CN114209052A - 保健酵素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及保健食品技术领域，具体公开了一种保健酵素及其制备方法。本发明保健酵素由以下方法制备而成：选择无机械损伤的新鲜成熟果蔬洗净、去皮、去核，切成果蔬块，打浆，得到果蔬浆料；向果蔬浆料中加入果胶酶进行酶解，过滤，得到果蔬汁；将果蔬汁灭菌，冷却，然后在无菌条件下接种混合菌发酵，完成发酵后进行过滤，除去滤渣，得到粗酵素液；将粗酵素液、添加剂和蜂蜜混合均匀，杀菌，冷却，得到保健酵素。本发明制备工艺简单，制得的果蔬酵素中含有人体生命活动所必需的微量元素‑硒，具有较好的抗氧化活性以及更好的增强机体免疫力等保健功效。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品技术领域，具体涉及一种保健酵素及其制备方法。
背景技术
酵素，通常被称为酶，是指在有机体中产生的具有催化作用的活性大分子。酵素是以安全卫生的果品、蔬菜、谷类、菌菇类或其他药食两用草本类等纯天然食材为发酵原料，经过微生物发酵后而得到的产物，含有多种营养生物活性物质，如蛋白质、酶、多酚类化合物、矿物质、有机酸、水溶性膳食纤维等；而且不含添加剂、色素等化学物质，食用后通常不会产生不良反应，因此具有广阔的发展前景和很大的开发价值。
酵素中富含多种营养物质及活性成分，因而具有多种保健功能：1)酵素中的多酚、维生素、有机酸等抗氧化恭功效成分，能够抑制自由基对皮肤的伤害，起到抗氧化、美白、延缓衰老的作用；2)酵素中含有机酸和多种膳食纤维成分，改善人体内微生态环境，促进肠道蠕动，达到润肠通便效果；3)酵素可以延缓机体醉酒期间，避免酒精在机体中存在时间过长而转化成乙醛造成的肝脏损伤，起到解酒护肝的作用；4)酵素中的多糖类、多酚、维生素等成分，不仅具有抗菌消炎的作用，还对提高机体免疫力大有裨益；5)酵素中含有一定数量的活性益生菌，能够分解转化甚至清除血液内的毒素及有害胆固醇、血脂，从而畅通血管、净化血液，具有较好的医用性。
申请号为201910083998.9的中国发明专利公开了一种无花果复合保健酵素及其制备方法，采用无花果、无花果、香蕉、苹果、梨、慈姑、竹笋、白萝卜、莲藕、中药材、食用菌类等原料共同制备出一种复合性的保健酵素，该申请采用两阶段间歇式供氧负压工艺进行发酵，能够改善产品口感和风味，维持新鲜水果的天然酵素及功能性成分。虽然该申请通过微生物的发酵产生大量生物活性物质，增强了酵素的保健功能，但是由于微生物产生的活性物质数量有限，对提高酵素的保健功能影响甚微。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种保健酵素及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
硒是一种对人体健康具有重要作用的必需微量元素，在自然界中常见的存在方式主要有无机硒和有机硒两种，其在生物体中与半胱氨酸结合在位于谷胱甘肽过氧化物酶、蛋氨酸亚砜还原酶、碘甲腺原氨酸脱碘酶等的活性中心，参与机体抗氧化和能量代谢，具有较高的生物活性以及重要的生物学功能，如有效清除体内自由基、调节机体代谢、增强机体免疫调节能力、预防心脑血管疾病、抗肿瘤、保肝护肝等。
保健酵素的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择无机械损伤的新鲜成熟果蔬洗净、去皮、去核，切成体积为3-5cm3的果蔬块，打浆，得到果蔬浆料；
(2)向果蔬浆料中加入果蔬浆料质量0.01-0.03wt％的果胶酶进行酶解，过滤，得到果蔬汁；所述酶解条件为：温度＝40-50℃、时间＝60-120min、pH＝3-5；
(3)将果蔬汁在115-125℃下灭菌8-12s，并冷却至35-38℃，然后在无菌条件下按接种量2-5wt％接种混合菌，在温度35-38℃下发酵50-80天，完成发酵后进行过滤，除去滤渣，得到粗酵素液；
(4)将粗酵素液、添加剂和蜂蜜按照质量比为100：(0.2-0.5)：(1-3)混合均匀，于92-100℃的水浴内加热杀菌25-40min，冷却，得到保健酵素。
所述果蔬由苹果、香蕉、梨、白萝卜、莴苣、姜、胡萝卜按照质量比1:1:1:1:1:1:1组成。
所述混合菌为酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、醋酸杆菌、嗜热链球菌中的一种或多种。
