CN114112957A - 一种脂联素测定试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种脂联素测定试剂盒及其应用，涉及生物检测技术领域。本发明通过向试剂R1中加入稳定剂和表面活性剂，控制稳定剂为质量比1‑5:1的甘露醇和壳聚糖，表面活性剂为质量比1:1‑3:5的槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠和聚乙二醇6000的混合物，并控制两者的具体组分和浓度比，使得试剂盒的灵敏度，准确度显著增加；通过控制槐糖脂和壳聚糖的质量比，能够明显提高试剂盒的稳定性，即便在试剂R1不添加防腐剂的情况下，试剂盒在2‑8℃避光密闭放置16个月依然具有很好的稳定性。

Description

一种脂联素测定试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种脂联素测定试剂盒及其应用。
背景技术
脂联素是一种脂肪细胞因子，能在人体血浆中稳定存在，浓度范围约为3.0-30.0mg/L，约占血浆蛋白的0.01％。人类脂联素含244个氨基酸，包括3个区域：氨基末端信号序列、胶原结构域和羧基末端的球形结构域。脂联素以三聚体(65kb)、六聚体(150kb)和高分子量聚合体(18-36个多体，>280kb)三种亚型存在于血液中。临床研究显示，脂联素与肥胖、II型糖尿病、冠心病、胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和血管损伤后抗内膜增生的特性。
脂联素的测定方法有多种，例如放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)，如中国专利申请200910043672.X中公开了一种人脂联素酶联免疫吸附检测试剂盒及其制备方法与应用，所述试剂盒包括抗人APN单克隆抗体包被的酶标板，重组的gAPN蛋白标准品，抗人APN单克隆检测抗体，HRP－链霉素，10mM pH7.4的磷酸盐缓冲液，TMB酶底物显色液，0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液及2M H2SO4。该发明还包括所述试剂盒的制备方法与在人血APN含量检测中的应用。ELISA方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，操作时间长、自动化程度低。放射免疫法(RIA)灵敏度高，但不稳定，重复性比ELISA差，而且存在放射性污染的危险。
目前使用较多的是胶乳增强免疫比浊法，其优势是：①省时省力：在均相反应体系中进行抗原、抗体反应，利用全自动生化分析仪直接测定反应液的吸光度值，几分钟就能获得结果，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤。②稳定准确：操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测人类血清中脂联素的含量。③应用广泛：免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足以检测到人类血清中脂联素的下限值，可完全满足临床检测要求。
如中国专利申请202010101938.8中公开了一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备与应用方法，包括脂联素R1试剂和脂联素R2试剂；脂联素R1试剂包括缓冲液A、保护剂A、反应增强剂、防腐剂；脂联素R2试剂包括缓冲液B、保护剂B、防腐剂、包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒；其中，包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的抗人脂联素抗体与致敏聚苯乙烯胶乳颗粒之间通过链亲和素-生物素***连接。该发明还提供了一种定量检测脂联素ADPN的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备与应用方法。但是给试剂盒的稳定性以及重复性和准确性都不能满足需求。
因此，需要提供一种稳定好、重复性和准确性高的脂联素测定试剂盒及其制备方法。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种稳定好、重复性和准确性高的脂联素测定试剂盒及其制备方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种脂联素测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂。
所述的R1试剂包括缓冲液、电解质、稳定剂和表面活性剂A；
所述的R2试剂包括抗人脂联素抗体乳胶颗粒、缓冲液、表面活性剂B和防腐剂。
