CN112051354A - 一种脂肪酶测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酶测定试剂盒及其制备方法,所述R1试剂中包括缓冲液、脱氧胆酸钠、共脂肪酶、金属盐、保护剂、表面活性剂和防腐剂;所述R2试剂中包括L‑酒石酸、牛黄脱氧胆酸钠、1,2‑邻‑二月桂‑消旋‑甘油‑3‑戊酸‑(6‑甲基试卤灵)酯、助溶剂、稳定剂和防腐剂,其中所述助溶剂由乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯和Triton表面活性剂组成。本发明通过优选,将乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯以及Triton表面活性剂共同作为助溶剂,以发挥三者的协同增效作用,从而大幅提升底物的溶解性,进一步地,以巯基乙醇和甘露醇作为复合稳定剂,从而得到了一种稳定性好、准确度和精密度高并且线性范围显著提高的脂肪酶测定试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于临床生化检测技术领域,具体涉及一种脂肪酶测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
血清脂肪酶(LPS)主要来源于胰腺,少量来源于胃和小肠,测定脂肪酶活力用于反映胰腺的失调。人体脂肪酶升高,常见于急性胰腺炎,胰腺癌、结石性胰管阻塞,肝硬化、肠梗阻、急慢性肾脏疾病等。LPS是一组催化长链脂肪酸甘油酯水解的酶,其只水解脂肪酸甘油酯的α位脂肪酸。LPS对长链脂肪酸甘油酯有一定的特异性,并且LPS最大活性和特异性的发挥或表现需要胆酸盐和共脂肪酶的参与。LPS的检测方法应用较多的是色原底物法和酶偶联显色法,其中色原底物法的基本原理是:用1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯(简称6-甲基试卤灵酯)为底物的比色法,主要是在胆酸盐及共脂肪酶作用下,分解为1,2-邻-二月桂-消旋-甘油和戊二酸(6-甲基试卤灵)酯,戊二酸(6-甲基试卤灵)酯自发水解,产生戊二酸和甲基试卤灵,后者显示红色,通过检测甲基试卤灵的生成速率可测定LPS活性。
如专利CN109490296A公开了一种脂肪酶检测试剂盒及生产工艺,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,其中试剂R1包括缓冲液、酶反应加速剂、表面活性剂、去氧胆酸钠、共脂肪酶和叠氮化钠;试剂R2中包括:缓冲液、酶反应加速剂、牛磺脱氧胆酸钠、蛋白变性剂、1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯和叠氮化钠。然而在R2试剂的制备过程中会出现色原底物1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯的溶解不充分,进而影响试剂的批间差和稳定性,并且随着放置时间的增长,R2试剂中会有底物析出,使测值随着放置时间的增长而降低;同时现有技术中的脂肪酶试剂盒的线性范围均较窄,导致在检测高值时,需稀释样本后再进行检测,从而增加了临床检测的工作量。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷,提供了一种脂肪酶测定试剂盒,主要是对R2试剂进行优化,通过将乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯和Triton表面活性剂配合使用,以显著增大底物的溶解性和稳定性,同时增强了试剂的准确度、精密度和线性范围。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种脂肪酶测定试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,所述R1试剂中包括缓冲液、脱氧胆酸钠、共脂肪酶、金属盐、保护剂、表面活性剂和防腐剂;所述R2试剂中包括L-酒石酸、牛黄脱氧胆酸钠、1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯、助溶剂、稳定剂和防腐剂,其中所述助溶剂由乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯和Triton表面活性剂组成。
由于脂肪酶底物:1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯为酯类物质,不易溶解在水中,且脂肪酶底物析出是造成脂肪酶测定试剂盒不稳定及产生批间差较大的重要因素,因此本发明优选了合适的助溶剂以增加脂肪酶底物的稳定性,该助溶剂由乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯和Triton表面活性剂组成。脂肪酶底物作为酯类物质,在有机溶剂乙酸乙酯中具有一定的溶解度,但溶有底物的乙酸乙酯溶液溶于水后会出现沉淀,将乙酸乙酯和二月桂甘油硫酸酯配合使用可使底物溶解更充分。但二月桂甘油硫酸酯不溶于水,加入到溶液中不易分散溶解,因此还需加入同时具备脂溶性和亲水性作用的非离子表面活性剂Triton,使溶解有底物的乙酸乙酯和二月桂甘油硫酸酯充分溶解于水中。将乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯以及Triton表面活性剂共同作为助溶剂,可大幅提升底物的溶解性和稳定性,减少底物的溶解时间,从而得到一种稳定性好、准确度和精密度高,并且线性范围宽的脂肪酶测定试剂盒。
优选地,所述助溶剂中乙酸乙酯的浓度为3~10ml/L,二月桂甘油硫酸酯的浓度为0.5~2g/L,Triton表面活性剂的质量百分比为0.1~1%。
优选地,所述R2试剂中的稳定剂为质量比为1:1~3的巯基乙醇和甘露醇。以巯基乙醇和甘露醇作为复合稳定剂,其中巯基乙醇自身易被氧化和水解,而将其与甘露醇复配可有效去除自由基,从而显著增强试剂的稳定性。
优选地,所述R2试剂中的稳定剂为质量比为1:2的巯基乙醇和甘露醇。