进一步地，所述混合菌由酿酒酵母和植物乳杆菌按照质量比(1-3)：1混合得到。
所述添加剂为纳米硒、多糖纳米硒中的任意一种。
与传统的无机硒和有机硒相比，纳米硒具有独特的小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应，因而具有较低的毒性、较高的生物利用率和生物活性，成为保健食品补充剂研究和发展的热点。
所述纳米硒采用以下方法制备而成：将5-15重量份50-70mmol/L与170-230重量份水混合均匀，在室温下以600-1000rpm的转速搅拌40-80min，然后加入5-15重量份200-280mmol/L的抗坏血酸水溶液，在35-50℃的黑暗条件下继续搅拌5-8h，然后用10000-14000rpm的转速离心20-40min，取底部沉淀冷冻干燥，得到纳米硒。
纳米硒由于具有较高的比表面能，其表面原子配位不足，在布朗运动和范德华引力的作用下容易聚集沉淀转变为灰黑色单质硒，导致生物活性和生物利用率降低。从植物分离出来的天然多糖具有大量的亲水基团，如羟基、羧基和氨基等，对其进行适当的分子修饰或结构重建会使多糖产生新的活性或进一步增强某些活性。多糖具有高度复杂的分支结构和活泼的羟基基团，能够很好的吸附和包裹还原反应中最初形成的纳米硒，控制晶体的成核与生长，进而阻止纳米硒颗粒的团聚和生长，同时多糖还具有良好的生物活性和生物粘附性，可以延长纳米硒在生物体内的停留时间，是制备纳米硒的重要调控剂。因此，本发明以天然多糖为稳定剂来制备稳定性好、生物活性高的多糖纳米硒。
所述多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将龙须菜置于50-70℃干燥箱中干燥5-8h，取出粉碎后过30-60目筛，得到龙须菜粉末，然后取80-120重量份龙须菜粉末放入300-500重量份无水乙醇中，加热至65-75℃并回流2-5h，过滤，得到滤液和滤渣；然后将滤渣加入到1200-1800重量份水中进行超声提取，其中超声提取参数为：温度＝65-75℃、超声功率＝150-300W、超声频率＝20-30kHz、超声时间＝60-120min，结束后在4000-6000rpm转速下离心15-30min，收集上清液；最后将上述滤液与上清液合并，并用旋转蒸发仪在40-50℃下真空浓缩至原体积的十分之一，再加入无水乙醇使乙醇体积分数达到75-85％，在温度2-5℃下静置12-36h，结束后6000-10000rpm离心15-30min，取沉淀冷冻干燥，得到龙须菜多糖；
S2、将10-30重量份15-25mg/mL的分散剂水溶液与5-15重量份50-70mmol/L的***钠水溶液混合均匀后，再加入160-200重量份5-8mg/mL的龙须菜多糖水溶液，在室温下以600-1000rpm的转速搅拌40-80min，然后加入5-15重量份200-280mmol/L的抗坏血酸水溶液，在35-50℃的黑暗条件下继续搅拌5-8h，然后置于截留分子量为3000-4000Da的透析袋中用水透析48-96h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到多糖纳米硒。
上述技术方案中的龙须菜多糖虽然采用醇提和超声提取结合制备得到，但仍然含有许多如蛋白质、色素以及一些无机盐等小分子杂质，导致得到的龙须菜多糖利用率低、生物活性不高；故本发明中继续对上述得到的龙须菜粗多糖采用有机溶剂对其进一步提取纯化，不但能够有效精细地分离出龙须菜粗多糖中的有效组分，还能较好保持龙须菜多糖的结构与生物活性，提高龙须菜多糖在纳米硒制备中的利用率。
进一步地，所述多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将龙须菜置于50-70℃干燥箱中干燥5-8h，取出粉碎后过30-60目筛，得到龙须菜粉末，然后取80-120重量份龙须菜粉末放入300-500重量份无水乙醇中，加热至65-75℃并回流2-5h，过滤，得到滤液和滤渣；然后将滤渣加入到1200-1800重量份水中进行超声提取，其中超声提取参数为：温度＝65-75℃、超声功率＝150-300W、超声频率＝20-30kHz、超声时间＝60-120min，结束后在4000-6000rpm转速下离心15-30min，收集上清液；最后将上述滤液与上清液合并，并用旋转蒸发仪在40