CN112176072A - 一种检测肉牛肌内脂肪含量的试剂、引物、试剂盒和应用 - Google Patents

一种检测肉牛肌内脂肪含量的试剂、引物、试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测肉牛肌内脂肪含量的试剂、引物、试剂盒和应用，属于草原红牛分子育种技术领域。本发明提供了检测HTR2A基因单倍型的试剂在检测肉牛肌内脂肪含量中的应用。本发明所述应用可为草原红牛肉质改良和有效遗传标记基因的筛选提供参考，最终为促进从根本上提高牛肉品质，改善脂肪组成，生产高档牛肉提供依据。

Description

一种检测肉牛肌内脂肪含量的试剂、引物、试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及草原红牛分子育种技术领域，具体涉及一种检测肉牛肌内脂肪含量的试剂、引物、试剂盒和应用。
背景技术
草原红牛是中国培育出来的肉乳兼用型品种，具有适应能力强、适宜放牧、耐粗饲、肉质好等优点。
肌内脂肪含量是影响草原红牛肉质的重要因素，是衡量优质牛肉的重要指标，肌内脂肪含量高的个体，大理石花纹更明显或者可以形成雪花肉，味美多汁、口感良好；如果肌内脂肪含量过少，则肉质干硬、乏味。
目前牛肉肌内脂肪含量主要是使用脂肪测定仪进行测定分析，均需要屠宰以后才能进行评价，生长过程中很难预判。超声波检测也是一种活体检测肉牛肌内脂肪含量的方法，但需要牛生长到一定月龄才能检测，而且准确性不高。目前并没有一种利用分子遗传学的方法，通过遗传连锁关系判断牛肌内脂肪高低的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测肉牛肌内脂肪含量的试剂、引物、试剂盒和应用。本发明所述应用在牛出生时即可通过单倍型组合的检测来进行判断是否可以生产高肌内脂肪含量的牛肉，避免盲目育肥，节约饲养成本，可为草原红牛肉质改良和有效遗传标记基因的筛选提供参考，最终为促进从根本上提高牛肉品质，改善脂肪组成，生产高档牛肉提供依据。
本发明提供了检测HTR2A基因单倍型的试剂在检测肉牛肌内脂肪含量中的应用。
优选的是，所述检测HTR2A基因单倍型的位点位于HTR2A基因外显子3上。
优选的是，所述检测HTR2A基因单倍型的位点为HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处。
本发明还提供了一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的试剂，所述试剂用于检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点。
本发明还提供了一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点的试剂。
本发明还提供了一种检测肉牛肌内脂肪含量的方法，包括以下步骤：检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点，分析单倍型，与肉牛肌内脂肪含量呈正相关的单倍型组合为H2H3；所述H2H3中，H2指一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为A，H3指另一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为G。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的选育高肌内脂肪含量肉牛的方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述引物，对待测样品进行PCR扩增，得到PCR产物；
将PCR产物直接进行Sanger测序，统计单倍型组合，单倍型组合为H2H3的肉牛肌内脂肪含量更高；所述H2H3中，H2指一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为A，H3指另一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为G。
优选的是，所述扩增时每20μL反应体系包括2×Master Mix 10μL，引物各0.5μL，待测样品1μL和余量的ddH2O。
优选的是，所述扩增的反应条件为：95℃2min；95℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；最后温度降到4℃。
本发明提供了检测HTR2A基因单倍型的试剂在检测肉牛肌内脂肪含量中的应用。本发明以草原红牛DNA为模板，通过PCR测序技术检测HTR2A基因的多态性及单倍型组成，再通过单因素方差分析该单倍型与肉质性状的相关性，最终研究出了检测HTR2A基因单倍型的试剂在检测肉牛肌内脂肪含量中的应用。本发明证实了草原红牛HTR2A基因单倍型H2H3与肉质性状中的肌内脂肪含量存在显著正相关，并且提供了一种与高肌内脂肪含量相关的牛HTR2A基因单倍型，利用本发明所提供的方法可以通过对牛HTR2A基因单倍型判断获得肉牛肌内脂肪含量的高低，从而为肉牛的育肥工作提供指导，选育具有高肌内脂肪含量的H2H3单倍型肉牛个体进行育种和培养，为草原红牛肉质改良和有效遗传标记基因的筛选提供参考，最终为促进从根本上提高牛肉品质，改善脂肪组成，生产高档牛肉提供依据。试验结果表明，本发明检测发现HTR2A基因5个外显子中的第3外显子存在两个SNP，且为强连锁，二者可组成不同的单倍型；与肉质性能的连锁分析发现，单倍型H2H3与肌内脂肪含量有明显的正相关，是调控草原红牛肌内脂肪含量的关键单倍型；本发明研究出一种与草原红牛肌内脂肪含量相关的牛HTR2A基因单倍型，即HTR2A基因单倍型H2H3可作为高肌内脂肪含量的判断标准，单倍型H1H2的肌内脂肪含量为2.79％±1.13％，单倍型H1H3的肌内脂肪含量为2.87％±1.20％，单倍型H2H3的肌内脂肪含量为4.75％±0.12％，单倍型H3H3的肌内脂肪含量为1.52％±0.15％。结果显示，HTR2A基因单倍型H2H3与肌内脂肪性状存在显著性差异(P<0.05)。
