CN114622020B - 一种与鸡生长性状相关的klhl31基因分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与鸡生长性状相关的KLHL31基因分子标记及应用，涉及生物技术领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述分子标记存在两个SNP位点，SNP1为NC_052534.1:g.87828628G>C，SNP2为NC_052534.1:g.87828969C>T。本发明通过分析KLHL31基因，发现该基因扩增片段区域有多个与鸡生长性状显著相关的SNP位点，并且通过试验验证，SNP1位点与91日龄体重存在显著相关(p<0.05)；SNP2位点与77日龄体重和84日龄体重均存在显著相关(p<0.05)。

Description

一种与鸡生长性状相关的KLHL31基因分子标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种与鸡生长性状相关的KLHL31基因分子标记及应用。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸***、缺失、颠换和转换等变异而引起的DNA序列的多态性。SNP是动物可遗传变异中最常见的一种，在动物基因组中广泛存在，具有稳定遗传，易于检测等特性。在动物生产实践中，SNP可用于分子标记辅助选择(Molecular Mark-assist Selection,MAS)，提高选种准确性和选育效果。找到与性成熟相关的有效的分子标记，可以为鸡的性生长性状的分子标记辅助选择育种提供有利的技术支撑。

KLHL31(Kelch like family member 31)是脊椎动物中Kelch样家族的成员，其编码的蛋白质含有保守的BTB结构域和串连重复的Kelch结构域。

发明内容

本发明的目的是提供一种与鸡生长性状相关的KLHL31基因分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现KLHL31基因扩增片段的SNP位点，并将其与鸡生长性状关联分析，为分子标记辅助选择提供新的SNP分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与鸡生长性状相关的KLHL31基因分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述分子标记存在两个SNP位点，SNP1为NC_052534.1:g.87828628 G>C，SNP2为NC_052534.1:g.87828969 C>T。

进一步地，所述SNP1的基因型包括GG、GC和CC；所述SNP2的基因型包括CC、CT和TT。

本发明还提供一种鉴别鸡生长性状的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2-3所示。

本发明还提供一种利用上述的分子标记鉴别鸡生长性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测鸡基因组DNA，利用上述的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；

(2)对所述扩增产物测序，检测SNP1位点的基因型，当SNP1位点的基因型为GG时，则91日龄体重大；检测SNP2位点的基因型，当SNP2位点的基因型为CC时，则77日龄体重和84日龄体重大。

进一步地，在步骤(1)中，所述PCR扩增的引物对序列为SEQ ID NO:2-3所示序列。

进一步地，在步骤(1)中，扩增体系为：模板DNA 2μL、2×Rapid Taq Master Mix25μL、上游引物2μL、下游引物2μL、ddH₂O 19μL。

进一步地，在步骤(1)中，扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃彻底延伸3min；4℃保存。

本发明还提供一种鉴别鸡生长性状的试剂盒，包含上述的引物对。

本发明还提供上述的与鸡生长性状相关的KLHL31基因分子标记、引物对或试剂盒在鸡遗传育种中的应用。

进一步地，所述鸡遗传育种为选育生长速度快的鸡品种。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过分析KLHL31基因，发现该基因扩增片段区域有多个与鸡生长性状显著相关的SNP位点，为分子标记辅助选择提供新的SNP分子标记，并且通过试验验证，该分子标记NC_052534.1:g.87828628 G>C位点与91日龄体重存在显著相关(p<0.05)，其中GG纯合基因型个体的91日龄体重显著大于GC杂合基因型个体(p<0.05)，而CC纯合基因型个体与GG纯合基因型个体和GC杂合基因型个体间无显著差异(p>0.05)；NC_052534.1:g.87828969 C>T位点与77日龄体重和84日龄体重均存在显著相关(p<0.05)，其中CC纯合基因型个体的77日龄体重和84日龄体重均显著大于TT纯合基因型(p<0.05)，而CT杂合基因型个体与CC纯合基因型个体和TT纯合基因型间均无显著差异(p>0.05)。其他SNP位点与鸡生长性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。可见，本申请提供的分子标记可以准确的鉴定鸡生长性状，以为鸡的选育提供科学数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为KLHL31引物配对位置及产物长度示意图；

图2为KLHL31基因扩增片段区域SNP位点基因型分型图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1材料与方法

1.1动物样品

选取328只300日龄的雌性宁都三黄鸡。采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。同时记录选择群体的家系信息和生长性状。

1.2主要试剂

血样DNA提取试剂盒(品牌：OMEGA；货号：D3392；广州飞扬生物工程有限公司)、2×Rapid Taq Master Mix(品牌：诺维赞；货号：P222-01；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、DNA marker(品牌：诺维赞；货号：MD101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：TSJ001；北京擎科生物科技有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1引物设计

根据NCBI(National Center for Biotechnology Information Searchdatabase)公布的红色原鸡(Gallus)KLHL31基因的序列(GeneID:421893)，使用NCBI的Primer-BLAST工具设计引物，由广州天一辉远基因科技有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示，引物在KLHL31基因上的配对位置如图1所示。