优选地,所述R1试剂的pH为8.0,具体包括:
所述R2试剂的pH为4.0,具体包括
其中,所述R1试剂和所述R2试剂中的组分的含量百分数均为质量百分比。
优选地,所述R1试剂中的缓冲液为BICINE缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种。
优选地,所述R1试剂中的金属盐为氯化钠、氯化钾、二氯化锰、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁、硫酸锌、四鹏酸钠、碳酸钾、乙二胺四乙酸二钠和酒石酸钠中的一种或多种。
优选地,所述R1试剂中的保护剂为氨基酸类保护剂,包括甘氨酸、L-丝氨酸,草氨酸,天门冬氨酸,牛血清白蛋白,谷氨酸钠中的一种或多种。
优选地,所述R1试剂中的表面活性剂为:吐温-20、吐温-80、月桂醇聚氧乙烯醚(brij-35)、四聚乙二醇单月桂醚(Thesit)、丙三醇、蓖麻油、PVP K40(聚乙烯吡咯烷酮K40)、GENAPOLX-080(α-异十三烷基-ω-羟基-聚(氧-1,2-亚乙基))、NP(壬基酚聚氧乙烯醚)系列、聚乙二醇系列、Emulgen系列中的一种或多种。
本发明还提供了上述脂肪酶测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:(1)R1试剂的配制:取适量纯水,加入缓冲液,调节pH至8.0,然后按比例加入其它组分,定容后即得R1试剂;
(2)R2试剂的配制:①称取底物1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯,加入乙酸乙酯中搅拌均匀,然后依次加入二月桂甘油硫酸酯和Triton表面活性剂,搅拌均匀,使底物溶解充分;②称取R2试剂中其他组分并溶解于纯水中,调节pH至4.0,然后匀速缓慢地加入步骤①中得到的溶解后的底物,加液过程中不断搅拌,最后定容即得R2试剂。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明通过优选,将乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯以及Triton表面活性剂共同作为助溶剂,以发挥三者的协同增效作用,从而大幅提升脂肪酶底物的溶解性和溶解效率;进一步地,以巯基乙醇和甘露醇作为复合稳定剂,以增强试剂的稳定性,从而得到了一种稳定性好、准确度和精密度高并且线性范围显著提高的脂肪酶测定试剂盒。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比例1制备得到的R2试剂的性状,其中1-1为对比例1得到的R2试剂,1-2为实施例1得到的R2试剂。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种脂肪酶测定试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,所述R1试剂的pH为8.0,具体包括:
所述R2试剂的pH为4.0,具体包括
其中,所述R1试剂和所述R2试剂中的组分的含量百分数均为质量百分比,所述稳定剂为质量比为1:2的巯基乙醇和甘露醇。
该试剂盒的制备方法为:(1)R1试剂的配制:量取适量纯水,加入BICINE缓冲液,然后调pH为8.0,再按上述比例加入R1试剂中的其他组分物质,搅拌溶解后定容即得所述R1试剂;(2)R2试剂的配制:①称取底物1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯,放入装有乙酸乙酯的烧杯中,搅拌均匀,然后依次加入二月桂甘油硫酸酯和Tritonx-114,高速搅拌使底物充分溶解,溶液以微粒状态充分分散,制成稳定的乳化剂;②称取R2试剂中其他组分并溶解于纯水中,调节pH至4.0,然后将步骤①得到的溶解后的底物通过注射器或者外接毛细软管的方式,缓慢匀速地加入到该溶液中,在加液过程中不断搅拌,保证底物原料快速均匀溶解在溶液中,最后定容即得所述R2试剂。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于:所述R1试剂配方为:
所述R2试剂的pH为4.0,具体包括
其中,所述R1试剂和所述R2试剂中的组分的含量百分数均为质量百分比,所述稳定剂为质量比为1:2的巯基乙醇和甘露醇。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于:所述R2试剂中的稳定剂为质量比为1:1的巯基乙醇和甘露醇。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于:所述R2试剂中的稳定剂为质量比为1:3的巯基乙醇和甘露醇。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于:所述R2试剂中无二月桂甘油硫酸酯和Triton X-114,仅用乙酸乙酯作为助溶剂,溶解底物1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于:所述R2试剂中无Triton X-114,仅用乙酸乙酯和二月桂甘油硫酸酯作为助溶剂溶解底物。
对比例3
本对比例与实施例1的不同之处在于:所述R2试剂中二月桂甘油硫酸酯的含量为0.03g/L,乙酸乙酯的含量为2ml/L,Triton X-114的质量百分比为0.08%。
对比例4
本对比例与实施例1的不同之处在于:所述R2试剂中二月桂甘油硫酸酯的含量为2.5g/L,乙酸乙酯的含量为12ml/L,Triton X-114的质量百分比为1.3%。
应用例
将上述实施例1-4和对比例1-4得到的8组试剂盒分别进行如下性能评价:
(1)试剂性状:观察试剂是否澄清,是否有析出物;
(2)准确度:测第三方质控品,相对偏差应在不大于10%范围内;
(3)精密度:使用同一定值血清重复测定20次,其测定值的变异系数(CV%)应不超过6.0%;
(4)线性范围:测定脂肪酶浓度为2-1000U/L的样本,并计算相关系数,其中相关系数≥0.99可满足使用需求;