附图说明
图1为本发明提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2为本发明提供的HTR2A基因第3外显子突变测序比对结果，其中，A为HTR2A基因第3外显子g.C86G突变测序比对结果，B为HTR2A基因第3外显子g.G164A突变测序比对结果。
具体实施方式
本发明提供了检测HTR2A基因单倍型的试剂在检测肉牛肌内脂肪含量中的应用。本发明依据多态性进行肉牛肌内脂肪含量的判定。在前期实验中，本发明以草原红牛群体为研究对象，测定了肌内脂肪含量等肉质性状，对HTR2A(NCBI登录号：NC_037339.1)基因设计引物，并进行PCR扩增，PCR扩增产物胶回收后于金唯智生物有限公司Sanger测序平台进行测序和NCBI-Blast筛选SNPs，结果在HTR2A基因外显子3第86bp处和164bp处发现C-G突变和G-A突变。在本发明中，所述检测HTR2A基因单倍型的位点位于HTR2A基因外显子3上。在本发明中，所述HTR2A基因的原始核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：acaacagcctgagttcacaacacaccagcatgattctagctataagttttcaaatcttgcattcaaccagagcagtcttactctacttcagtacagttgacatcaggctcctctgaagtactgaaagtatcttgtgttgccctttgctgttaactgtgccttttcccaggatgaaaactatccaagcagggtaaatttcatacgccagagaagctccaggtcattcactaatgctaaccttctgcatcccagggtaccggtggcctctgcccagcaagctctgcgctgtttggatttacctggatgtgctcttctccacggcctccatcatgcatctctgtgctatctccctggaccgctatgttgccattcagaaccccatccatcacagccggttcaactccagaactaaggcgtttctgaaaataattgctgtttggacgatatcagtgggtaagtggaacagtat，若发生突变，HTR2A基因外显子3第86bp处的C突变为G，第164bp处的G突变为A。本发明是在第3外显子检测到了2个SNP位点S1、S2，S1位点在HTR2A基因第3外显子编码区86bp存在C>G突变，形成3种基因型：CC、GG和CG，存在2种等位基因：C和G；S2位点在HTR2A基因第3外显子编码区164bp存在G>A突变，形成3种基因型：GG、AA和GA，存在2种等位基因：A和G。利用HaploView软件进行单倍型分析，分析发现S1、S2位点间D’＝0.794、r2＝0.350，属于强连锁。两个位点(S1、S2)共形成4种单倍型H1(CG)、H2(GA)、H3(GG)、H4(CA)，单倍型频率分别为0.570、0.234、0.163、0.033。
在本发明中，所述检测HTR2A基因单倍型的位点为HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处。本发明优选以上述两个SNP位点上下游序列为模板设计基因分型引物(F和R)，利用PCR测序的方法进行基因分型，利用HaploView软件进行单倍型分析。利用SPSS22.0统计软件对不同基因型所对应的肌内脂肪含量进行差异显著性检验。
本发明还提供了一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的试剂，所述试剂用于检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点。
本发明还提供了一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述引物能够用于一次性检测组成单倍型的两个突变位点。本发明所述上游引物(F)的核苷酸序列为：5'-ACAACAGCCTGAGTTCACA-3'(SEQ ID NO.1)；所述下游引物(R)的核苷酸序列为：5'-ATACTGTTCCACTTACCCACT-3'(SEQ ID NO.2)。
本发明还提供了一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点的试剂。
本发明还提供了一种检测肉牛肌内脂肪含量的方法，包括以下步骤：检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点，分析单倍型，与肉牛肌内脂肪含量呈正相关的单倍型组合为H2H3；所述H2H3中，H2指一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为A，H3指另一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为G。本发明发现了草原红牛HTR2A基因H2H3单倍型与肉质性状中的肌内脂肪存在显著正相关。本发明结果可为草原红牛肉质改良和有效遗传标记基因的筛选提供参考依据。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的选育高肌内脂肪含量肉牛的方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述引物，对待测样品进行PCR扩增，得到PCR产物；