表1 PCR扩增引物序列

1.3.2血样DNA提取

参照血样DNA提取试剂盒操作手册提取血样DNA。

1.3.3 KLHL31基因外显子序列的PCR扩增

以上述328个个体的血样基因组DNA作为模板，遵循以下反应体系进行PCR扩增：模板DNA 2μL、2×Rapid Taq Master Mix 25μL、上游引物2μL、下游引物2μL、ddH₂O 19μL。

反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃彻底延伸3min；4℃保存。PCR产物交由广州天一辉远基因科技有限公司进行Sanger测序。

1.3.4 SNPs确定与基因分型

利用DNAstar软件的SeqMan工具对PCR产物的Sanger测序结果进行序列峰图的分析以确定潜在SNP位点，并通过该工具比对每个样本的测序数据，进行基因分型。

1.3.5基因型与生长性状关联分析

SNPs位点与基因型对应个体的生长性状数据，采用SAS 9.4 GLM程序包进行关联分析。

2.结果

2.1 KLHL31基因扩增片段区域序列PCR扩增及SNP筛选

选取328个个体，以每个个体的血样DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)进行Sanger测序，将测序后的峰图进行比对分析，共检测到3个SNP位点，其中有2个位点与生长性状显著相关，该位点为NC_052534.1:g.87828628 G>C和NC_052534.1:g.87828969 C>T。如图2所示。

SEQ ID NO:1：

GTCGTCACCCAGCAGAAGAAGAAAAAAATTCCTGGTACTCACAGGCAGCCACCATTCCTTTCTATAATTAAATTACCATTTCTTTATGCGCCGTGCACTTAAGGGAAAATCAATGTGCTGAGAGTTCAGATTGAAATGTGATCAAACTTGTTTTAAGTTGGTCTGAAACAATCCAGAGTGTGTTATCATGAATTAGCATTTCTTTGTGTTCTGTCTGCCATGAGCACAAAGGTCACGGAGAAAATCAGCTTGAGTGAGTTGTTTTAAAATCAATGGCTCTATCAAAGATAAATGTTATACCTGCATATGTTGGAATGCTGATCTCAGCAATTCTGTTTTAACTGTTATTGAAGCTCAGCACTTTCCTTCAATGTGTATTTGCTTACATGGATATATATTTAGATAGCTCCTTTGAGAACTGCTTAAGAGCCGCGCGTCACTTTGTGCTTGACAAAAGCCAGGCTCTTCATTTCAGCAAGAGTTGGAACTTGTCCAGAATTGATAAGCGTAATTCAAATTCAAAATATGCATGACTTTTTTTTCAGATAAAAGTTAGGCAGCATCTCTTCTCCCTCAATCTCCTGAGAATCCTAAAAATAACGTCATAACCGTTTCAAATTACAGCCAACAGAAAGCAGGGAGAGGGTCTATGAGTAGAAGATATTTGCAAATCTGACATGGGGAGTAGAATATCATCAGTCTCCTAAATTAGAAAAAGTTGAAGCAATTTGGAACAGATTTTAAATCTCCAGTCAACGTAAGATCATACCTAGAACTCACTCTTATCTTTTATGTTACTATCTCCTTAAGAATTTCCCCCGCTCTTAGTATTTCCTGGTTACACTCTGAATTCACTTACCTGTAAATCTGTATTAGTGCTGGAGTGAGGATGAACAGAAGTAGGGGCCCATATTTTTCTTATACTTCGGATCTAGAACCTAGCTCATTTCAGAATTGTACACTCATGCATACTCATTTGATGTTTATTAGGAAGAGAATTTAACTCTTTGAATGTGTTGATAATATTTACTGTTTTTGTCTCATTATTAAAAGAAAAGGAATTGTGGAATTACTTGTAGATGTATTCTTCATAGTTTGAACATCCATTGTTATGAATAAGCAGCTACATTGCCATCCAGGAGAGTACAACAGTCTATAGAGAGGCAGACTATCCTGTGCATTTTGGTTTTGTGGCCTTTATATGTATTGACAAAGGTTAGATTTGTTGCATAATCACGCAGGTATTACATTTCACAACTGCAGTGCAGCTCTAAACATTTTCAATTTATTTTTAGCGAGCTCTTGGCTGTAATATTTCATTGCAGTCATGGCACCTAAGAAGAAGAACGTGAAGAAGAACAAAGCAGCAGATATCAGTGAAATGACTATCATTGTGGAAGATGGCCCC.

