CN114150030B - 一种透明质酸的生产方法 - Google Patents
一种透明质酸的生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114150030B CN114150030B CN202111609573.0A CN202111609573A CN114150030B CN 114150030 B CN114150030 B CN 114150030B CN 202111609573 A CN202111609573 A CN 202111609573A CN 114150030 B CN114150030 B CN 114150030B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- hyaluronic acid
- culture
- medium
- seed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 108
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 108
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 108
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 256
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 256
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 60
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 34
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 34
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 33
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 31
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 19
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 18
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 18
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 14
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 claims description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 13
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 2
- 241000561734 Celosia cristata Species 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005461 lubrication Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于透明质酸发酵生产领域，涉及一种透明质酸的生产方法，该方法包括在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到12～20mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。采用本发明提供的方法制备透明质酸，能够促进透明质酸的合成，所得发酵产物中透明质酸的产量明显提高。
Description
技术领域
本发明属于透明质酸发酵生产领域，具体涉及一种透明质酸的生产方法。
背景技术
透明质酸(HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNac)和葡萄糖醛酸(GlcA)为双糖单位重复串联而成的直链酸性黏多糖，广泛存在于高等动物的***和微生物荚膜中。透明质酸具备优异的保湿性、粘弹性以及润滑作用，可广泛应用于医药、化妆品、美容等多个领域，具有极高的商业价值。
透明质酸的制备方法有传统提取法和微生物发酵法。在传统提取法中，透明质酸是从鸡冠、人脐带和牛眼玻璃体中提取得到，此方法提取率较低，成本较高。目前透明质酸的生产主要以微生物发酵法为主，虽然微生物发酵法可以克服传统提取法的缺陷，但是微生物发酵法生产透明质酸还存在产量有待提高的问题。因此，需要开发一种透明质酸的发酵新工艺，以提高透明质酸的发酵产量。
发明内容
本发明旨在提供一种能够提高透明质酸产量的生产方法。
本发明的发明人经过深入和广泛的研究之后发现，在透明质酸发酵过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到12～20mmol/L·h时补加乙偶姻能够促进透明质酸的合成，所得发酵产物中透明质酸的含量能够得以明显提高。基于此，完成了本发明。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种透明质酸的生产方法，该方法包括在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到12～20mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。
在一种优选实施方式中，在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到14～18mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。
在一种优选实施方式中，所述乙偶姻的添加比例为透明质酸发酵液的0.1～0.5wt％。
在一种优选实施方式中，所述透明质酸的生产菌株为兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)。
在一种优选实施方式中，当发酵液中残糖含量≤5g/L时结束发酵。
在一种优选实施方式中，所述透明质酸的生产方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：在无菌条件下，将透明质酸生产菌株划线于平板培养基中，在温度32～38℃下培养18～24h；
(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入摇瓶培养基，然后放置于摇床中，在温度32～38℃、转速160～220rpm条件下培养8～18h，得到种子培养液；任选地，将所得种子培养液以0.5～5％接种量接入装有摇瓶培养基的种子罐中并在温度32～38℃、通气比0.3～1VVM、转速150～300rpm、罐压0.03～0.05MPa条件下培养5～10h，得到种子液；
(3)发酵培养：将培养好的种子培养液或种子液以1～10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，在温度32～38℃、通气比0.5～1.5VVM、转速80～300rpm、罐压0.04～0.06MPa和pH 6.5～8.0条件下进行发酵培养，当发酵液中氧消耗速率首次达到预定值时，往发酵液中添加乙偶姻，继续培养，当发酵液中残糖含量≤5g/L时结束发酵。
在一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述平板培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
在一种优选实施方式中，步骤(2)中，所述摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
在一种优选实施方式中，步骤(3)中，所述发酵培养基的pH值为6.5～7.5，且每升发酵培养基中含有如下组分：葡萄糖60～80g、蛋白胨5～15g、酵母浸膏2～6g、谷氨酸钠0.5～2g、磷酸二氢钾0.1～1g、硫酸镁0.1～1g、泡敌0.1～1g。
在一种优选实施方式中，所述发酵培养所采用的发酵罐容积为30L～100m3。
采用本发明提供的方法制备透明质酸，所得发酵产物中透明质酸的含量能够得以明显提高。
具体实施方式
本发明在透明质酸的发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次达到12～20mmol/L·h(如12、13、14、15、16、17、18、19、20mmol/L·h)时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。优选地，在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到14～18mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。本发明中，所述氧消耗速率(OUR)通过质谱分析仪检测发酵尾气测得。本发明通过在发酵过程中当OUR首次达到12～20mmol/L·h、优选达到14～18mmol/L·h时添加乙偶姻，能够促进透明质酸的合成，提高发酵产物中透明质酸的含量。此外，所述乙偶姻的添加比例优选为透明质酸发酵液的0.1～0.5wt％，如0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％等。