将PCR产物直接进行Sanger测序，统计单倍型组合，单倍型组合为H2H3的肉牛肌内脂肪含量更高；所述H2H3中，H2指一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为A，H3指另一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为G。本发明通过利用上述技术方案所述特异性引物对草原红牛HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的基因型进行检测，选择高肌内脂肪含量性状相关性的H2H3基因单倍型草原红牛个体进行培育。
在本发明中，所述PCR产物的大小为469bp，本发明优选对所述PCR产物送去测序公司进行Sanger测序。PCR扩增反应结束后，本发明优选利用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，检测时间约30min，检测后，本发明优选进行切胶回收。测序后，本发明优选利用DNAMAN软件对测序的结果进行分析，寻找SNP位点，利用HaploView软件进行单倍型分析。
在本发明中，所述扩增时每20μL反应体系包括2×Master Mix 10μL，引物各0.5μL，待测样品1μL和余量的ddH2O。
在本发明中，所述扩增的反应条件为：95℃2min；95℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；最后温度降到4℃。
在本发明中，所述待测样品优选为肉牛基因组DNA，本发明优选提取肉牛样品的基因组DNA后，将基因组于-20℃条件下保存。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种检测肉牛肌内脂肪含量的试剂、引物、试剂盒和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.材料与方法
1)试验动物
随机选取30月龄肉用草原红牛58头，进行屠宰测定肉质性状。采集背最长肌组织，－80℃保存备用，后期采用试剂盒法提取DNA。
2)主要仪器及试剂
超微量分光光度计(Quawell-Q500)、气相色谱仪(GC-14CPTF)、高效液相色谱仪(WATERS 600)、PCR仪(T100)、色差计(X-RiteSP62)、基因组DNA提取试剂盒等均购自大连宝生物工程有限公司。
3)肉质性状测定
根据我国肉牛屠宰试验暂行标准进行肉质性状的测定，主要包括熟肉率、嫩度、失水率、滴水损失、肌内脂肪含量、大理石花纹。
4)基因组DNA提取
按照基因组DNA提取试剂盒进行提取，并采用超微量分光光度计测定DNA的纯度和浓度，并取5μl进行琼脂糖凝胶电泳的检测并保证其完整性。
5)引物设计及合成
根据GenBank发表的肉牛HTR2A基因DNA序列(登录号：NC_037339.1)，通过Ensembl查找基因外显子，用Primer 5.0设计引物，引物信息见表1。引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1基因引物序列
Figure BDA0002710164270000071
6)PCR反应体系及条件
PCR反应体系(20μl)：2×Taq Master Mix10μl，ddH2O 8μl，DNA 1μl，上、下游引物各0.5μl。
PCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，退火温度(见表1)30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸5min，产物4℃保存。
7)草原红牛HTR2A基因多态性检测及单倍型分析
对58头草原红牛DNA样品进行PCR扩增，每个样品去5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(图1，琼脂糖凝胶电泳检测结果)，并将鉴定完成的产物送去苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序。利用DNAMAN软件对测序的结果进行分析，寻找SNP位点。用Chromas软件对测序波峰图分析。利用HaploView软件进行单倍型分析。
8)数据统计分析
利用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析不同单倍型与草原红牛肉用性状相关性及显著性差异。结果以平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。
2.结果
1)PCR测序结果
第3外显子检测到了2个SNP位点S1、S2。图2为HTR2A基因第3外显子突变测序比对结果。对比测序结果与参考序列(Genbank:NC_037339.1)发现：S1位点在HTR2A基因第3外显子编码区86bp处存在C>G突变(图2中的A为HTR2A基因第3外显子g.C86G突变测序比对结果)，形成3种基因型：CC、GG和CG，存在2种等位基因：C和G。S2位点在HTR2A基因第3外显子编码区164bp处存在G>A突变(图2中的B为HTR2A基因第3外显子g.G164A突变测序比对结果)，形成3种基因型：GG、AA和GA，存在2种等位基因：A和G。
2)单倍型分析
对检测到的2个SNPs位点进行连锁不平衡分析。分析发现S1、S2位点间D’＝0.794、r2＝0.350，属于强连锁。两个位点(S1、S2)共形成4种单倍型H1(CG)、H2(GA)、H3(GG)、H4(CA)，单倍型频率分别为0.570、0.234、0.163、0.033。
