CN114134238B

CN114134238B - 与番鸭产蛋性状相关的ralgapa1基因snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN114134238B
Application number: CN202210023223.4A
Authority: CN
Inventors: 聂庆华; 张思雨; 徐海平; 郭利金; 徐翌斌; 吴瑞权
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114134238A

Abstract

本发明公开了一种与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记及其应用，属于生物技术领域，包括：SNP1、SNP2和/或SNP8；其中，包括：SNP1、SNP2和/或SNP8；其中，所述SNP1位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35658560位点，等位基因为T＞G；所述SNP2位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35658263位点，等位基因为G＞T；所述SNP8位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35656935位点，等位基因为G>A；本发明可以准确鉴定不同周龄的番鸭产蛋性状，为分子标记辅助选择育种提供新的分子标记。

Description

与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记及其应用。

背景技术

番鸭以适应性强，繁殖力强，产肉量高著称，原产于中南美洲热带地区，适宜中国南方地区养殖。番鸭适合香芋焖鸭、香焖番鸭、笋干焖番鸭、四物番鸭汤、盐焗番鸭、茶树菇番鸭汤和姜母鸭等许多中式做法，在华南地区具有较好的市场前景。国内虽已开展番鸭的规模化养殖，但番鸭的育种进展落后，尤其是繁殖性能，严重制约了生产力的提高。繁殖性状遗传力低，基于性状的选择育种很难取得大的进展。

卵巢是雌性的生殖器官，与产蛋特性密切相关，家禽的卵巢功能直接影响产蛋量。卵泡发育过程复杂，与多种内分泌、自分泌和旁分泌因子有关。卵巢中原始卵泡的数量是固定的，卵泡的静止、存活和激活取决于动态平衡的过程。TGF-β、FGFs、IGFs、DRD2、FSHR、GnRH、STAR和PRLR被证实与家禽的卵巢功能有关，影响产蛋量。

RALGAPA1基因不仅与免疫有关，其表达水平还与生育的持续时间有关。分子标记辅助选择能够加速育种进展，常用的分子标记有RFLP、RAPD、SSR和AFLP等，但是，这些分子标记使用时需要凝胶电泳检测，速度慢，还会造成污染。SNP是一种单核苷酸多态性，包括基因组碱基的***、缺失、突变等，可利用Sanger测序精确检测。Sanger测序不仅价格低，准确性高，而且借助现代化设备，能够实现规模化检测。以此，利用Sanger测序检测RALGAPA1基因的SNP，并将其与产蛋性状关联，用作分子标记辅助选择育种的分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现番鸭RALGAPA1基因内含子区存在多个SNP位点，并将其与番鸭的产蛋性状关联分析，为MAS提供新的SNP分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记，包括：SNP1、SNP2和/或SNP8；其中，所述SNP1位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35658560位点，等位基因为T＞G；所述SNP2位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35658263位点，等位基因为G＞T；所述SNP8位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35656935位点，等位基因为G>A。

本发明还提供一种上述的与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记的检测试剂在检测番鸭产蛋性状中的应用。

本发明还提供一种扩增上述的与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记的引物，包括如SEQ ID No.3-6所示序列的引物。

本发明还提供一种上述的引物在鉴别番鸭的产蛋性状或制备鉴别番鸭的产蛋性状的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种用于鉴别番鸭产蛋性状的试剂盒，包括上述的引物。

本发明还提供一种鉴别番鸭产蛋性状的方法，鉴别待测样本番鸭中如上述的分子标记的基因型。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测样本番鸭的基因组DNA；

(2)利用上述的引物进行PCR扩增，获取扩增引物；

(3)将所述扩增产物经测序后，获取分子标记的基因型；

(4)根据基因分型结果，判断所述待测样本番鸭的产蛋性状。

进一步地，在步骤(2)中，所述PCR扩增的扩增体系包括：2xTaq MasterMix 15μL、混合引物各1.2μL、超纯水10.6μL和DNA2μL；

所述PCR扩增的反应程序为：94℃2min，94℃30s、53℃30s、72℃30s，30cycles，72℃2min。

本发明还提供一种上述的与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记、上述的引物、上述的试剂盒在番鸭育种中的应用。