2.2 KLHL31基因扩增片段区域序列SNP位点与生长性状的关联分析

对上述3个SNP位点与生长性状进行关联分析。

如表2所示，NC_052534.1:g.87828628 G>C位点与91日龄体重存在显著相关(p<0.05)，其中GG纯合基因型个体的91日龄体重显著大于GC杂合基因型个体(p<0.05)，而CC纯合基因型个体与GG纯合基因型个体和GC杂合基因型个体间无显著差异(p>0.05)；如表3和表4所示，NC_052534.1:g.87828969 C>T位点与77日龄体重和84日龄体重均存在显著相关(p<0.05)，其中CC纯合基因型个体的77日龄体重和84日龄体重均显著大于TT纯合基因型(p<0.05)，而CT杂合基因型个体与CC纯合基因型个体和TT纯合基因型间均无显著差异(p>0.05)。其他SNP位点与生长性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。

表2 NC_052534.1:g.87828628 G>C位点与生长性状关联

表3 NC_052534.1:g.87828969 C>T位点与生长性状关联

表4 NC_052534.1:g.87828969 C>T位点与生长性状关联

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种与鸡生长性状相关的KLHL31基因分子标记及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgtcaccc agcagaagaa gaaaaaaatt cctggtactc acaggcagcc accattcctt 60

tctataatta aattaccatt tctttatgcg ccgtgcactt aagggaaaat caatgtgctg 120

agagttcaga ttgaaatgtg atcaaacttg ttttaagttg gtctgaaaca atccagagtg 180

tgttatcatg aattagcatt tctttgtgtt ctgtctgcca tgagcacaaa ggtcacggag 240

aaaatcagct tgagtgagtt gttttaaaat caatggctct atcaaagata aatgttatac 300

ctgcatatgt tggaatgctg atctcagcaa ttctgtttta actgttattg aagctcagca 360

ctttccttca atgtgtattt gcttacatgg atatatattt agatagctcc tttgagaact 420

gcttaagagc cgcgcgtcac tttgtgcttg acaaaagcca ggctcttcat ttcagcaaga 480

gttggaactt gtccagaatt gataagcgta attcaaattc aaaatatgca tgactttttt 540

ttcagataaa agttaggcag catctcttct ccctcaatct cctgagaatc ctaaaaataa 600

cgtcataacc gtttcaaatt acagccaaca gaaagcaggg agagggtcta tgagtagaag 660

atatttgcaa atctgacatg gggagtagaa tatcatcagt ctcctaaatt agaaaaagtt 720

gaagcaattt ggaacagatt ttaaatctcc agtcaacgta agatcatacc tagaactcac 780

tcttatcttt tatgttacta tctccttaag aatttccccc gctcttagta tttcctggtt 840

acactctgaa ttcacttacc tgtaaatctg tattagtgct ggagtgagga tgaacagaag 900

taggggccca tatttttctt atacttcgga tctagaacct agctcatttc agaattgtac 960

actcatgcat actcatttga tgtttattag gaagagaatt taactctttg aatgtgttga 1020

taatatttac tgtttttgtc tcattattaa aagaaaagga attgtggaat tacttgtaga 1080

tgtattcttc atagtttgaa catccattgt tatgaataag cagctacatt gccatccagg 1140

agagtacaac agtctataga gaggcagact atcctgtgca ttttggtttt gtggccttta 1200

tatgtattga caaaggttag atttgttgca taatcacgca ggtattacat ttcacaactg 1260

cagtgcagct ctaaacattt tcaatttatt tttagcgagc tcttggctgt aatatttcat 1320

tgcagtcatg gcacctaaga agaagaacgt gaagaagaac aaagcagcag atatcagtga 1380

aatgactatc attgtggaag atggcccc 1408

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcgtcaccc agcagaagaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggccatct tccacaatga 20

Claims (5)

1.检测与鸡体重相关的SNP分子标记的引物对在鸡遗传育种中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记存在SNP1和SNP2两个SNP位点，所述SNP1为NC_052534.1:g.87828628G>C，所述SNP2为NC_052534.1:g.87828969C>T，所述SNP1的基因型包括GG、GC和CC；所述SNP2的基因型包括CC、CT和TT；当SNP1位点的基因型为GG时，则91日龄鸡的体重大；当SNP2位点的基因型为CC时，则77日龄体重和84日龄鸡的体重大，所述鸡为雌性宁都三黄鸡。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2-3所示。

3.一种利用检测与鸡体重相关的SNP分子标记的引物对鉴别鸡生长性状的方法，其特征在于，所述SNP分子标记存在SNP1和SNP2两个SNP位点，所述SNP1为NC_052534.1:g.87828628G>C，所述SNP2为NC_052534.1:g.87828969C>T，所述SNP1的基因型包括GG、GC和CC；所述SNP2的基因型包括CC、CT和TT；

所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测鸡基因组DNA，利用引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；

(2)对所述扩增产物测序，检测SNP1位点的基因型，当SNP1位点的基因型为GG时，则91日龄鸡的体重大；检测SNP2位点的基因型，当SNP2位点的基因型为CC时，则77日龄体重和84日龄鸡的体重大；

所述鸡为雌性宁都三黄鸡，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2-3所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述PCR扩增的体系为：模板DNA 2μL、2×Rapid Taq Master Mix 25μL、上游引物2μL、下游引物2μL、ddH₂O 19μL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃彻底延伸3min；4℃保存。

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