-50℃下真空浓缩至原体积的十分之一，再加入无水乙醇使乙醇体积分数达到75-85％，在温度2-5℃下静置12-36h，结束后6000-10000rpm离心15-30min，取沉淀冷冻干燥，得到粗多糖；将粗多糖溶于30-50重量份水中，加入8-15重量份提取剂，在室温下以300-500rpm的转速搅拌20-40min后，倒入截留分子量为3000-4000Da的透析袋中用水透析36-60h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到龙须菜多糖；所述提取剂由正丁醇和氯仿以体积比1:(3-5)混合而成；
S2、将10-30重量份15-25mg/mL的分散剂水溶液与5-15重量份50-70mmol/L的***钠水溶液混合均匀后，再加入160-200重量份5-8mg/mL的龙须菜多糖水溶液，在室温下以600-1000rpm的转速搅拌40-80min，然后加入5-15重量份200-280mmol/L的抗坏血酸水溶液，在35-50℃的黑暗条件下继续搅拌5-8h，然后置于截留分子量为3000-4000Da的透析袋中用水透析48-96h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到多糖纳米硒。
所述分散剂为十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、吐温-80中的一种或多种。
优选的，所述分散剂为吐温-80和十二烷基苯磺酸钠的混合物，其中吐温-80和十二烷基苯磺酸钠的质量比为(2-5):(1-3)。
吐温-80是一种非离子表面活性剂，具有显著的水溶性，可用作纳米***的分散剂。吐温-80通过羟基与纳米硒之间的强相互作用吸附在纳米硒表面，其具有的非离子型亲水长链-聚氧乙烯相互排斥，利用形成的空间位阻效应来阻止纳米硒的聚集。但是由于吐温-80的聚氧乙烯链结构较大，易吸附在不同纳米硒粒子表面产生“架桥”效应，使纳米硒絮凝，导致分散体系不稳定。而十二烷基苯磺酸钠为线性表面活性剂，分子链较短，易于穿插进入吐温-80的结构空隙中，避免“架桥”效应的产生，同时十二烷基苯磺酸钠属于阴离子表面活性剂，可与纳米硒表面的多糖羟基以范德华力结合，形成稳定的吸附包覆体系。本发明将吐温-80与十二烷基苯磺酸钠二者复配作为分散剂，形成的混合体系可以减小界面张力，增大纳米硒表面的吸附能力，为多糖提供更多的结合位点，同时能够控制纳米硒的成核与生长，促进形成尺寸均一的多糖纳米硒。
本发明多糖纳米硒的形成过程大致如下：在反应体系中，游离的***根粒子首先被抗坏血酸还原成零价硒，然后当更多的零价硒从还原反应中生成时，零价硒作为核并逐渐生长成为纳米硒；之后，通过形成C-O…Se键或多糖的羟基与纳米硒之间的强相互作用，使多糖和分散剂牢固吸附并包裹在纳米硒的表面。
本发明的有益效果：本发明从天然植物-龙须菜中分离提取出具有优异生物降解性、稳定性且无毒的天然植物多糖，由于其具有高度复杂的分支结构和丰富的羟基基团，通过化学修饰的方法将其与参与人体生命活动的必需元素-硒进行结合，制备出兼具硒和多糖双重活性的易于被机体吸收利用的多糖纳米硒；然后将其与果蔬发酵得到的粗酵素液和蜂蜜进行混合，得到保健酵素。本发明保健酵素的原料成本低，制备工艺简单，酵素中不仅含有果蔬发酵产生的多种营养活性成分，而且含有的多糖纳米硒，稳定性好、生物活性高，在补充人体必需微量元素的同时，还具有较好的抗氧化活性以及更好的增强机体免疫力等保健功效。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
本申请中部分原料的介绍：
果胶酶，酶活力：10万U/g，由郑州裕和食品添加剂有限公司提供。
酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae，编号：ACCC20034，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
植物乳杆菌，Lactobacillus plantarum，编号：ACCC11016，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
龙须菜，属于江蓠科江蓠属植物，采用自然风干的龙须菜。
实施例1