所述的表面活性剂A为槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠、聚乙二醇单辛基苯基醚、聚乙二醇6000、曲拉通X-100和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。
优选地，所述的表面活性剂为槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠、聚乙二醇单辛基苯基醚和聚乙二醇6000中的一种或几种；
再优选地，所述的表面活性剂为槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠和聚乙二醇6000的混合物；
进一步优选地，所述的表面活性剂为质量比1:1-3:5的槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠和聚乙二醇6000的混合物；
再进一步优选地，所述的表面活性剂为质量比1:2:5的槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠和聚乙二醇6000的混合物。
所述的表面活性剂B为吐温-20、吐温-80、司盘-60、司盘-80和曲拉通X-100中的一种或几种；
优选地，所述的表面活性剂B为吐温-80。
所述的稳定剂为甘露醇、山梨醇、海藻糖、蔗糖和壳聚糖中的一种或几种；
优选地，所述的稳定剂为质量比1-5:1的甘露醇和壳聚糖；
再优选地，所述的稳定剂为质量比2-4:1的的甘露醇和壳聚糖；
进一步优选地，所述的稳定剂为质量比3:1的的甘露醇和壳聚糖。
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液和Tris缓冲液中的一种或几种，优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
所述的电解质为质为氯化钠、氯化钾、氯化镁和硫酸镁中的一种或几种，优选为氯化钠。
所述的防腐剂选自叠氮钠、Proclin-950或Proclin-300中的一种，优选为Proclin-300。
作为一些优选的技术方案，所述的试剂R1中还含有牛血清白蛋白。
在一些优选实施方案中，所述的槐糖脂和壳聚糖的浓度比为5-15:1；优选地，所述的槐糖脂和壳聚糖的浓度比为8-12:1；再优选地，所述的槐糖脂和壳聚糖的浓度比为12:1。
本发明在实施过程中意外地发现控制槐糖脂和壳聚糖的质量比，能够明显提高试剂盒的稳定性，即便在试剂R1不添加防腐剂的情况下，试剂盒长期放置16个月后依然具有很好的稳定性。
所述的脂联素测定试剂盒，所述的R1试剂包括缓冲液90-120mmol/L、电解质3-8g/L、甘露醇2-5g/L、壳聚糖1-3g/L、槐糖脂10-15g/L、十二烷基苯磺酸钠20-40g/L和聚乙二醇6000 50-80g/L；
所述的R2试剂包括抗人脂联素抗体乳胶颗粒8-12mg/L、缓冲液90-120mmol/L、吐温-80 60-100g/L和防腐剂0.1-0.5g/L。
优选地，所述的脂联素测定试剂盒，所述的R1试剂包括pH＝7的三羟甲基氨基甲烷90-120mmol/L、氯化钠3-8g/L、甘露醇2-5g/L、壳聚糖1-3g/L、槐糖脂10-15g/L、十二烷基苯磺酸钠20-40g/L和聚乙二醇6000 50-80g/L；
所述的R2试剂包括抗人脂联素抗体乳胶颗粒8-12mg/L、pH＝7的三羟甲基氨基甲烷90-120mmol/L、吐温-80 60-100g/L和Proclin-300 0.1-0.5g/L。
再优选地，所述的脂联素测定试剂盒，所述的R1试剂包括pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、氯化钠5g/L、甘露醇3g/L、壳聚糖1g/L、槐糖脂12g/L、十二烷基苯磺酸钠24g/L和聚乙二醇6000 60g/L；
所述的R2试剂包括抗人脂联素抗体乳胶颗粒10mg/L、pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、吐温-80 80g/L和Proclin-300 0.2g/L。
所述的脂联素测定试剂盒中，还包括脂联素质控品和脂联素校准品。
本发明还提供了所述的脂联素测定试剂盒在定量检测脂联素含量时的应用。
本发明还提供了脂联素测定试剂盒的使用方法。
本试剂盒适用于日立7170/7600/7180/008AS/3500、迈瑞BS2000、迪瑞CS600、雅培C16000、东芝TBA120FR/TBA-FX8、贝克曼AU5800/AU680/AU2700/DXC800、西门子ADVIA2400/CH930、罗氏C701/C702、杜邦AR等全自动生化分析仪。
该测定试剂盒的测定方法为终点法，反应方向为升反应：
(1)将150μL试剂R1和2μL待测样本混合均匀，37℃孵育5min后得到反应液1，测定吸光度A1，测定主波长为570nm；