3)HTR2A基因不同单倍型与肌内脂肪含量的相关性分析
利用SPSS Statistis one-way ANOVA的分析方法，探究HTR2A基因不同单倍型与肌内脂肪性状的相关性。结果表明，HTR2A基因单倍型H2H3与肌内脂肪性状存在显著性差异(P<0.05)，为正相关。HTR2A基因单倍型H2H3为高肌内脂肪含量的判断标准，若想培育高肌内脂肪含量的肉牛，可以考虑选择带有H2H3基因型的个体。
表2 HTR2A基因不同单倍型与肌内脂肪含量性状的相关性分析
Figure BDA0002710164270000081
注：不同小写字母间表示差异显著(p<0.05)，不同大写字母间表示差异极显著(p<0.01)；其它单倍型出现概率低，达不到统计要求，所以没有进行统计。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一种检测肉牛肌内脂肪含量的试剂、引物、试剂盒和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaacagcct gagttcaca 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atactgttcc acttacccac t 21
<210> 3
<211> 469
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaacagcct gagttcacaa cacaccagca tgattctagc tataagtttt caaatcttgc 60
attcaaccag agcagtctta ctctacttca gtacagttga catcaggctc ctctgaagta 120
ctgaaagtat cttgtgttgc cctttgctgt taactgtgcc ttttcccagg atgaaaacta 180
tccaagcagg gtaaatttca tacgccagag aagctccagg tcattcacta atgctaacct 240
tctgcatccc agggtaccgg tggcctctgc ccagcaagct ctgcgctgtt tggatttacc 300
tggatgtgct cttctccacg gcctccatca tgcatctctg tgctatctcc ctggaccgct 360
atgttgccat tcagaacccc atccatcaca gccggttcaa ctccagaact aaggcgtttc 420
tgaaaataat tgctgtttgg acgatatcag tgggtaagtg gaacagtat 469

Claims (10)

1.检测HTR2A基因单倍型的试剂在检测肉牛肌内脂肪含量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测HTR2A基因单倍型的位点位于HTR2A基因外显子3上。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测HTR2A基因单倍型的位点为HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处。
4.一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的试剂，其特征在于，所述试剂用于检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点。
5.一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种用于检测肉牛肌内脂肪含量的检测HTR2A基因单倍型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点的试剂。
7.一种检测肉牛肌内脂肪含量的方法，包括以下步骤：检测HTR2A基因外显子3的第86bp处和第164bp处的突变位点，分析单倍型，与肉牛肌内脂肪含量呈正相关的单倍型组合为H2H3；所述H2H3中，H2指一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为A，H3指另一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为G。
8.一种基于权利要求5所述引物的选育高肌内脂肪含量肉牛的方法，包括以下步骤：
利用权利要求5所述引物，对待测样品进行PCR扩增，得到PCR产物；
将PCR产物直接进行Sanger测序，统计单倍型组合，单倍型组合为H2H3的肉牛肌内脂肪含量更高；所述H2H3中，H2指一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为A，H3指另一条染色体上HTR2A基因外显子3的第86bp处为G，第164bp处为G。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增时每20μL反应体系包括2×MasterMix 10μL，引物各0.5μL，待测样品1μL和余量的ddH2O。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应条件为：95℃2min；95℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；最后温度降到4℃。
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