保健酵素的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择无机械损伤的新鲜成熟果蔬洗净、去皮、去核，切成体积为4cm3的果蔬块，打浆，得到果蔬浆料；
所述果蔬由苹果、香蕉、梨、白萝卜、莴苣、姜、胡萝卜按照质量比1:1:1:1:1:1:1组成。
(2)向果蔬浆料中加入果蔬浆料质量0.02wt％的果胶酶进行酶解，过滤，得到果蔬汁；所述酶解条件为：温度＝45℃、时间＝90min、pH＝4；
(3)将果蔬汁在120℃下灭菌10s，并冷却至37℃，然后在无菌条件下按接种量3wt％接种混合菌，在温度37℃下发酵60天，完成发酵后进行过滤，除去滤渣，得到粗酵素液；所述混合菌由酿酒酵母和植物乳杆菌按照质量比1：1混合得到；
(4)将粗酵素液、纳米硒和蜂蜜按照质量比为100：0.3：2混合均匀，于95℃的水浴内加热杀菌30min，冷却，得到保健酵素。
所述纳米硒采用以下方法制备而成：将10重量份60mmol/L的***钠水溶液与200重量份水混合均匀，在室温下以800rpm的转速搅拌60min，然后加入10重量份240mmol/L的抗坏血酸水溶液，在40℃的黑暗条件下继续搅拌6h，然后用12000rpm的转速离心30min，取底部沉淀冷冻干燥，得到纳米硒。
实施例2
保健酵素的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择无机械损伤的新鲜成熟果蔬洗净、去皮、去核，切成体积为4cm3的果蔬块，打浆，得到果蔬浆料；
所述果蔬由苹果、香蕉、梨、白萝卜、莴苣、姜、胡萝卜按照质量比1:1:1:1:1:1:1组成。
(2)向果蔬浆料中加入果蔬浆料质量0.02wt％的果胶酶进行酶解，过滤，得到果蔬汁；所述酶解条件为：温度＝45℃、时间＝90min、pH＝4；
(3)将果蔬汁在120℃下灭菌10s，并冷却至37℃，然后在无菌条件下按接种量3wt％接种混合菌，在温度37℃下发酵60天，完成发酵后进行过滤，除去滤渣，得到粗酵素液；所述混合菌由酿酒酵母和植物乳杆菌按照质量比1：1混合得到；
(4)将粗酵素液、多糖纳米硒和蜂蜜按照质量比为100：0.3：2混合均匀，于95℃的水浴内加热杀菌30min，冷却，得到保健酵素。
所述多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将龙须菜置于60℃干燥箱中干燥6h，取出粉碎后过40目筛，得到龙须菜粉末，然后取100重量份龙须菜粉末放入400重量份无水乙醇中，加热至70℃并回流3h，过滤，得到滤液和滤渣；然后将滤渣加入到1500重量份水中进行超声提取，其中超声提取参数为：温度＝70℃、超声功率＝200W、超声频率＝25kHz、超声时间＝90min，结束后在5000rpm转速下离心20min，收集上清液；最后将上述滤液与上清液合并，并用旋转蒸发仪在45℃下真空浓缩至原体积的十分之一，再加入无水乙醇使乙醇体积分数达到80％，在温度4℃下静置24h，结束后8000rpm离心20min，取沉淀冷冻干燥，得到龙须菜多糖；
S2、将20重量份20mg/mL的吐温-80水溶液与10重量份60mmol/L的***钠水溶液混合均匀后，再加入180重量份6mg/mL的龙须菜多糖水溶液，在室温下以800rpm的转速搅拌60min，然后加入10重量份240mmol/L的抗坏血酸水溶液，在40℃的黑暗条件下继续搅拌6h，然后置于截留分子量为3500Da的透析袋中用水透析72h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到多糖纳米硒。
实施例3
保健酵素的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择无机械损伤的新鲜成熟果蔬洗净、去皮、去核，切成体积为4cm3的果蔬块，打浆，得到果蔬浆料；
所述果蔬由苹果、香蕉、梨、白萝卜、莴苣、姜、胡萝卜按照质量比1:1:1:1:1:1:1组成。
(2)向果蔬浆料中加入果蔬浆料质量0.02wt％的果胶酶进行酶解，过滤，得到果蔬汁；所述酶解条件为：温度＝45℃、时间＝90min、pH＝4；
(3)将果蔬汁在120℃下灭菌10s，并冷却至37℃，然后在无菌条件下按接种量3wt％接种混合菌，在温度37℃下发酵60天，完成发酵后进行过滤，除去滤渣，得到粗酵素液；所述混合菌由酿酒酵母和植物乳杆菌按照质量比1：1混合得到；
(4)将粗酵素液、多糖纳米硒和蜂蜜按照质量比为100：0.3：2混合均匀，于95℃的水浴内加热杀菌30min，冷却，得到保健酵素。