(2)加入50μL试剂R2混合均匀，反应5min，得到反应液2，测定吸光度A2，测定主波长为570nm；
(3)按照步骤(1)-(2)，对不同浓度的脂联素标准品的吸光度进行测定，得到吸光度A空白和A标准；
(4)以标准品的吸光度变化值ΔA(A标准-A空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程；
(5)计算样本的吸光度变化值ΔA(A2-A1)，根据标准曲线方程，得到样本中脂联素浓度。
与现有技术相比本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的脂联素测定试剂盒，通过向试剂R1中加入稳定剂和表面活性剂，控制稳定剂为质量比1-5:1的甘露醇和壳聚糖，表面活性剂为质量比1:1-3:5的槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠和聚乙二醇6000的混合物，并控制两者的具体组分和浓度比，使得试剂盒的灵敏度，准确度显著增加；
(2)本发明在实施过程中意外地发现控制槐糖脂和壳聚糖的质量比，能够明显提高试剂盒的稳定性，即便在试剂R1不添加防腐剂的情况下，试剂盒在2-8℃避光密闭放置16个月依然具有很好的稳定性；
(3)本发明提供的脂联素测定试剂盒，通过控制试剂R1和试剂R2中各组分的具体组分以及浓度比，能够明显提高试剂盒的抗干扰能力，样本中血红蛋白≤5.0g/L，胆红素≤500mg/L，抗坏血酸≤10.0g/L，甘油三酯≤10.0g/L对测试结果无明显干扰；
(4)本发明提供的脂联素测定试剂盒，组分简单易得，制作成本低。
附图说明
图1为脂联素测定试剂盒标准曲线
图2为本发明实施例1制备的脂联素测定试剂盒线性范围曲线；
图3本发明实施例2制备的脂联素测定试剂盒线性范围曲线；
图4本发明实施例3制备的脂联素测定试剂盒线性范围曲线；
图5本发明实施例4制备的脂联素测定试剂盒线性范围曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
测试条件与方法：
仪器：日立7170全自动生化分析仪
参数：
主波长 570nm 样品 2μL
次波长 / 试剂1 150μL
反应温度 37℃ 试剂2 50μL
反应方向 升反应 反应类型 终点法
操作步骤：
Figure BDA0003378432330000051
Figure BDA0003378432330000061
实施例1一种脂联素测定试剂盒
组分及其浓度如下：
R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷90mmol/L、氯化钠3g/L、甘露醇2g/L、壳聚糖1g/L、槐糖脂10g/L、十二烷基苯磺酸钠20g/L和聚乙二醇6000 50g/L；
R2试剂包括：抗人脂联素抗体乳胶颗粒8mg/L、pH＝7的三羟甲基氨基甲烷90mmol/L、吐温-80 60g/L和Proclin-300 0.1g/L。
实施例2一种脂联素测定试剂盒
组分及其浓度如下：
R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷120mmol/L、氯化钠8g/L、甘露醇5g/L、壳聚糖3g/L、槐糖脂15g/L、十二烷基苯磺酸钠40g/L和聚乙二醇6000 80g/L；
R2试剂包括：抗人脂联素抗体乳胶颗粒12mg/L、pH＝7的三羟甲基氨基甲烷120mmol/L、吐温-80 100g/L和Proclin-300 0.5g/L。
实施例3一种脂联素测定试剂盒
组分及其浓度如下：
R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷110mmol/L、氯化钠6g/L、甘露醇4g/L、壳聚糖2g/L、槐糖脂13g/L、十二烷基苯磺酸钠30g/L和聚乙二醇600075g/L；
R2试剂包括：抗人脂联素抗体乳胶颗粒9mg/L、pH＝7的三羟甲基氨基甲烷110mmol/L、吐温-80 90g/L和Proclin-300 0.3g/L
实施例4一种脂联素测定试剂盒
组分及其浓度如下：
R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、氯化钠5g/L、甘露醇3g/L、壳聚糖1g/L、槐糖脂12g/L、十二烷基苯磺酸钠24g/L和聚乙二醇600060g/L；
R2试剂包括：抗人脂联素抗体乳胶颗粒10mg/L、pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、吐温-80 80g/L和Proclin-300 0.2g/L
对比例1
与实施例4的区别在于：表面活性剂仅为十二烷基苯磺酸钠和聚乙二醇6000，即R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、氯化钠5g/L、甘露醇3g/L、壳聚糖1g/L、十二烷基苯磺酸钠24g/L和聚乙二醇6000 60g/L；其他步骤与操作与实施例4相同。
