CN108467876A - 一种提高可得然胶产量的发酵方法 - Google Patents

一种提高可得然胶产量的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高可得然胶产量的发酵新方法，包括以下步骤：将产可得然胶的菌株种子培养液接入发酵培养基中培养，在可得然胶发酵的48小时和72小时，分别放料发酵液，补加新鲜培养基，并且控制发酵过程的溶氧不低于30％。采用本发明工艺比放料补糖工艺可得然胶产量提高了40％，发酵液的凝胶强度提高了58％。当本发明产胶期溶氧控制在30％以上，相对于溶氧在10％以下的工艺，本发明可得然胶产量提高86.7％，凝胶强度提高了91.4％。本发明的方法提高了在发酵中后期生产可得然胶产胶的速率，工艺控制简单，节约生产成本，为微生物发酵生产可得然胶提供了新方法。

Description

一种提高可得然胶产量的发酵方法
技术领域
本发明属于微生物多糖发酵领域，特别涉及一种提高可得然胶产量的发酵方法。
背景技术
可得然胶(Curdlan)是一种新型的微生物胞外多糖，由于其具有在加热条件下形成凝胶的独特性质，所以又被称做热凝胶。Curdlan的化学结构分析表明它是由单一的D-葡萄糖在C1和C3位置以β-1，3-糖苷键连接而成的无分支的均一多糖聚合物。
可得然胶发酵是典型的非偶联型发酵，在菌种生长期间，没有可得然胶产生；在菌体生长结束，氮源限制条件下，菌体开始分泌可得然胶。可得然胶是水不溶性，易溶于碱液、二甲基亚砜。在加热到55℃时，可以得到低强度可逆性固体可得然胶；继续加热到80℃以上时，可以形成不可逆的固体可得然胶。由于这一特性，且安全无毒，已经广泛应用于面条、果冻等食品。美国FDA在1996年批准可得然胶作为可食用多糖，是第三个作为食品添加剂的微生物多糖。中国食品药品监督局与2006年批准可得然胶可以用于食品领域。
可得然胶发酵是一个由土壤杆菌(Agrobacterium sp.)或根瘤菌(Rhizobium sp)把葡萄糖、蔗糖等小分子糖合成多聚糖的过程。在发酵过程中，碳源会大量消耗，导致发酵后期碳源含量降低，不能满足菌体合成可得然胶的需要。刘惠等(不同的底物流加方式对Alcaligenes faecalis发酵生产热凝胶的影响,生物技术,2008年18(4):78-81)采用两段法优化可得然胶发酵生产，菌体生长阶段用氨水控制pH为7.0，在可得然胶合成阶段采用葡萄糖连续流加，可得然胶产量提高了157％。韩国Lee等人(Production ofcurdlanusingsucrose or sugar cane molasses by two-step fed-batch cultivation ofAgrobacterium species,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,1997,18:255-259)采用ATCC31749菌种，研究补加碳源对可得然胶发酵的影响，相对于没有补加碳源的对照，产量提高了20％。可得然胶是在氮源限制条件下产生的胞外多糖，当氮源充足，菌体只进行生物量的积累，而在氮源耗净时，菌体停止生长开始合成可得然胶(ntrB基因对Agrobacterium sp.ATCC 31749合成胞外多糖的调控研究，工业微生物，2011年第41卷第六期,26-33)。
但是本发明意外发现，在发酵中后期补加含有氮源的培养基，可得然胶产量不仅没有降低，而且还提高了40％左右，同时可得然胶产品质量也有所提升，产品关键性能指标凝胶强度增加了58％。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用半连续培养、且补加培养基成分的方法生产可得然胶，可显著提高可得然胶产量，有助于降低可得然胶的生产成本。本发明在放料时间选择上，分为两个阶段，第一次放料补料时间为30-54h，第二次放料补料时间为60-84h。在这两个时间段内放料补料，均能增加菌体量和可得然胶产量。采用本发明工艺比放料补糖工艺可得然胶产量提高了40％，发酵液的凝胶强度提高了58％。当本发明产胶期溶氧控制在30％以上，相对于溶氧在10％以下的工艺，本发明可得然胶产量提高86.7％，凝胶强度提高了91.4％。
以下是本发明技术方案的详细描述。
本发明提供了一种发酵生产可得然胶的方法，将产可得然胶的菌株种子培养液接入发酵培养基中培养，发酵过程中进行放料补料，并且控制pH，溶氧浓度DO不低于30％，直至发酵培养结束。
具体步骤如下：
(1)从产可得然胶的菌株的斜面刮取一环菌接种到种子培养基中，振荡培养，得到活化的产可得然胶的菌株种子液；
(2)将步骤(1)中得到的种子液接种到发酵培养基中；
(3)在发酵48h时，放料发酵液，然后一次补料同样体积的步骤(2)所述的培养基，继续发酵，控制溶氧浓度DO；