所述多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将龙须菜置于60℃干燥箱中干燥6h，取出粉碎后过40目筛，得到龙须菜粉末，然后取100重量份龙须菜粉末放入400重量份无水乙醇中，加热至70℃并回流3h，过滤，得到滤液和滤渣；然后将滤渣加入到1500重量份水中进行超声提取，其中超声提取参数为：温度＝70℃、超声功率＝200W、超声频率＝25kHz、超声时间＝90min，结束后在5000rpm转速下离心20min，收集上清液；最后将上述滤液与上清液合并，并用旋转蒸发仪在45℃下真空浓缩至原体积的十分之一，再加入无水乙醇使乙醇体积分数达到80％，在温度4℃下静置24h，结束后8000rpm离心20min，取沉淀冷冻干燥，得到粗多糖；将粗多糖溶于40重量份水中，加入10重量份提取剂，在室温下以400rpm的转速搅拌30min后，倒入截留分子量为3500Da的透析袋中用水透析48h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到龙须菜多糖；所述提取剂由正丁醇和氯仿以体积比1:4混合而成。
S2、将20重量份20mg/mL的吐温-80水溶液与10重量份60mmol/L的***钠水溶液混合均匀后，再加入180重量份6mg/mL的龙须菜多糖水溶液，在室温下以800rpm的转速搅拌60min，然后加入10重量份240mmol/L的抗坏血酸水溶液，在40℃的黑暗条件下继续搅拌6h，然后置于截留分子量为3500Da的透析袋中用水透析72h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到多糖纳米硒。
实施例4
保健酵素的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择无机械损伤的新鲜成熟果蔬洗净、去皮、去核，切成体积为4cm3的果蔬块，打浆，得到果蔬浆料；
所述果蔬由苹果、香蕉、梨、白萝卜、莴苣、姜、胡萝卜按照质量比1:1:1:1:1:1:1组成。
(2)向果蔬浆料中加入果蔬浆料质量0.02wt％的果胶酶进行酶解，过滤，得到果蔬汁；所述酶解条件为：温度＝45℃、时间＝90min、pH＝4；
(3)将果蔬汁在120℃下灭菌10s，并冷却至37℃，然后在无菌条件下按接种量3wt％接种混合菌，在温度37℃下发酵60天，完成发酵后进行过滤，除去滤渣，得到粗酵素液；所述混合菌由酿酒酵母和植物乳杆菌按照质量比1：1混合得到；
(4)将粗酵素液、多糖纳米硒和蜂蜜按照质量比为100：0.3：2混合均匀，于95℃的水浴内加热杀菌30min，冷却，得到保健酵素。
所述多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将龙须菜置于60℃干燥箱中干燥6h，取出粉碎后过40目筛，得到龙须菜粉末，然后取100重量份龙须菜粉末放入400重量份无水乙醇中，加热至70℃并回流3h，过滤，得到滤液和滤渣；然后将滤渣加入到1500重量份水中进行超声提取，其中超声提取参数为：温度＝70℃、超声功率＝200W、超声频率＝25kHz、超声时间＝90min，结束后在5000rpm转速下离心20min，收集上清液；最后将上述滤液与上清液合并，并用旋转蒸发仪在45℃下真空浓缩至原体积的十分之一，再加入无水乙醇使乙醇体积分数达到80％，在温度4℃下静置24h，结束后8000rpm离心20min，取沉淀冷冻干燥，得到粗多糖；将粗多糖溶于40重量份水中，加入10重量份提取剂，在室温下以400rpm的转速搅拌30min后，倒入截留分子量为3500Da的透析袋中用水透析48h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到龙须菜多糖；所述提取剂由正丁醇和氯仿以体积比1:4混合而成。
S2、将20重量份20mg/mL的十二烷基苯磺酸钠水溶液与10重量份60mmol/L的***钠水溶液混合均匀后，再加入180重量份6mg/mL的龙须菜多糖水溶液，在室温下以800rpm的转速搅拌60min，然后加入10重量份240mmol/L的抗坏血酸水溶液，在40℃的黑暗条件下继续搅拌6h，然后置于截留分子量为3500Da的透析袋中用水透析72h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到多糖纳米硒。