对比例2
与实施例4的区别在于：表面活性剂仅为槐糖脂和聚乙二醇6000，即R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、氯化钠5g/L、甘露醇3g/L、壳聚糖1g/L、槐糖脂12g/L和聚乙二醇6000 60g/L；其他步骤与操作与实施例4相同。
对比例3
与实施例4的区别在于：表面活性剂为质量比1:1:3的槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠和聚乙二醇6000，即R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、氯化钠5g/L、甘露醇3g/L、壳聚糖1g/L、槐糖脂19.2g/L、十二烷基苯磺酸钠19.2g/L和聚乙二醇6000 57.6g/L；其他步骤与操作与实施例4相同。
对比例4
与实施例4的区别在于：稳定剂仅为甘露醇，即R1试剂包括：R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、氯化钠5g/L、甘露醇4g/L、槐糖脂12g/L、十二烷基苯磺酸钠24g/L和聚乙二醇6000 60g/L；其他步骤与操作与实施例4相同。
对比例5
与实施例4的区别在于：槐糖脂和壳聚糖的浓度比为1:1，即R1试剂包括：R1试剂包括：pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、氯化钠5g/L、甘露醇3g/L、壳聚糖6.5g/L、槐糖脂6.5g/L、十二烷基苯磺酸钠24g/L和聚乙二醇6000 60g/L；其他步骤与操作与实施例4相同。
对比例6
采用现有技术CN111239421A中公开的方法制备得到试剂盒，抗人脂联素抗体乳胶颗粒使用本发明购买的组分。
效果实验
实验例1脂联素测定试剂盒标准曲线
采用脂联素标准品，配制浓度分别为0、10、12、14、16、18、20mg/L，以实验例4为例，按照上述测定步骤得到，测定脂联素试剂盒标准曲线(如图1所示)。其中，标准品的吸光度变化值ΔA(A标准-A空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，标准曲线方程：y＝0.0099x-0.0002，R2＝0.9998。
实验例2线性范围测试
使用生理盐水分别配制浓度为0.2、0.5、1.5、5.0、20、30、40mg/L的脂联素标准品，每个浓度水平样本重复测定10次取平均值，分别用实施例1-4和对比例6所述的试剂盒测定脂联素的含量,单位为mg/L，结果见下表1。
表1
Figure BDA0003378432330000081
根据表2的检测结果可知，在浓度为0.2-40mg/L时，本发明实施例1-4制备的试剂盒的测试结果能达到理论值且两者的相关性较好，尤其是实施例4制备的试剂盒检测时R2＝0.9999(如图5所示)，相关性优于对比例6制备的试剂盒(R2＝0.9992)，能够满足要求，本发明提供的试剂盒线性范围较宽。
实验例3脂联素试剂盒的长期稳定性考察
针对本发明制备的实施例1-4以及对比例1-5制备的试剂盒在2-8℃避光密闭放置16个月，对其检测稳定性进行检测，检测5.0mg/L的样本试剂重复测定5次取平均值，并计算平均偏差，具体见下表2。
表2长期稳定性试验
Figure BDA0003378432330000082
Figure BDA0003378432330000091
由上表2的检测数据可以看出本发明实施例1-4制备的试剂盒的长期稳定性明显高于对比例1-5中制备的试剂盒，对比例4-5改变稳定剂的种类或改变槐糖脂和壳聚糖的浓度比不在本发明公开的范围内，其制备的试剂盒稳定性明显降低，长期放置试剂盒的检测变化率高达30％，稳定性较差。
实验例4精密度试验
将实施例1-4以及对比例1-5所制得的脂联素测定试剂盒对浓度为10.0mg/L的同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，检测数据如表3。
表3
Figure BDA0003378432330000092
根据上表3的检测数据可以看出本发明实施例1-4制备的试剂盒的精密度明显高于对比例1-5，本发明实施例4制备的试剂盒的变异系数仅为1.3％，明显低于其他实施例，对比例1-3改变试剂R1中表面活性剂组分以及浓度比不在本发明保护范围内时试剂盒的精密度明显降低，对比例4-5改变稳定剂组分以及浓度比不在本发明保护范围内，也会对试剂盒的精密度造成影响，使精密度降低。
实施例5干扰实验
在正常血清中各自添加一定量血红蛋白、甘油三酯、胆红素和抗坏血酸，同时加入等体积的去离子水作为无干扰物血清，使用实施例1-4的脂联素测定试剂盒，同时测定样本的浓度。以干扰程度为5％为测定***对干扰物的最高忍受限，血清中血红蛋白5.0g/L以下、甘油三酯10.0g/L以下、胆红素500mg/L以下和抗坏血酸10.0g/L以下，不影响脂联素测定结果。