本发明还提供一种与番鸭产蛋性状相关的单倍型块集合，包括单倍型块1和/或单倍型块2；

其中，所述单倍型块1由SNP1(T35658560G)、SNP2(G35658263A)和SNP3(T35658203A)组成，包括单倍型频率大于0.01的有H11(TGT)、H12(AGT)和H13(ATG)，有H11H11、H11H12、H11H13、H12H12和H12H13共5种单倍型块组合；

所述单倍型块2由SNP3(T35658203A)、SNP4(T35658202C)、SNP5(A35658060T)、SNP6(C35657186T)、SNP7(G35657058C)、SNP8(G35656935A)、SNP9(A35656927G)、SNP10(C35656736T)、SNP11(A35656608G)和SNP12(A35656564C)组成，包括单倍型频率大于0.01的有H21(CGCAGGTATT)、H22(CGCGGGTTTA)、H23(AATGGCCTCA)、和H24(AATGACCTCA)，有H21H21、H21H22、H21H23、H21H24、H22H23和H23H24共6种单倍型块组合。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过分析RALGAPA1基因，发现该基因存在多个与番鸭产蛋性状显著相关的SNP位点，为MAS提供新的SNP分子标记，并且通过试验验证，SNP1、SNP2和SNP8与产蛋性状关联。SNP1与该群体番鸭48-57周龄产蛋量、总产蛋量和合格产蛋量相关性显著(P<0.05)，相较于GG和TG基因型，该位点TT基因型的产蛋量更高。SNP2与43-57周龄产蛋量、总产蛋量、合格产蛋量和300日龄产蛋量显著相关(P<0.05)，该位点GG基因型产蛋优势明显。SNP8与29-40周龄产蛋量以及开产日龄显著相关(P<0.05)，GA杂合基因型有产蛋优势。其他SNP位点与产蛋性状关联性未达到显著水平(P＞0.05)。并且，SNP1、SNP2和SNP3可作为组合，SNP3-SNP12可作为一个组合。SNP1、SNP5、SNP7和SNP8还可作为单倍型块1和单倍型块2的优化Tagger，用于单倍型块的选择。可见，本发明提供的分子标记可以准确的鉴定番鸭不同周龄的产蛋性能，以为番鸭的选育提供科学数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为SNP1-SNP12不同基因型测序峰图；

图2为SNP组合单倍型块，A.单倍型块1，B.单倍型块2。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例

1材料与方法

1.1动物样品

选取382只60周龄的雌性白番鸭(广东温氏南方家禽育种有限公司仁马种鸭场)。采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。记录选择群体的家系信息和开产日龄、每日产蛋量、总产蛋数以及产蛋合格数等繁殖性状。

1.2主要仪器

BIO-RAD T100 PCR仪(品牌：BIO-RAD；货号：1861096；美国伯乐)、北京六一DYCP-31DN核酸电泳仪(品牌：北京六一；货号：413-1402；北京六一生物科技有限公司)。

1.3主要试剂

动物基因组DNA提取试剂盒(品牌：擎科；货号：TSP201-50；北京擎科生物科技有限公司)、2xTaq MasterMix(含染料)(品牌：康为世纪；货号：CW0682；江苏康为世纪生物科技股份有限公司)、DNA marker(品牌：诺维赞；货号：MD101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：TSJ001；北京擎科生物科技有限公司)。

2实验方法

2.1引物设计

根据Ensembl公布的番鸭(家养型)基因组(GCA_009194515.1)RALGAPA1基因(ENSCMMG00000005936)，使用NCBI(National Center for Biotechnology InformationSearch database)的Primer-BLAST工具设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示。

表1 PCR扩增引物序列

2.2血液基因组DNA提取

参照动物基因组DNA提取试剂盒操作手册提取血液基因组DNA。

2.3催乳素基因外显子序列的PCR扩增

以上述382只白番鸭半同胞个体的血液基因组DNA为模板配制PCR扩增反应体系(表2)。反应程序如表3所示。反应完成后，由广州天一辉远基因科技有限公司提供Sanger测序服务。

表2反应体系

表2反应程序

2.4SNPs确定与基因分型

随机从382只番鸭中抽取30只番鸭的基因组DNA作为检测SNP位置的模板。利用SnapGene 4.3.6软件对PCR扩增产物的Sanger测序结果进行比对处理，通过碱基峰图进行基因分型。