(4)发酵至72h时，放料发酵液，然后一次流加同样体积的步骤(2)所述的培养基，继续发酵，控制溶氧浓度DO；
(5)将上述发酵结束后的发酵液加碱溶解，离心，上清用盐酸调节pH值，离心取沉淀，蒸馏水洗涤三次，烘干，即得到所述可得然胶，其中，发酵开始到12小时用碱控制发酵液的pH，发酵12小时至发酵结束用酸和碱配合控制发酵液的pH值。
步骤(1)中，所述产可得然胶的菌株包括土壤杆菌ATCC 31749、根瘤菌ATCC 31750或ATCC21680、或其他公开报道的能够生产可得然胶的菌株等中的一种或几种；优选地，为土壤杆菌ATCC 31749、根瘤菌ATCC 31750或ATCC21680。
步骤(1)中，所述种子培养基组成为：每升培养基中含有(g/L)：蔗糖10-30，(NH4)2HPO4 3-8，KH2PO4 1-3，玉米浆2-4，MgSO4.7H2O 0.5-2，CaCO3 1-4；优选地，为每升培养基中含有(g/L)：蔗糖20，(NH4)2HPO4 5，KH2PO4 1.5，玉米浆3，MgSO4.7H2O 1，CaCO3 3。
步骤(1)中，所述振荡培养的温度为28-32℃；优选地，为30℃。
步骤(1)中，所述振荡培养的转速为150-250r/min；优选地，为250r/min。
步骤(1)中，所述振荡培养的时间为16-20h；优选地，为18h。
步骤(2)中，所述发酵培养基成分为：每升培养基中含有(g/L)：葡萄糖40-100、(NH4)2HPO4 1-3、酵母膏0.5-1、KH2PO4 0.5-2、MgSO4·7H2O 0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01、CaCO3 1-5；优选地，为每升培养基中含有(g/L)：葡萄糖50、(NH4)2HPO4 1.5、酵母膏1、KH2PO4 1、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O0.05、MnSO4·H2O 0.02、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01和CaCO3 3。
步骤(2)中，所述发酵条件优选为：转速500r/min，通气量1vvm，发酵96h。
步骤(2)中，所述接种体积为5％-10％(v/v)；优选地，为10％(v/v)。
步骤(3)中，所述放料体积占培养基总体积的10％-30％；优选地，为25％。
步骤(3)中，所述补料体积占培养基总体积的10％-30％；优选地，为25％；
其中，所述放料体积与补料体积一样。
其中，所述培养基成分为：每升培养基中含有(g/L)：葡萄糖40-100、(NH4)2HPO4 1-3、酵母膏0.5-1、KH2PO4 0.5-2、MgSO4·7H2O 0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01、CaCO3 1-5；优选地，为每升培养基中含有(g/L)：葡萄糖50、(NH4)2HPO4 1.5、酵母膏1g、KH2PO4 1、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.05、MnSO4·H2O0.02、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01和CaCO3 3。
步骤(3)中，所述发酵液中溶氧浓度DO不低于30％；优选地，为35％。
步骤(4)中，所述放料体积占培养基总体积的10-30％；优选地，为12.5％。
步骤(4)中，所述一次流体积占培养基总体积的10-30％；优选地，为12.5％。
其中，所述放料体积与一次流体积一样。
其中，所述培养基成分为：每升培养基中含有(g/L)：葡萄糖40-100、(NH4)2HPO4 1-3、酵母膏0.5-1、KH2PO4 0.5-2、MgSO4·7H2O 0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01、CaCO3 1-5；优选地，为每升培养基中含有(g/L)：葡萄糖50、(NH4)2HPO4 1.5、酵母膏1、KH2PO4 1、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.05、MnSO4·H2O0.02、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01和CaCO3 3。
步骤(4)中，所述发酵液中溶氧浓度DO不低于30％；优选地，为35％。
步骤(5)中，所述碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2等中的一种或几种；优选地，为NaOH。
步骤(5)中，所述碱液浓度为0.5-3mol/L；优选地，为1-3mol/L；进一步优选地，为1mol/L。