本发明所使用的试剂简单易得，通过控制各种试剂的浓度比，明显提高了试剂盒的准确性、精密性以及稳定性，降低了试剂盒的成本，有利于试剂盒在临床的广泛应用。
以上述数仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种脂联素测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其特征在于：
所述的R1试剂包括缓冲液、电解质、稳定剂和表面活性剂A；
所述的R2试剂包括抗人脂联素抗体乳胶颗粒、缓冲液、表面活性剂B和防腐剂；
所述的表面活性剂A为槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠、聚乙二醇单辛基苯基醚、聚乙二醇6000、曲拉通X-100和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂为质量比1:1-3:5的槐糖脂、十二烷基苯磺酸钠和聚乙二醇6000的混合物。
3.根据权利要求1所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂B为吐温-20、吐温-80、司盘-60、司盘-80和曲拉通X-100中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的稳定剂为甘露醇、山梨醇、海藻糖、蔗糖和壳聚糖中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的稳定剂为质量比1-5:1的甘露醇和壳聚糖。
6.根据权利要求5所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的稳定剂为质量比3:1的的甘露醇和壳聚糖。
7.根据权利要求6所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的槐糖脂和壳聚糖的浓度比为5-15:1。
8.根据权利要求1-7任一项所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的脂联素测定试剂盒，所述的R1试剂包括缓冲液90-120mmol/L、电解质3-8g/L、甘露醇2-5g/L、壳聚糖1-3g/L、槐糖脂10-15g/L、十二烷基苯磺酸钠20-40g/L和聚乙二醇6000 50-80g/L；
所述的R2试剂包括抗人脂联素抗体乳胶颗粒8-12mg/L、缓冲液90-120mmol/L、吐温-8060-100g/L和防腐剂0.1-0.5g/L。
9.根据权利要求1-7任一项所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的脂联素测定试剂盒，所述的R1试剂包括pH＝7的三羟甲基氨基甲烷90-120mmol/L、氯化钠3-8g/L、甘露醇2-5g/L、壳聚糖1-3g/L、槐糖脂10-15g/L、十二烷基苯磺酸钠20-40g/L和聚乙二醇600050-80g/L；
所述的R2试剂包括抗人脂联素抗体乳胶颗粒8-12mg/L、pH＝7的三羟甲基氨基甲烷90-120mmol/L、吐温-80 60-100g/L和Proclin-300 0.1-0.5g/L。
10.根据权利要求1-7任一项所述的脂联素测定试剂盒，其特征在于：所述的脂联素测定试剂盒，所述的R1试剂包括pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、氯化钠5g/L、甘露醇3g/L、壳聚糖1g/L、槐糖脂12g/L、十二烷基苯磺酸钠24g/L和聚乙二醇6000 60g/L；
所述的R2试剂包括抗人脂联素抗体乳胶颗粒10mg/L、pH＝7的三羟甲基氨基甲烷100mmol/L、吐温-80 80g/L和Proclin-300 0.2g/L。
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Denomination of invention: A Kind of Adiponectin Determination Kit and Its Application

Effective date of registration: 20230924

Granted publication date: 20220621

Pledgee: Xinchang Zhejiang rural commercial bank Limited by Share Ltd.

Pledgor: ZHEJIANG KUAKE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2023330002129

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