将步骤2）所得黑曲霉种子液按照8-10%的接种量接入到含有步骤1）所得发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵过程中通过流加氨水控制pH在4-4.3，发酵时间为60h；

所述步骤1）中，甲醇的添加量为0.2%体积比，氢氧化钙的添加量为10wt%；

所述超声处理参数为：超声频率30KHz，功率6W，超声间隔15s，超声时间1s，总超声时间为160s；

所述步骤3）中，发酵参数为：发酵温度为34-35℃，罐压为0.03-0.04MPa，风量为500-600L/h。