2.5基因型与繁殖性状的关联分析

利用SAS 9.4软件的GLM程序进行关联分析。模型为：

Y_ijlkhno＝μ+G_i+M_j+B_l+GM_k+GB_h+MB_n+GMB_O+e_ijlkhno

Y_ijlkhno表示表型值，μ表示均值，G_i表示基因型效应，M_j表示母性效应，GM_k表示基因型与母性的互作效应，GB_h表示基因型与母性的互作效应，MB_n表示基因型与母性的互作效应，GMB_o表示基因型与母性的互作效应，e_ijlkhno表示残差。

使用Plink 1.9软件进行哈迪温伯格平衡(HWE)计算分析，使用Haploview 4.6和Phase 2.1软件进行单倍分析。

3结果

3.1RALGAPA1基因的扩增及SNP筛选

利用表1中引物进行PCR扩增，分别得到798bp(SEQ ID No.1)和917bp(SEQ IDNo.2)的PCR产物，位于RALGAPA1基因的外显子14、内含子14、外显子15、内含子15和外显子16区域。通过软件分析共得到12个SNP位点：SNP1(T35658560G)、SNP2(G35658263A)、SNP3(T35658203A)、SNP4(T35658202C)、SNP5(A35658060T)、SNP6(C35657186T)、SNP7(G35657058C)、SNP8(G35656935A)、SNP9(A35656927G)、SNP10(C35656736T)、SNP11(A35656608G)、SNP12(A35656564C)。这些SNP皆位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域(图1，表4)，符合哈迪温伯格平衡(表5)。

SEQ ID No.1(RALGAPA1-SNP-F1/R1产物序列)：

SEQ ID No.1(RALGAPA1-SNP-F2/R2产物序列)：

表4 SNP基本信息

表5哈迪温伯格平衡

3.2SNP位点与繁殖性状的关联性

通过GLM线性分析，SNP1、SNP2和SNP8与产蛋性状关联(表6-8)。SNP1与该群体番鸭48-57周龄产蛋量、总产蛋量和合格产蛋量相关性显著(P<0.05)，相较于GG和TG基因型，该位点TT基因型的产蛋量更高。SNP2与43-57周龄产蛋量、总产蛋量、合格产蛋量和300日龄产蛋量显著相关(P<0.05)，该位点GG基因型产蛋优势明显。SNP8与29-40周龄产蛋量以及开产日龄显著相关(P<0.05)，GA杂合基因型有产蛋优势。

表3 SNP1关联信息

注：±.表示自由度＝0，无标准误值。

表4 SNP2关联信息

表5 SNP8关联信息

3.3单倍型与产蛋性状关联性

SNP1-SNP3可组成一个单倍型块，称作单倍型块1，SNP3-SNP12组成一个单倍型块，称作单倍型块2(表9)。单倍型块1中单倍型频率大于0.01的有H11(TGT)、H12(AGT)和H13(ATG)，共有H11H11、H11H12、H11H13、H12H12和H12H13共5种单倍型块组合。单倍型块2中单倍型频率大于0.01的有H21(CGCAGGTATT)、H22(CGCGGGTTTA)、H23(AATGGCCTCA)、和H24(AATGACCTCA)，共有H21H21、H21H22、H21H23、H21H24、H22H23和H23H24共6种单倍型块组合(图2)。通过与繁殖性状的关联分析(表10)，单倍型块1与49周龄产蛋量显著相关(P<0.05)，单倍型块2与48、49、53、54周龄产蛋量和总产蛋量显著相关(P<0.05)。单倍型块1和单倍型块2随着番鸭日龄的增大，其与番鸭产蛋量关联性逐渐增强。

表6单倍型分布及频率

表7单倍型块关联情况

4讨论

SNP1、SNP2和SNP8皆与繁殖性状的显著相关，用于番鸭繁殖性状的选育，SNP1、SNP2和SNP3可作为组合，SNP3-SNP12可作为一个组合。SNP1、SNP5、SNP7和SNP8还可作为单倍型块1和单倍型块2的优化Tagger(表11)，用于单倍型块的选择。