实施例5
保健酵素的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择无机械损伤的新鲜成熟果蔬洗净、去皮、去核，切成体积为4cm3的果蔬块，打浆，得到果蔬浆料；
所述果蔬由苹果、香蕉、梨、白萝卜、莴苣、姜、胡萝卜按照质量比1:1:1:1:1:1:1组成。
(2)向果蔬浆料中加入果蔬浆料质量0.02wt％的果胶酶进行酶解，过滤，得到果蔬汁；所述酶解条件为：温度＝45℃、时间＝90min、pH＝4；
(3)将果蔬汁在120℃下灭菌10s，并冷却至37℃，然后在无菌条件下按接种量3wt％接种混合菌，在温度37℃下发酵60天，完成发酵后进行过滤，除去滤渣，得到粗酵素液；所述混合菌由酿酒酵母和植物乳杆菌按照质量比1：1混合得到；
(4)将粗酵素液、多糖纳米硒和蜂蜜按照质量比为100：0.3：2混合均匀，于95℃的水浴内加热杀菌30min，冷却，得到保健酵素。
所述多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将龙须菜置于60℃干燥箱中干燥6h，取出粉碎后过40目筛，得到龙须菜粉末，然后取100重量份龙须菜粉末放入400重量份无水乙醇中，加热至70℃并回流3h，过滤，得到滤液和滤渣；然后将滤渣加入到1500重量份水中进行超声提取，其中超声提取参数为：温度＝70℃、超声功率＝200W、超声频率＝25kHz、超声时间＝90min，结束后在5000rpm转速下离心20min，收集上清液；最后将上述滤液与上清液合并，并用旋转蒸发仪在45℃下真空浓缩至原体积的十分之一，再加入无水乙醇使乙醇体积分数达到80％，在温度4℃下静置24h，结束后8000rpm离心20min，取沉淀冷冻干燥，得到粗多糖；将粗多糖溶于40重量份水中，加入10重量份提取剂，在室温下以400rpm的转速搅拌30min后，倒入截留分子量为3500Da的透析袋中用水透析48h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到龙须菜多糖；所述提取剂由正丁醇和氯仿以体积比1:4混合而成。
S2、将20重量份20mg/mL的分散剂水溶液与10重量份60mmol/L的***钠水溶液混合均匀后，再加入180重量份6mg/mL的龙须菜多糖水溶液，在室温下以800rpm的转速搅拌60min，然后加入10重量份240mmol/L的抗坏血酸水溶液，在40℃的黑暗条件下继续搅拌6h，然后置于截留分子量为3500Da的透析袋中用水透析72h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到多糖纳米硒。
所述分散剂为吐温-80和十二烷基苯磺酸钠的混合物，其中吐温-80和十二烷基苯磺酸钠的质量比为3:2。
测试例1
体外抗氧化能力评价：细胞在正常的代谢过程中或在不利的外界环境影响下，都会产生自由基，而过量的自由基会对人体的脂质、核酸、蛋白质和糖类等生命大分子造成损害，引发癌症、中风等多种疾病，本申请中体外抗氧化能力通过测定保健酵素对超氧阴离子的清除能力来研究。
具体方法如下：首先取2.4mL 0.05mol/L pH＝8.2的Tris-HCl缓冲溶液，然后加入1.0mL实施例制备的保健酵素，在25℃水浴中保温30min，取出，加入0.3mL 7mmo1/L的邻苯三酚溶液开始反应，第4min时加入0.5mL10mo1/L的浓盐酸终止反应，用紫外分光光度计测定325nm处的吸光度(Ai)，对照组以1.0mL蒸馏水代替保健酵素(A0)。每组实施例平行测试5组，取平均值。超氧阴离子自由基清除率计算公式如下：
超氧阴离子清除率(％)＝(A0-Ai)/A0×100％
表1体外抗氧化能力测试结果
| 超氧阴离子清除率(％) | |
| 实施例1 | 54.6 |
| 实施例2 | 65.8 |
| 实施例3 | 73.5 |
| 实施例4 | 73.2 |
| 实施例5 | 78.3 |