步骤(5)中，所述盐酸浓度为1-3mol/L；优选地，为3mol/L。
步骤(5)中，所述每次水洗加蒸馏水体积为50-150ml；优选地，为150ml。
步骤(5)中，所述烘干温度为50-100℃；优选地，为60℃。
步骤(5)中，所述上清用盐酸调节pH值为5.0-8.0；优选地，为7.0。
步骤(5)中，所述发酵开始到12小时所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钙或氢氧化钾等中的一种或几种；优选地，为氢氧化钠或氢氧化钾。
步骤(5)中，所述发酵开始到12小时所用的碱的浓度为1-3mol/L；优选地，为3mol/L。
步骤(5)中，所述发酵开始到12小时发酵液的pH值为6.0-7.5；优选地，为7。
步骤(5)中，所述发酵12小时至发酵结束所用的酸为盐酸、磷酸或柠檬酸、乙酸等中的一种或几种；优选地，为盐酸、磷酸或柠檬酸。
步骤(5)中，所述发酵12小时至发酵结束所用的酸的浓度为1-3mol/L；优选地，为2mol/L。
步骤(5)中，所述发酵12小时至发酵结束所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙等中的一种或几种；优选地，为氢氧化钠或氢氧化碱。
步骤(5)中，所述发酵12小时至发酵结束所用的碱的浓度为1-3mol/L；优选地，为2mol/L。
步骤(5)中，所述发酵12小时至发酵结束发酵液的pH值为4.5-6.0；优选地，为5.5。
本发明的有益效果在于：本发明根据可得然胶发酵特点，利用半连续发酵的方法，把可得然胶产量从40g/L提高到了56g/L，提高了40％。所得可得然胶符合国标中对可得然胶的要求，可满足可得然胶的工业生产要求。本发明的方法提高了在发酵中后期生产可得然胶产胶的速率，工艺控制简单，节约生产成本，为微生物发酵生产可得然胶提供了新方法。
附图说明
图1为不同流加方式对可得然胶发酵菌体量的影响
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1(一次流加碳源)
(1)从实验室保藏的ATCC31749菌株斜面刮取一环到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，于30℃、250r/min振荡培养18h，用作种子液；其中，种子培养基组成(g/L)为：蔗糖20g，(NH4)2HPO4 5g，KH2PO4 1.5g，玉米浆3g，MgSO4.7H2O 1g，CaCO3 3g。
(2)把步骤(1)ATCC31749菌的种子液接种到8L发酵培养基，接种体积为10％(v/v)。接种后于30℃、500r/min通气量为1vvm，培养96h；其中，发酵培养基组成(g/L)为：葡萄糖50g、(NH4)2HPO4 1.5g、酵母膏1g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.05g、MnSO4·H2O 0.02g、CoCl2·6H2O 0.01g、ZnCl2 0.01g和CaCO3 3g。
(3)发酵到48h，放料体积为总体积的25％，然后一次补加同等体积的浓度为50g/L葡萄糖溶液。继续发酵至96h，发酵结束。
(4)将上述发酵液10g加150ml碱溶解，离心，上清用盐酸调pH至7.0，离心取沉淀，蒸馏水洗涤三次，60℃烘干，即可得可得然胶样品，然后称重计算可得然胶产量。
(5)把步骤(4)得到的样品测定凝胶强度。测定凝胶强度的方法为：根据国标方法，取0.3g样品，加水15ml，然后高速匀浆10min，13000r/min，将匀浆好的悬浮液转至18mm×180mm的试管中，95℃水浴加热10min，自来水冷却降至室温，取其距底部10mm-15mm的部位平切，选用直径0.5cm不锈钢活塞式圆柱体探头，探头移动速速250mm/min。
实施例2(连续流加培养基)
(1)发酵0-48h阶段工艺与实施例1相同。
(2)发酵至48h，放料体积为总体积的25％，然后缓慢补加同等体积的培养基，持续补加时间为24h。发酵至72h时，继续放料，放料体积占总体积的12.5％，然后缓慢补加同等体积的培养基，持续补加时间为12h。继续发酵至96h，。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在30％以上。流加的培养基成分为：每升培养基中含有(g/L)：(NH4)2HPO4 1.5g、酵母膏1g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.05g、MnSO4·H2O0.02g、CoCl2·6H2O 0.01g、ZnCl2 0.01g。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
实施例3(一次流加培养基)
