CN111303248B - 一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法，属于生物发酵技术领域，替考拉宁的发酵方式为补料分批发酵，补料方式为流加补料，流加物质为乙酸钠溶液，流加补料的时间为补料分批发酵的第一次对数生长期至发酵终止，流加补料过程中流加速率逐步下降。本发明提供的补料方法通过在替考拉宁发酵的第一次对数生长期至发酵终止阶段控制流加速率进行乙酸钠溶液的流加，显著提高了替考拉宁的发酵产量，可达4.8g/L，同时流加乙酸钠溶液相较于流加碳源不会引起的反馈抑制效应的发生，也不会出现发酵单位后劲不足和发酵后期料液起泡逃液问题；该补料方法成本低，工艺简单易于推广且易于在大规模生产上使用。

Description

一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法。
背景技术
替考拉宁又称肽可霉素，是由游动放线菌(Actinoplanesteichomyceticus)通过生物发酵法产生的一种新的糖肽类抗生素，是继万古霉素后又一治疗重症革兰氏阳性菌感染，是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)感染的最有效武器。
替考拉宁的相对分子质量约为1900，其由7个分子的氨基酸和3个分子的糖基及酰基脂肪酸侧链组成。主要活性成分为TA2，由5个化学结构十分相似的化合物(TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4和TA2-5)组成，而5个组分的差异仅表现在脂肪酸链的不同(参考图1)。其框架结构为由6个肽键将7个氨基酸连接而成，其中1、2、4,、5和6这5个氨基酸由酪氨酸衍生而成，3和7这2个氨基酸以乙酸盐为生物合成前体。
在我国，替考拉宁虽已实现产业化，但发酵产量较低，为2.0-3.5g/L。虽然现有技术如申请号为201410729473.5的中国发明专利，通过在发酵过程中向发酵培养基中添加所述补料培养基，降低抑制产生替考拉宁次生代谢途径的因素，可提高替考拉宁发酵的产量，但这种方法成本较高，且容易出现发酵后期料液起泡逃液、流加葡萄糖等碳源引起的反馈抑制效应的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种成本低且工艺简单的可提高替考拉宁发酵产量的补料方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法，替考拉宁的发酵方式为补料分批发酵，所述补料分批发酵的补料方式为流加补料，流加物质为乙酸钠溶液，所述流加补料的时间为补料分批发酵的第一次对数生长期至发酵终止，流加补料过程中流加速率逐步下降。
本发明的有益效果在于：组成替考分子的框架结构中有两个氨基酸是以乙酸盐为生物合成前体的，本发明使用的补料物质是15％乙酸钠溶液，作为小分子其易被生物体吸收利用；在生物体内乙酸钠仅通过乙酰辅酶A合成途径即可活化生成乙酰辅酶A进入代谢流中，相较其他糖类物质省去了中间分解代谢环节；乙酰辅酶A是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽型物质，通过补加适量乙酸钠提高了生物体内乙酸辅酶A的含量，间接促进生物体内能源物质代谢；另外发明人在长期实际生产中研究总结发现到游动放线菌(Actinoplanesteichomyceticus)在微碱性条件下，替考拉宁的合成量较大，而15％乙酸钠pH约11.5左右，起到外源性碱的作用。本发明提供的补料方法，通过在替考拉宁发酵的第一次对数生长期至发酵终止阶段控制流加速率进行乙酸钠溶液的流加，显著提高了替考拉宁的发酵产量，可达4.8g/L，同时流加乙酸钠溶液相较于流加碳源不会引起的反馈抑制效应的发生，也不会出现发酵单位后劲不足和发酵后期料液起泡逃液问题；该补料方法成本低，工艺简单易于推广，且易于在大规模生产上使用。
附图说明
图1所示为替考拉宁的结构式。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：替考拉宁在发酵过程中依照一定的速率流加乙酸钠溶液。
本发明的一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法，替考拉宁的发酵方式为补料分批发酵，所述补料分批发酵的补料方式为流加补料，流加物质为乙酸钠溶液，所述流加补料的时间为补料分批发酵的第一次对数生长期至发酵终止，流加补料过程中流加速率逐步下降。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明使用的补料物质是15％乙酸钠溶液，作为小分子其易被生物体吸收利用；在生物体内乙酸钠仅通过乙酰辅酶A合成途径即可活化生成乙酰辅酶A进入代谢流中，相较其他糖类物质省去了中间分解代谢环节；乙酰辅酶A是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽型物质，通过补加适量乙酸钠提高了生物体内乙酸辅酶A的含量，间接促进生物体内能源物质代谢；同时15％的乙酸钠pH约11.5左右，起到外源性碱的作用。本发明提供的补料方法，通过在替考拉宁发酵的第一次对数生长期至发酵终止阶段控制流加速率进行乙酸钠溶液的流加，显著提高了替考拉宁的发酵产量，可达4.8g/L，同时流加乙酸钠溶液相较于流加碳源不会引起的反馈抑制效应的发生，也不会出现发酵单位后劲不足和发酵后期料液起泡逃液问题；该补料方法成本低，工艺简单易于推广且易于在大规模生产上使用。