以上结果可以看出，与实施例1相比，实施例2的抗氧化能力明显提高，这可能是由于，与单纯的纳米硒相比，多糖纳米硒作为一种新型天然抗氧化剂，在原有纳米硒的抗氧化性基础上结合了具有天然抗氧化活性的龙须菜多糖，能够清除更多的自由基，保护细胞膜，提高机体抗活性氧损伤的能力，促使制得的保健酵素抗氧化能力得以明显提升。实施例3在实施例2的基础上，对龙须菜多糖进行进一步提取纯化，不但能够有效精细地分离出龙须菜粗多糖中的有效组分，还能较好保持龙须菜多糖的结构与生物活性，提高龙须菜多糖在纳米硒制备中的利用率，从而促进抗氧化能力的提高。与实施例3和4相比，实施例5中的分散剂采用吐温-80与十二烷基苯磺酸钠二者复配，协同增效，进一步提高了保健酵素的抗氧化能力，可能是由于二者复配后形成的混合体系可以减小界面张力，增大纳米硒表面的吸附能力，为多糖提供更多的结合位点，同时能够控制纳米硒的成核与生长，促进形成尺寸均一的多糖纳米硒，提高多糖的结合率以及小分子多糖纳米硒更易于被机体吸收利用，有利于抗氧化活性的提升。
测试例2
体外增强免疫活性评价：取成年鸡心脏无菌采血，肝素抗凝，再加入等体积Hank’s液稀释，加到淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心15min，吸取中间云雾状细胞层，用Hank’s液洗2遍，1500rpm离心15min，活细胞计数大于90％后，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2.5×106个/mL，接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，然后加入100μL实施例制备的保健酵素，每组实施例重复4孔；另设4孔细胞对照组，仅加100μL细胞培养液。将96孔细胞培养板置于37.5℃、5％CO2条件下培养44h后，每孔加入30μL MTT，继续培养4h，将96孔细胞培养板1500rpm离心10min,弃上清液，然后每孔加100μL DMSO裂解液，将培养板置于微量振荡器上振荡5min使沉淀完全溶解，用酶联免疫检测仪检测570nm波长处的吸光度(A570nm)值，并计算淋巴细胞增殖率。淋巴细胞增殖率计算公式如下：
淋巴细胞增殖率(％)＝(A试验组-A对照组)/A对照组×100％
表2体外增强免疫活性测试结果
| 淋巴细胞增殖率(％) | |
| 实施例1 | 15.24 |
| 实施例2 | 23.17 |
| 实施例3 | 28.69 |
| 实施例4 | 28.65 |
| 实施例5 | 31.36 |
本发明中制备的多糖纳米硒是硒与天然植物多糖键合的一种有机硒化合物，不仅能够发挥硒和植物多糖的双重功能，还能有效地提高硒的生物利用度，其毒性和副作用大大降低的同时，其生物活性得以大幅度提升，在本发明中发明人将多糖纳米硒作为添加剂用于保健酵素中，有效提高了淋巴细胞增殖率，增强了酵素的免疫活性，具有较高的保健功效。
Claims (10)
1.保健酵素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择无机械损伤的新鲜成熟果蔬洗净、去皮、去核，切块，打浆，得到果蔬浆料；
(2)向果蔬浆料中加入果蔬浆料质量0.01-0.03wt％的果胶酶进行酶解，过滤，得到果蔬汁；
(3)将果蔬汁在115-125℃下灭菌8-12s，并冷却至35-38℃，然后在无菌条件下按接种量2-5wt％接种混合菌，在温度35-38℃下发酵50-80天，完成发酵后进行过滤，除去滤渣，得到粗酵素液；
(4)将粗酵素液、添加剂和蜂蜜按照质量比为100：(0.2-0.5)：(1-3)混合均匀，于92-100℃的水浴内加热杀菌25-40min，冷却，得到保健酵素。
2.如权利要求1所述的保健酵素的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述果蔬由苹果、香蕉、梨、白萝卜、莴苣、姜、胡萝卜按照质量比1:(0.5-1):(0.5-1):(0.5-1):(0.5-1):(0.5-1):(0.5-1)组成。
3.如权利要求1所述的保健酵素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述酶解条件为：温度＝40-50℃、时间＝60-120min、pH＝3-5。
4.如权利要求1所述的保健酵素的制备方法，其特征在于，所述混合菌为酿酒酵母、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、醋酸杆菌、嗜热链球菌中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的保健酵素的制备方法，其特征在于，所述添加剂为纳米硒、多糖纳米硒中的任意一种。