(1)发酵0-48h期间工艺与实施例1相同。
(2)发酵至48h，放料体积为总体积的25％，然后然后一次补加同等体积的培养基。发酵至72h时，继续放料，放料体占总体积的12.5％，然后一次补加同等体积的培养基。继续发酵至96h。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在30％以上。补料培养基成分同实施例2。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
实施例4(控制产胶期溶氧20％-30％)
(1)发酵0-48h阶段工艺与实施例2相同。
(2)发酵到48h，放料体积为总体积的25％，然后缓慢补加同等体积的培养基，持续补加时间为24h。发酵至72h时，继续放，放料体积占总体积的12.5％，然后缓慢补加同等体积的培养基，持续补加时间为12h。继续发酵至96h。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在20％-30％。补料培养基成分同实施例2。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
实施例5(控制产胶期溶氧10％-20％)
(1)发酵0-48h阶段工艺与实施例2相同。
(2)发酵到48h，放料体积为总体积的25％，然后缓慢补加同等体积的培养基，持续补加时间为24h。发酵72h时，继续放料，放料体积占总体积的12.5％，然后缓慢补加同等体积的培养基，持续补加时间为12h。继续发酵至96h。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在10％-20％。补料培养基成分同实施例2。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
实施例6(控制产胶期溶氧10％以下)
(1)发酵0-48h阶段工艺与实施例2相同。
(2)发酵到48h，放料体积为总体积的25％，然后缓慢补加同等体积的培养基，持续补加时间为24h。发酵72h时，继续放料，放料体积占总体积的12.5％，然后缓慢补加同等体积的培养基，持续补加时间为12h。继续发酵至96h。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在10％以下。补料培养基成分同实施例2。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
表1不同补料方式对发酵的影响
表2可得然胶发酵96产量和凝胶强度表格
从表1和表2及图1可以看出，本发明在放料后，一次补加同等体积的培养基，相对于放料后单纯补加碳源，可以提高可得然胶的产量，实施例2和实施例3分别提高40％和38％，同时凝胶强度分别提高了54.5％和58.2％。可得然胶生产速率在补加培养基后较单纯补加碳源的工艺提高了30％。
可得然胶发酵中后期，随着产量的增加，粘度也会增大，菌体也会逐渐的裂解死亡，碳源逐渐无法满足可得然胶合成需要，一般情况下是补充碳源。在可得然胶发酵中，已报道的补料有补加碳源(蔗糖、葡萄糖)[詹晓北.粪产碱杆菌在不同底物限制性条件下连续培养，2008]。本发明采用了半连续培养的方法，就是在发酵中后期放料，然后再补充碳源，但是这样会造成菌体量下降，营养因子被稀释等问题。在其他产品发酵时，会补加一定量的氮源，但是可得然胶是在氮源限制的条件下合成的，所以，目前还未有见到在发酵中后期补加氮源的报道。
但是本发明意外的发现在可得然胶发酵中后期，补加一定的培养基，不仅可以提供发酵需要的碳源，降低发酵液粘度，还能增加发酵体系中的营养因子，最主要的是可以增加菌体量，提高后期可得然胶的产量，同时提高了可得然胶产品的凝胶强度。
表3不同溶氧控制策略对可得然胶发酵的影响
根据表3可知，在产胶期控制溶氧30％以上的工艺可得然胶产量较溶氧控制10％-20％的工艺，及10％以下的工艺都高，产量提升86.7％，实施例4较实施例6凝胶强度提高了91.4％。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (14)

1.一种发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，将产可得然胶的菌株种子培养液接入发酵培养基中培养，发酵过程中进行放料补料，并且控制pH和溶氧浓度DO不低于30％，直至发酵培养结束。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤具体为：
(1)从产可得然胶的菌株的斜面刮取一环菌接种到种子培养基中，振荡培养，得到活化的产可得然胶的菌株种子液；
(2)将所述步骤(1)中得到的种子液接种到发酵培养基中；
(3)在发酵48h时，放料发酵液，然后一次补料同样体积的步骤(2)所述的培养基，继续发酵，控制溶氧浓度DO；