本发明的主要改进之处在于在发酵培养过程中添加乙偶姻，而透明质酸生产菌株的具体种类及获取方式、各阶段的培养条件等均可以为本领域的常规选择，例如，所述透明质酸的生产菌株可以为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)。
在本发明中，一般地，当发酵液中残糖含量≤5g/L时结束发酵。
本发明的一些具体实施方式中，所述透明质酸的生产方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：在无菌条件下，将透明质酸生产菌株划线于平板培养基中，在温度32～38℃下培养18～24h；
(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入摇瓶培养基，然后放置于摇床中，在温度32～38℃、转速160～220rpm条件下培养8～18h，得到种子培养液；任选地，将所得种子培养液以0.5～5％接种量接入装有摇瓶培养基的种子罐中并在温度32～38℃、通气比0.3～1VVM、转速150～300rpm、罐压0.03～0.05MPa条件下培养5～10h，得到种子液；
(3)发酵培养：将培养好的种子培养液或种子液以1～10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，在温度32～38℃、通气比0.5～1.5VVM、转速80～300rpm、罐压0.04～0.06MPa和pH 6.5～8.0条件下进行发酵培养，当发酵液中氧消耗速率首次达到预定值时，往发酵液中添加乙偶姻，继续培养，当发酵液中残糖含量≤5g/L时结束发酵。
本发明对于平板培养基、摇瓶培养基、发酵培养基的种类均没有特别的限定，可以为现有的各种适合菌体各个阶段生长的培养基。例如，所述平板培养基和摇瓶培养基均可以各自独立地为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。在一种优选实施方式中，所述发酵培养基的pH值为6.5～7.5，且每升发酵培养基中含有如下组分：葡萄糖60～80g、蛋白胨5～15g、酵母浸膏2～6g、谷氨酸钠0.5～2g、磷酸二氢钾0.1～1g、硫酸镁0.1～1g、泡敌0.1～1g。此外，在发酵培养过程中用于调节pH值的试剂具体可以选自氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。此外，所述发酵培养所用的发酵罐容积可以为30L～100m3。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例和对比例中使用兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus，菌种编号：ATCC39920)作为生产菌株来进一步阐述发酵透明质酸的生产方法。
以下实施例和对比例中涉及的相关设备包括：50L发酵罐、1m3发酵罐、15m3发酵罐和100m3发酵罐。
以下实施例和对比例中：
(1)氧消耗速率(OUR)通过质谱分析仪检测发酵尾气得到；
(2)透明质酸含量采用Bitter-Muir的咔唑法进行测定；
(3)发酵液中残糖含量通过西尔曼生物传感分析仪进行测定。
实施例1：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50L发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：在无菌条件下，将兽疫链球菌种子冻存液划线于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，在温度35℃下培养22h；
(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的2L摇瓶内，然后放置于摇床中，在温度35℃、转速200rpm条件下培养12h，得到种子培养液；
(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5VVM，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至12mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。其中，每升发酵培养基中含有如下组分：葡萄糖70g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、谷氨酸钠1g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.5g、泡敌0.5g，使用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为12.8g/L。
实施例2：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50L发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5VVM，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至14mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。每升发酵培养基中的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为13.0g/L。
实施例3：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50L发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5VVM，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至18mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。每升发酵培养基中的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为12.7g/L。
实施例4：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50L发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5VVM，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至20mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。其中，每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为12.3g/L。
实施例5：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50L发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5VVM，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至16mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.1wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为12.9g/L。
实施例6：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50L发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例1；
(2)种子培养：同实施例1；
(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5VVM，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至16mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.5wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为13.7g/L。
实施例7：一种透明质酸的生产方法，发酵使用1m3发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例1；
(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的500ml摇瓶内，然后放置于摇床中，在温度35℃、转速200rpm条件下培养12h，得到种子培养液。将所述种子培养液以0.5％接种量接入50L装有牛肉膏蛋白胨培养基的种子罐中，在温度35℃、转速200rpm、罐压0.05MPa和通气比0.8VVM条件下培养6h，得到扩培种子液；
(3)发酵培养：将培养好的种子液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5VVM，转速控制在150～200rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至16mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为14.3g/L。
实施例8：一种透明质酸的生产方法，发酵使用15m3发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例1；
(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的2000ml摇瓶内，然后放置于摇床中，在温度35℃、转速200rpm条件下培养12h，得到种子培养液。将所述种子培养液以0.5％接种量接入1m3装有牛肉膏蛋白胨培养基的种子罐中，在温度35℃、转速200rpm、罐压0.05MPa和通气比0.6VVM条件下培养6h，得到扩培种子液；