6.如权利要求5所述的保健酵素的制备方法，其特征在于，所述纳米硒采用以下方法制备而成：将5-15重量份50-70mmol/L与170-230重量份水混合均匀，在室温下以600-1000rpm的转速搅拌40-80min，然后加入5-15重量份200-280mmol/L的抗坏血酸水溶液，在35-50℃的黑暗条件下继续搅拌5-8h，然后用10000-14000rpm的转速离心20-40min，取底部沉淀冷冻干燥，得到纳米硒。
7.如权利要求5所述的保健酵素的制备方法，其特征在于，所述多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将龙须菜置于50-70℃干燥箱中干燥5-8h，取出粉碎后过30-60目筛，得到龙须菜粉末，然后取80-120重量份龙须菜粉末放入300-500重量份无水乙醇中，加热至65-75℃并回流2-5h，过滤，得到滤液和滤渣；然后将滤渣加入到1200-1800重量份水中进行超声提取，其中超声提取参数为：温度＝65-75℃、超声功率＝150-300W、超声频率＝20-30kHz、超声时间＝60-120min，结束后在4000-6000rpm转速下离心15-30min，收集上清液；最后将上述滤液与上清液合并，并用旋转蒸发仪在40-50℃下真空浓缩至原体积的十分之一，再加入无水乙醇使乙醇体积分数达到75-85％，在温度2-5℃下静置12-36h，结束后6000-10000rpm离心15-30min，取沉淀冷冻干燥，得到龙须菜多糖；
S2、将10-30重量份15-25mg/mL的分散剂水溶液与5-15重量份50-70mmol/L的***钠水溶液混合均匀后，再加入160-200重量份5-8mg/mL的龙须菜多糖水溶液，在室温下以600-1000rpm的转速搅拌40-80min，然后加入5-15重量份200-280mmol/L的抗坏血酸水溶液，在35-50℃的黑暗条件下继续搅拌5-8h，然后置于截留分子量为3000-4000Da的透析袋中用水透析48-96h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到多糖纳米硒。
8.如权利要求5所述的保健酵素的制备方法，其特征在于，所述多糖纳米硒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将龙须菜置于50-70℃干燥箱中干燥5-8h，取出粉碎后过30-60目筛，得到龙须菜粉末，然后取80-120重量份龙须菜粉末放入300-500重量份无水乙醇中，加热至65-75℃并回流2-5h，过滤，得到滤液和滤渣；然后将滤渣加入到1200-1800重量份水中进行超声提取，其中超声提取参数为：温度＝65-75℃、超声功率＝150-300W、超声频率＝20-30kHz、超声时间＝60-120min，结束后在4000-6000rpm转速下离心15-30min，收集上清液；最后将上述滤液与上清液合并，并用旋转蒸发仪在40-50℃下真空浓缩至原体积的十分之一，再加入无水乙醇使乙醇体积分数达到75-85％，在温度2-5℃下静置12-36h，结束后6000-10000rpm离心15-30min，取沉淀冷冻干燥，得到龙须菜多糖；
S2、将10-30重量份15-25mg/mL的分散剂水溶液与5-15重量份50-70mmol/L的***钠水溶液混合均匀后，再加入160-200重量份5-8mg/mL的龙须菜多糖水溶液，在室温下以600-1000rpm的转速搅拌40-80min，然后加入5-15重量份200-280mmol/L的抗坏血酸水溶液，在35-50℃的黑暗条件下继续搅拌5-8h，然后置于截留分子量为3000-4000Da的透析袋中用水透析48-96h，其中每24h更换一次水，最后收集透析袋中的透析液，冷冻干燥，得到多糖纳米硒。
9.如权利要求7或8所述的保健酵素的制备方法，其特征在于，所述分散剂为十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、吐温-80中的一种或多种。
10.一种保健酵素，其特征在于，如权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备而成。
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