表8单倍型块Tagger

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtgctacac cttcctcagt aatgagaatt tagagtgtca taattgctcc aatgaatttg 60

catgcttttt tactctcaag cttcagtaaa tatctgcctt tttcattcaa tgttcatctt 120

cttgacattc ttcttttcct tttttccttc ttcctcttgc aaggatattg tcaatacaat 180

catcaagcac tgctctcctc agttcttttc acttggtttg cctggtgcca ccatgcttat 240

tatggatttc attgtggcag caggaagagt ggcagcttct tcttttctca atgtaagtgc 300

tcatcagatc attctcattt atgggcaaat aggaaggata tgagagaaaa ctgagcaata 360

tttttccttg ggttcatttg tctccagacg tcagtgtaac agttagaaaa cacaggtact 420

gtcagtgctt tactccagaa cactacacgt gcaaatcctc tacagaaaat gtaatgtgaa 480

gaatacaaaa attactgttg aaacagtatt ttgggagtcc taggatttat gacagcttta 540

aaatgtttta aaataaatgt ccatttagat tgtaatttca ttttagaagt atgtatgtat 600

gtgtacatag atatatttgt atactgggtg tgtatgcata tacagatata tatctatatc 660

tagtatacac acatatatac agtatataca aatatatcta tatacacact gcaatgactt 720

tcatactctg gctcaagaac ttatgttatc tgatagtgtt ggccttttca gatgtttctc 780

tgatattgtt acccaggc 798

<210> 2

<211> 917

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggcaccaag agttgaagca caagttcttt taggatctct tgtctgtttt cccaatttat 60

atcatgaact accagctctt cacccaaaca ttccagacat tgctgtgtct cagtttacag 120

atgttaaggt aggaaattaa gtatatgtgg atagtattca accaccaagt gtatttaata 180

tgatgatgtc cgatgaaata ttaactacaa ttataagatt ctaaattttt tcacgagtca 240

tttcaaatag attataaggc ttaagactac aaaaaaatct tgtaaaactt tatacttcta 300

aacatactga ccgtttagtt gagcttcatt gagagggaca gttgagtcag aattcttcct 360

gacattgttc ttaaggcact gtaatcattt cttctgcaga tatttccaaa gactttttta 420

attaatataa tttttattgg gaagaatatg aatgtttaat acctacctca aagtaaccag 480

taggtatttt gtgtaatatc cttcttggct attcacagaa gctagcttta agggagatca 540

tttttttgtt tgtctgtttt gtttgatttt tttcccccca tgatacatta tgaaaatatg 600

ttggatgaac agttaattag cagaaattag gacagtaacc tgtggaatat tcttggggta 660

gcacaataat gagcatttgg gacagatgag aagcttggag tagaagcaag caaacagttt 720

gtctgaccat aactctagag tctcagctaa gctacatgtc tgtgtgtact ataaattcta 780

attttttaag atttcatgtg acagagattt catgtggcaa atcagtgagt attttcatct 840

ttgttttagg agctcataat taaaactgtg ttaagctcag caagagagga accgtctggt 900

cctgcacggt aggtcat 917

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtgctacac cttcctcagt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcctaggta acaatatcag a 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctctgatat tgttacccag gc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacctacc gtgcaggacc 20

Claims

1.一种与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记的检测试剂在检测番鸭产蛋性状中的应用，其中，所述与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记，包括：SNP1、SNP2和SNP8；其中，所述SNP1位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35658560位点，等位基因为T＞G；所述SNP2位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35658263位点，等位基因为G＞T；所述SNP8位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35656935位点，等位基因为G>A。

2.一种引物在鉴别番鸭的产蛋性状或制备鉴别番鸭的产蛋性状的试剂盒中的应用，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3-6所示，所述引物用于扩增权利要求1中所述的与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记。

3.一种鉴别番鸭产蛋性状的方法，其特征在于，鉴别待测样本番鸭中如权利要求1中所述的分子标记的基因型。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样本番鸭的基因组DNA；

（2）利用权利要求2中所述的引物进行PCR扩增，获取扩增引物；

（3）将所述扩增产物经测序后，获取分子标记的基因型；

（4）根据基因分型结果，判断所述待测样本番鸭的产蛋性状。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述PCR扩增的扩增体系包括：2xTaq MasterMix 15μL、混合引物各1.2μL、超纯水10.6μL和DNA2μL；

所述PCR扩增的反应程序为：94℃ 2min，94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s，30cycles，72℃ 2min。

6.一种与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记、引物在番鸭育种中的应用，其中，所述与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记，包括：SNP1、SNP2和SNP8；其中，所述SNP1位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35658560位点，等位基因为T＞G；所述SNP2位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35658263位点，等位基因为G＞T；所述SNP8位于5号染色体RALGAPA1基因内含子区域35656935位点，等位基因为G>A；

所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3-6所示，所述引物用于扩增所述与番鸭产蛋性状相关的RALGAPA1基因SNP分子标记。