(5)试剂批间差评价:三批试剂测定同一定值血清,批间差应不超过10%;
(6)稳定性评价:a.长期稳定性,试剂2-8℃放置12个月后观察试剂的性状、准确度、精密度;b.开瓶稳定性,试剂于2-8℃开瓶放置31天后观察试剂的性状。
其中现配现测的测定结果如表1所示、2-8℃放置12个月后以及2-8℃开瓶放置31天的测定结果如表2所示。
表1各组试剂的性能评价数据
表2长期稳定性和开瓶稳定性的性能评价数据
根据表1的测定结果,相比于实施例1和2,减少助溶剂中成分(对比例1-2),或改变助溶剂的含量时(对比例3-4),R2试剂的性状均为浑浊状态,即底物溶解不充分,具体可见附图1,图中1-1为按对比例1的方法制备得到的R2试剂,图1-2为按实施例1的方法制备得到的R2试剂,可明显观察到图1-2的试剂比图1-1的试剂更加澄清,即底物溶解的更充分。上述结果说明,助溶剂中成分或含量的变化均会对R2试剂中底物的溶解有显著影响,导致不同批次的试剂的批间差存在差异,进而显著影响了试剂的准确度、精密度和线性。
根据表2的测定结果,相比于实施例1-2,对比例1-4于2-8℃储存12个月或2-8℃开瓶放置31天,试剂均出现浑浊和析出物,并且试剂检测的准确度、精密度以及线性均发生了显著变化,无法满足使用需求,说明助溶剂成分或含量的变化对试剂的长期稳定性和开瓶稳定性有显著影响。而实施例3-4相比于实施例1-2,虽然在2-8℃储存12个月或2-8℃开瓶放置31天后试剂变浑浊,有少量析出物,但是试剂的准确度、精密度和线性仍能满足使用需求。
综合上述结果,用乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯以及Triton表面活性剂按照一定浓度配比进行复配,作为助溶剂时,可发挥三者的协同增效作用,从而大幅提升底物的溶解性和溶解效率,减少批间差,并提高了试剂的准确度、精密度及线性,同时以质量比为1:1-3的巯基乙醇和甘露醇作为复合稳定剂,可维持试剂的长期稳定性和开瓶稳定性,从而得到了一种稳定性好、反应灵敏度和精密度高并且线性范围为2-1000U/L的脂肪酶测定试剂盒。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种脂肪酶测定试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其特征在于,所述R1试剂中包括缓冲液、脱氧胆酸钠、共脂肪酶、金属盐、保护剂、表面活性剂和防腐剂;所述R2试剂中包括L-酒石酸、牛黄脱氧胆酸钠、1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯、助溶剂、稳定剂和防腐剂,其中所述助溶剂由乙酸乙酯、二月桂甘油硫酸酯和Triton表面活性剂组成。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪酶测定试剂盒,其特征在于,所述助溶剂中乙酸乙酯的浓度为3~10ml/L,二月桂甘油硫酸酯的浓度为0.5~2g/L,Triton表面活性剂的质量百分比为0.1~1%。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪酶测定试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中的稳定剂为质量比为1:1~3的巯基乙醇和甘露醇。
4.根据权利要求3所述的一种脂肪酶测定试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中的稳定剂为质量比为1:2的巯基乙醇和甘露醇。
6.根据权利要求1所述的一种脂肪酶测定试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中的缓冲液为BICINE缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种脂肪酶测定试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中的金属盐为氯化钠、氯化钾、二氯化锰、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁、硫酸锌、四鹏酸钠、碳酸钾、乙二胺四乙酸二钠和酒石酸钠中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种脂肪酶测定试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中的保护剂为氨基酸类保护剂,包括甘氨酸、L-丝氨酸,草氨酸,天门冬氨酸,牛血清白蛋白,谷氨酸钠中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的一种脂肪酶测定试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中的表面活性剂为:吐温-20、吐温-80、月桂醇聚氧乙烯醚、四聚乙二醇单月桂醚、丙三醇、蓖麻油、PVPK40、GENAPOLX-080、NP系列、聚乙二醇系列、Emulgen系列中的一种或多种。
10.权利要求1-9任一项所述的脂肪酶测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)R1试剂的配制:称取适量纯水,加入缓冲液,调节pH至8.0,然后按比例加入其它组分,定容后即得R1试剂;
(2)R2试剂的配制:①称取底物1,2-邻-二月桂-消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯,加入乙酸乙酯中搅拌均匀,然后依次加入二月桂甘油硫酸酯和Triton表面活性剂,搅拌均匀,使底物溶解充分;②称取R2试剂中其他组分并溶解于纯水中,调节pH至4.0,然后匀速缓慢地加入步骤①中得到的溶解后的底物,加液过程中不断搅拌,最后定容即得R2试剂。
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