(4)发酵至72h时，放料发酵液，然后一次流加同样体积的步骤(2)所述的培养基，继续发酵，控制溶氧浓度DO；
(5)将上述发酵结束后的发酵液加碱溶解，离心，上清用盐酸调节pH值，离心取沉淀，蒸馏水洗涤三次，烘干，即得到所述可得然胶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述产可得然胶的菌株包括土壤杆菌ATCC 31749、根瘤菌ATCC 31750或ATCC21680中的一种或几种。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述菌株种子培养基组成为：每升培养基中含有(g/L)：蔗糖10-30，(NH4)2HPO4 3-8，KH2PO4 1-3，玉米浆2-4，MgSO4.7H2O0.5-2，CaCO3 1-4。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述振荡培养的温度为28-32℃；和/或，所述振荡培养的转速为150-250r/min；和/或，所述振荡培养的时间为16-20h。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：每升发酵培养基包括(g/L)：葡萄糖40-100、(NH4)2HPO4 1-3、酵母膏0.5-1、KH2PO4 0.5-2、MgSO4·7H2O 0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01、CaCO3 1-5。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵条件为：转速500r/min，通气量1vvm，发酵96h；和/或，所述接种体积为5％-10％(v/v)。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述放料体积占培养基总体积的10％-30％；和/或，所述补料体积占培养基总体积的10％-30％；其中，所述放料体积与补料体积一样。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养基成分为：每升培养基中含有(g/L)：葡萄糖40-100、(NH4)2HPO4 1-3、酵母膏0.5-1、KH2PO4 0.5-2、MgSO4·7H2O0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01、CaCO31-5；和/或，所述发酵液中溶氧浓度DO不低于30％。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述放料体积占培养基总体积的10％-30％；和/或，所述补料体积占培养基总体积的10％-30％；其中，所述放料体积与补料体积一样。
11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述培养基成分为：每升培养基中含有(g/L)：葡萄糖40-100、(NH4)2HPO4 1-3、酵母膏0.5-1、KH2PO4 0.5-2、MgSO4·7H2O0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01、CaCO31-5；和/或，所述发酵液中溶氧浓度DO不低于30％。
12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2中的一种或几种；和/或，所述碱液浓度为0.5-3mol/L；和/或，所述盐酸浓度为1-3mol/L；和/或，所述每次水洗加蒸馏水体积为50-150ml；和/或，所述烘干温度为50-100℃；和/或，所述上清用盐酸调节pH值为5.0-8.0。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述发酵开始到12小时所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钙或氢氧化钾中的一种或几种；和/或，所述发酵开始到12小时发酵液的pH值为6.0-7.5。
14.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述发酵12小时至发酵结束所用的酸为盐酸、乙酸、磷酸或柠檬酸中的一种或几种；和/或，所述发酵12小时至发酵结束所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钙、或氢氧化钾中的一种或几种；和/或，所述发酵12小时至发酵结束发酵液的pH值为4.5-6.0。
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