(3)发酵培养：将培养好的种子液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在0.8～1.2VVM，转速控制在100～150rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至16mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为14.0g/L。
实施例9：一种透明质酸的生产方法，发酵使用100m3发酵罐，包括如下步骤：
(1)菌种活化：同实施例1；
(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的2000ml摇瓶内，然后放置于摇床中，在温度35℃、转速200rpm条件下培养12h，得到种子培养液。将所述种子培养液以0.5％接种量接入500L装有牛肉膏蛋白胨培养基的种子罐中，在温度35℃、转速200rpm、罐压0.05MPa和通气比0.8VVM条件下培养6h，得到一级扩培种子液，培养好后以1％接种量接入5m3装有牛肉膏蛋白胨培养基的种子罐中，在温度35℃、转速150rpm、罐压0.05MPa和通气比0.5VVM条件下培养5h，得到二级扩培种子液；
(3)发酵培养：将培养好的种子液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制pH值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的OUR数值，发酵过程中通气比控制在0.6～1.0VVM，转速控制在80～120rpm，罐压控制在0.04～0.05MPa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至16mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/L时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为13.4g/L。
实施例10
按照实施例5的方法制备透明质酸，不同的是，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至16mmol/L·h时往发酵液中添加比例为0.05wt％的乙偶姻，其他条件同实施例5，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为11.3g/L。
实施例11
按照实施例6的方法制备透明质酸，不同的是，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至16mmol/L·h时往发酵液中添加比例为0.55wt％的乙偶姻，其他条件同实施例6，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为11.5g/L。
对比例1
按照实施例1的方法制备透明质酸，不同的是，发酵培养过程中不添加乙偶姻，其他条件同实施例1，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为9.5g/L。
对比例2
按照实施例1的方法制备透明质酸，不同的是，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至10mmol/L·h时往发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，其他条件同实施例1，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为11.0g/L。
对比例3
按照实施例4的方法制备透明质酸，不同的是，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(OUR)首次至22mmol/L·h时往发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，其他条件同实施例4，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/L，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为10.9g/L。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种透明质酸的生产方法，其特征在于，该方法包括在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到12~20mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻；所述乙偶姻的添加比例为透明质酸发酵液的0.1~0.3wt%；所述透明质酸的生产菌株为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）。
2.根据权利要求1所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到14~18mmol/L·h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。
3.根据权利要求1所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，当发酵液中残糖含量≤5g/L时结束发酵。
4.根据权利要求1~3中任意一项所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，所述透明质酸的生产方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：在无菌条件下，将透明质酸生产菌株划线于平板培养基中，在温度32～38℃下培养18～24h；
（2）种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入摇瓶培养基，然后放置于摇床中，在温度32～38℃、转速160～220rpm条件下培养8～18h，得到种子培养液；任选地，将所得种子培养液以0.5～5%接种量接入装有摇瓶培养基的种子罐中并在温度32～38℃、通气比0.3～1VVM、转速150～300rpm、罐压0.03～0.05MPa条件下培养5～10h，得到种子液；
（3）发酵培养：将培养好的种子培养液或种子液以1～10%接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，在温度32～38℃、通气比0.5～1.5VVM、转速80～300rpm、罐压0.04～0.06MPa和pH 6.5～8.0条件下进行发酵培养，当发酵液中氧消耗速率首次达到预定值时，往发酵液中添加乙偶姻，继续培养，当发酵液中残糖含量≤5g/L时结束发酵。
5.根据权利要求4所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，步骤（1）中，所述平板培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
6.根据权利要求4所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，步骤（2）中，所述摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
7.根据权利要求4所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵培养基的pH值为6.5~7.5，且每升发酵培养基中含有如下组分：葡萄糖60~80g、蛋白胨5~15g、酵母浸膏2~6g、谷氨酸钠0.5~2g、磷酸二氢钾0.1~1g、硫酸镁0.1~1g、泡敌0.1~1g。
8.根据权利要求4所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，所述发酵培养所采用的发酵罐容积为30L~100m³。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111609573.0A CN114150030B (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 一种透明质酸的生产方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111609573.0A CN114150030B (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 一种透明质酸的生产方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114150030A CN114150030A (zh) | 2022-03-08 |
| CN114150030B true CN114150030B (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=80462876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111609573.0A Active CN114150030B (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 一种透明质酸的生产方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114150030B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62257901A (ja) * | 1986-05-02 | 1987-11-10 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | ヒアルロン酸の製造法 |