进一步的，所述乙酸钠溶液为15％的乙酸钠溶液。
进一步的，所述流加补料的时间为补料分批发酵的第20-102h。
进一步的，所述补料分批发酵的第一次对数生长期的流加速率为0.29mL/(h·L)；
所述补料分批发酵的第二次对数生长期的流加速率为0.23mL/(h·L)；
所述补料分批发酵的平衡生长期和发酵末期的流加速率为0.17mL/(h·L)。
进一步的，所述流加补料的过程中发酵液的pH为6.5-7.6。
实施例1：
一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法，具体包括以下步骤：
1)种子培养：将游动放线菌(Actinoplanesteichomyceticus)接种到种子培养基中，在30L试验罐进行培养，培养周期为50±16h，得到种子液；
种子培养基配方(以质量份计)：黄豆饼粉2.0份、酵母粉0.5份、蛋白胨0.5份、葡萄糖2.5份、淀粉2份、氯化钠0.4份、磷酸二氢钾0.02份、碳酸钙0.3份；
培养条件：温度28℃，通气量v:v＝1:1.5，罐压0.05Mpa，转速300rpm，初始pH值7.2；
2)发酵培养：将培养好的种子液按接种量6％接种到发酵培养基中，在50L试验罐进行培养，培养周期为90-102h；
发酵培养基配方(以质量份计)：淀粉3份、七水合硫酸镁0.45份、碳酸钙0.6份、氯化钠0.08份、蛋白胨0.1份、酵母粉1份、黄豆饼粉1.5份、缬氨酸0.1份；
培养条件：温度30℃，通气量v:v＝1:1.5-1:2.5，罐压0.04Mpa，转速300rpm，初始pH值7.2；
3)发酵培养至25-35h时(第一次对数生长期)，开始流加15％的乙酸钠溶液，流加速率为0.29mL/(h·L)，即0.52mmol/(h·L)；
发酵培养至35-55h时(第二次对数生长期)，流加速率改变为0.23mL/(h·L)，即0.42mmol/(h·L)；
发酵培养至55-96h时(平衡生长期+发酵末期)，流加速率改变为0.17mL，即0.31mmol/(h·L)；
其中，在流加补料的过程中发酵液的pH控制在6.5-7.6；
实施例1的平均罐批单位产量为4.85g/L。
实施例2：
实施例2与实施例1的区别在于：
发酵培养至20-30h时，开始流加15％的乙酸钠溶液，流加速率为0.29mL/(h·L)；
发酵培养至30-50h时，流加速率改变为0.23mL/(h·L)；
发酵培养至50-90h时，流加速率改变为0.17mL；
实施例2的平均罐批单位产量为4.89g/L。
实施例3：
实施例3与实施例1的区别在于：
发酵培养至30-40h时，开始流加15％的乙酸钠溶液，流加速率为0.29mL/(h·L)；
发酵培养至40-60h时，流加速率改变为0.23mL/(h·L)；
发酵培养至60-102h时，流加速率改变为0.17mL。
实施例3的平均罐批单位产量为4.83g/L。
对比例1：
对比例1与实施例1的区别在于，未进行流加发酵，对比例1的罐批单位产量为3.56g/L。
实验例：
设置对照组和实验组1-5，对照组中不添加乙酸钠进行补料，实验组1-5采用实施例1的方法在替考拉宁发酵过程中进行补料，控制补料过程中的pH，流加速率是通过控制发酵液pH来控制。具体pH范围和结果见表1所示。
表1
发酵液pH(20h～发酵终止) 罐批平均产量(g/L)
对照组 pH6.5～6.8 3.25
实验组1 pH6.5～7.2 4.22
实验组2 pH6.5～7.4 4.53
实验组3 pH6.5～7.6 4.85
实验组4 pH6.5～7.8 4.81
实验组5 pH6.5～8.0 4.69
从表1中可以看出，使用乙酸钠控制发酵液pH值，可显著影响替考拉宁的罐批平均产量。
综上所述，本发明提供的补料方法，通过在替考拉宁发酵的第一次对数生长期至发酵终止阶段控制流加速率进行乙酸钠溶液的流加，显著提高了替考拉宁的发酵产量，可达4.8g/L，同时流加乙酸钠溶液相较于流加碳源不会引起的反馈抑制效应的发生，也不会出现发酵单位后劲不足和发酵后期料液起泡逃液问题；该补料方法成本低，工艺简单易于推广且易于在大规模生产上使用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种提高替考拉宁发酵产量的补料方法，其特征在于，替考拉宁的发酵方式为补料分批发酵，所述补料分批发酵的补料方式为流加补料，流加物质为乙酸钠溶液，所述流加补料的时间为补料分批发酵的第一次对数生长期至发酵终止，流加补料过程中流加速率逐步下降；
所述补料分批发酵的第一次对数生长期的流加速率为0.29mL/(h·L)；所述补料分批发酵的第二次对数生长期的流加速率为0.23mL/(h·L)；所述补料分批发酵的平衡生长期和发酵末期的流加速率为0.17mL/(h·L)；
所述乙酸钠溶液为15％的乙酸钠溶液；
补料方法中使用的发酵菌种为游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)。
2.根据权利要求1所述的提高替考拉宁发酵产量的补料方法，其特征在于，所述流加补料的时间为补料分批发酵的第20-102h。
3.根据权利要求1所述的提高替考拉宁发酵产量的补料方法，其特征在于，所述流加补料的过程中发酵液的pH为6.5-7.6。
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