| CN1826059A (zh) * | 2003-06-30 | 2006-08-30 | 大塚制药株式会社 | 含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物 |
| CN102057052A (zh) * | 2008-04-14 | 2011-05-11 | 巴斯夫欧洲公司 | 由麦类植物制备葡萄糖水溶液的方法 |
| CN104619652A (zh) * | 2012-06-15 | 2015-05-13 | 微视生物技术有限公司 | 新型生物催化剂组合物和使用的方法 |
| CN109468355A (zh) * | 2018-10-16 | 2019-03-15 | 河北科技大学 | 一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法 |
| CN111939100A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-17 | 广州黛诗莎化妆品有限公司 | 一种补水玻尿酸组合水位发酵美白液提取工艺 |
| CN112522232A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-19 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种烟酰胺核糖激酶及烟酰胺单核苷酸的合成方法 |
| CN115927143A (zh) * | 2022-09-05 | 2023-04-07 | 江南大学 | 多途径优化提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的方法及菌株 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1373889A2 (en) * | 2000-07-31 | 2004-01-02 | Maxygen, Inc. | Biosensors, reagents and diagnostic applications of directed evolution |
| US8492114B2 (en) * | 2008-01-25 | 2013-07-23 | Battelle Energy Alliance, Llc | Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes |
-
2021
- 2021-12-24 CN CN202111609573.0A patent/CN114150030B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62257901A (ja) * | 1986-05-02 | 1987-11-10 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | ヒアルロン酸の製造法 |
| CN1826059A (zh) * | 2003-06-30 | 2006-08-30 | 大塚制药株式会社 | 含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物 |
| CN102057052A (zh) * | 2008-04-14 | 2011-05-11 | 巴斯夫欧洲公司 | 由麦类植物制备葡萄糖水溶液的方法 |
| CN104619652A (zh) * | 2012-06-15 | 2015-05-13 | 微视生物技术有限公司 | 新型生物催化剂组合物和使用的方法 |
| CN109468355A (zh) * | 2018-10-16 | 2019-03-15 | 河北科技大学 | 一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法 |
| CN111939100A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-17 | 广州黛诗莎化妆品有限公司 | 一种补水玻尿酸组合水位发酵美白液提取工艺 |
| CN112522232A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-19 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种烟酰胺核糖激酶及烟酰胺单核苷酸的合成方法 |
| CN115927143A (zh) * | 2022-09-05 | 2023-04-07 | 江南大学 | 多途径优化提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的方法及菌株 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Proteomic investigation of the impact of oxygen on the protein profiles of hyaluronic acid-producing Streptococcus zooepidemicus;Ting-Feng Wu1等;《Proteomics》;第9卷;第4508页左栏第2.1和2.2小节，第4512-4516页讨论部分 * |
| 方柏山著.《生物技术过程模型化与控制》.暨南大学出版社,1997,第19页. * |
| 透明质酸及其发酵生产概述;郭学平等;《中国生化药物杂志》(第4期);第209-212页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114150030A (zh) | 2022-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20110281308A1 (en) | Yellow Pigments Generation Deficient Sphingomonas Strain and Application Thereof in Gellan Gum Production | |
| Liu et al. | Efficient production of high-molecular-weight hyaluronic acid with a two-stage fermentation | |
| CN112094752B (zh) | 一种利用出芽短梗霉发酵生产超低分子量普鲁兰多糖的方法 | |
| CN109468355A (zh) | 一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法 | |
| CN108467876A (zh) | 一种提高可得然胶产量的发酵方法 | |
| CN110938564A (zh) | 一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法 | |
| CN103966271B (zh) | 发酵生产dha的方法 | |
| AU619281B2 (en) | Process for preparing a heteropolysaccharide, heteropolysaccharide obtained thereby, its use, and strain ncib 11883 | |
| US4154654A (en) | Method for preparing polysaccharides | |
| CN114150030B (zh) | 一种透明质酸的生产方法 | |
| US5071976A (en) | Novel heteropolysaccharide | |
| CN101195837B (zh) | 一种发酵法生产1,3-丙二醇的连续发酵方法 | |
| CN105567779A (zh) | 一种高产低分子量热凝胶的发酵方法 | |
| US8227220B2 (en) | Process for the preparation of ethanol from starch | |
| CN109161569B (zh) | 一种微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法 | |
| CN102234670B (zh) | 一种惰性吸附载体固态发酵细菌纤维素的方法 | |
| CN110951798A (zh) | γ-聚谷氨酸的生物发酵方法及其应用 | |
| CN101619331A (zh) | 兽疫链球菌发酵产透明质酸的方法 | |
| CN111303248B (zh) | 一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法 | |
| CN106893749B (zh) | 一种在发酵过程中外源添加代谢产物提高透明质酸产量的方法 | |
| CN103468762A (zh) | 用于增加韦兰胶发酵产量的携氧剂及其应用 | |
| KR20190011450A (ko) | 푸코오스를 포함하는 다당류 제조방법 | |
| CN109486877A (zh) | 补料发酵工艺生产雷帕霉素的方法 | |
| CN113817795B (zh) | 一种醋酸***的发酵方法 | |
| CN110982716B (zh) | 用于生产天然酪醇的菌株及天然酪醇的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |