CN107022538A

CN107022538A - 一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因

Info

Publication number: CN107022538A
Application number: CN201610205666.XA
Authority: CN
Inventors: 刘子铎; 王倩
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2016-04-02
Filing date: 2016-04-02
Publication date: 2017-08-08

Abstract

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因。所述的基因CsnagA分离自天然菌株阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)0360。从保藏编号为CCTCC NO：M 2016162阪崎肠杆菌中分离基因组DNA，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。通过基因重组的方法，将该基因转入大肠杆菌构建基因工程菌，使其具有高效发酵生产氨基葡萄糖的能力，通过酶促生物合成法可生产氨基葡萄糖。本发明与现有的技术相比提高了生产效率，降低了生产成本。

Description

一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因。所述的基因分离自一株天然菌株阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)。

背景技术

氨基葡萄糖(GlcN，化学名称为2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，其结构式见图8)，自然界唯一的一种碱性单糖，广泛存在于动物、微生物来源的多糖和结合多糖中。在人体中主要存在于关节软骨和***、细胞膜中，为人类的关节软骨提供保护和润滑作用，为关节生理活性的正常运行提供保证。D-氨基葡萄糖不仅具有治疗关节炎和胃溃疡、抑制癌细胞生长、消炎、刺激蛋白多糖的合成等活，而且可活化自然杀伤细胞等免疫细胞，对人体的免疫具有调节作用。

氨基葡萄糖早在20世纪60年代就已经被大量用于骨关节炎的治疗，而且研究表明氨基葡萄糖能够有效应用于风湿性关节炎的治疗中(王升等2014)；欧洲风湿病协会(EULAR)明确将硫酸氨基葡萄糖作为治疗骨关节炎的处方药物，可以逆转骨关节炎的症状(吴子英等2012)。目前已经有大量的胶囊和片剂上市销售。氨基葡萄糖的全球市场需求量增长迅速，美国市场2006年的需求量为5000～6000吨，日本市场2000年的的需求量为70～80吨，2006年增加到500吨以上，销售额在20亿日元以上，而其终端产品的市场销售额则高达400亿日元，是原料的20倍(张荣岭2013)。而今在食品保健品和生物医药领域已经有了广泛的应用，在骨关节的治疗中相关氨基葡萄糖应用的研究也越来愈多。

在氨基葡萄糖目前的生产方法中，目前生产氨基葡萄糖的方法主要有2种，即酸水解法、(Sashiwa et al.2002；Kuk et al.2005)及微生物发酵法(王升等2014)。前一种方法的材料主要来自虾蟹等贝壳类动物的外骨骼，酸水解法有很多的缺陷，比如一些对虾蟹产品过敏的患者造成过敏反应，来自水产品虾蟹壳水解的氨基葡萄糖产物有鱼腥味，另外浓盐酸的大量使用会带来严重的环境问题，而且对相关的设备要求较高，将逐步受到国家相关政策的限制；与传统方法相比，微生物发酵生产GlcN虽然环境污染少、无致敏因素(陈欣等2012)，但是微生物发酵法生产周期长，生产效率低。酶促转化法是一种新型的氨基葡萄糖生产方法，生产温和，操作简单，既避免了酸水解法带来的环境污染，也无致敏因素，产品无鱼腥味，副反应较少、成本低、方便分离提纯，同时缩短了生产周期，提高了生产效率。该方法有待在氨基葡萄糖的工业生产中大量实施，具有巨大的工业应用前景。本发明筛选到阪崎肠杆菌Cronobacter sakazakii，克隆到高转化率的脱乙酰酶基因(命名为CsnagA)，该基因具有比工业中用于酶促转化法来源于大肠杆菌k-12的脱乙酰酶基因(简称EcnagA)构建的重组大肠杆菌(PET-24a-EcnagA/E.coli DE3(BL21))高的氨基葡萄糖的生产能力。在工业中用于酶促转化法生产氨基葡萄糖。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因，高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶克隆自阪崎肠杆菌中基因组，其包含有高产氨基葡萄糖的N-乙酰氨基葡萄糖(简称GlcNAc)脱乙酰酶基因(简称CsnagA)，通过基因重组转化大肠杆菌，构建重组工程菌pGEX-6p1-CsnagA/E.coli DE3(BL21)，该重组工程菌具有比现有工业中用于酶促转化法的来源于大肠杆菌k-12的脱乙酰酶基因(简称EcnagA)构建的重组大肠杆菌(PET-24a-EcnagA/E.coli DE3(BL21))具有高的氨基葡萄糖的生产能力。本发明进一步验证高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶生物功能，通过酶促转化法生产氨基葡萄糖，可显著提高生产效率，降低生产成本。

本发明的技术方案如下所述：

一株包含N乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因(CsnagA)的保藏编号为CCTCC NO：M2016162阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazaki)0360在高产氨基葡萄糖的工业酶促转化生产中的应用，包括以下步骤：

(1)CsnagA基因的扩增

根据NCBI库里报道Cronobacter sakazakii CMCC 45402的脱乙酰酶的DNA序列(GenBank no.NC_023032.1)，设计引物，分别在引物的5`端引入Bam HI和Xho I的酶切位点，扩增脱乙酰酶基因，扩增引物(酶切位点用下划线标出)如下：

正向引物(CsnagA-F):5’-(Bam HI)CGCGGATCCATGTACGCATTAACCCACGG，

反向引物(CsnagA-R):5’-(Xho I)CCGCTCGAG TTACTCAGTAACGACCTCGT；

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s；49.2℃退火30s；72℃延伸3min 30s，20个循环；72℃延伸10min。反应结束后，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

PCR反应体系：10×Taq DNA buffer，5μL；正向引物(10mM)，1μL；反向引物(10mM)， 1μL；基因组DNA，1μL；Taq DNA Polymerase(5U/μL)，1μL；dNTP(10mM)，1μL；加双蒸水至终体积50μL

以阪崎肠杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得基因CsnagA，其核苷酸序列和编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

(2)重组质粒载体pGEX-6p-1-CsnagA构建

将酶切后回收的CsnagA基因和pGEX-6p-1质粒载体进行连接，得到重组质粒；pGEX-6p-1-CsnagA；

(3)质粒的转化

用重组质粒pGEX-6p-1-CsnagA转化表达宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)，进行酶促生物合成，高效生产氨基葡萄糖。

本发明分离克隆到CsnagA基因来源于新疆塔里木盆地的土壤中分离得到的一株天然菌株阪崎肠杆菌0360，Cronobacter sakazakii 0360，于2016年4月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016162。该菌株含有作用于乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰酶(简称为CsNAGPase)，该酶属于金属依赖性水解酶家族(Clara etal.2005)。将CsnagA基因重组到pGEX-6p-1质粒表达载体(购自美国GE Healthcare公司)并位于GST标签后，可以在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)中进行异源表达，经纯化得到不含GST标签的目的蛋白，进行酶学性质测定和验证生物功能。

本发明分离克隆的脱乙酰酶基因(CsnagA)的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:1所示，该基因(CsnagA)序列长度为1149bp，共编码382个氨基酸，不含GST标签的目的蛋白分子大小是41.3kDa。本发明的CsNAGPase与现有的工业中用于酶促转化大的来源于大肠杆菌k-12的乙酰氨基葡萄糖6磷酸脱乙酰酶(简称EcNAGPase)序列的相似性最高为87％，目前工业中用于酶促转化法的是基因来源于大肠杆菌k-12的乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶基因构建的重组大肠杆菌，但是本发明的基因工程菌具有比现有的重组大肠杆菌具有更好的酶学性质。CsNAGPase的最适温度是50℃，最适pH是8.0，和EcNAGPase有相同的最适条件；CsNAGPase在40℃，50℃，60℃水浴锅中处理1h，剩余活性仍保持90％以上的活性，表现出很好的热稳定性。在70℃处理30min后残留35％的活性，处理1h，保持有25％的活性。将CsNAGPase置于不同pH缓冲液(0.2M Na₂HPO₄/0.1M柠檬酸，pH 4.0-8.0；0.05MNa₂B₄O₇·10H₂O/0.2M NaOH，pH 9.0-10.0)中，在30℃保温1h，在pH5-9范围内仍有超过80％的活性，表现出很好的pH耐受性。CsNAGPase具有比EcNAGPase更高的底物转化率，CsNAGPase在酶促反应2h后转化效率达到100％，EcNAGPase在反应5h后转化效率达到 60.75％，CsNAGPase(Co²⁺)在反应30min后转化率达到100％。CsNAGPase最大转化率比EcNAGPase高64.61％，转化效率是EcNAGPase的2.5倍；CsNAGPase(Co²⁺)转化效率是CsNAGPase的三倍。Co²+可以在不明显影响CsNAGPase的动力学常数的情况下，将转化效率提高三倍。Co²⁺对CsNAGPase有最大的激活作用，在工业应用上可以考虑将Co²⁺加入到工业生产的反应体系中。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1：是本发明分离的CsnagA的核苷酸序列，序列全长为1149bp，第1-1149bp处为编码区。

序列表SEQ ID NO:2：本发明分离的CsNAGPase的氨基酸序列，编码382个氨基酸。

序列表SEQ ID NO:3:本发明分离的阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)0360分类鉴定的16sDNA序列。

图1：本发明的技术流程图。

图2：本发明的起始质粒的图谱。

图3：本发明构建的重组质粒图谱。

图4：重组脱乙酰酶CsNAGPase的SDS-PAGE分析。附图标记说明：泳道M：为标准蛋白分子量；泳道1：为IPTG诱导的空载质粒GST蛋白；泳道：2为IPTG诱导的重组CsNAGPase上清；泳道：3为纯化的重组CsNAGPase蛋白。

图5：CsNAGPase最适pH检测。

图6：CsNAGPase最适温度检测

图7：CsNAGPase和EcNAGPase在不同时间的转化率检测。

图8：氨基葡萄糖结构式。

具体实施方式

实施例1产脱乙酰酶的天然菌株阪崎肠杆菌的筛选和16sDNA鉴定

在固体LB(1％的蛋白胨，0.5％酵母粉和1％氯化钠，0.4％的琼脂，pH7.0)平板上活化后，挑出单菌落在产酶培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠(NaCl)，3％乙酰氨基葡萄糖，0.5％酚红，0.4％的琼脂，pH7.0)平板上，37℃培养24小时后，挑取产生较大黄色透明圈的菌株。经对比试验，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室2014年筛选到一株来源于新疆土壤中分离的并经16sDNA鉴定为的阪崎肠杆菌属的阪崎肠杆菌。申请人将该分离菌株命名为阪崎肠杆菌0360，Cronobacter sakazakii 0360，于2016年4月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016162。对该菌株的分类地位进行后续研究。具体步骤如下所述.

扩增阪崎肠杆菌菌株的16sDNA的通用引物序列如下：

正向引物(27F)：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCA

反向引物(1492R)：3`-GGTTACCTTGTTACGACTT

PCR扩增体系如下：

PCR条件：95℃预变性4分钟；95℃40秒；52℃30秒；72℃60秒，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃5分钟结束。

PCR反应结束后，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。将扩增的基因经过回收后交送武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序鉴定，将测序结果分析提交到NCBI BLAST(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线分析工具，比对结果该菌株为阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)。扩增产物即为序列表SEQ ID NO：3所示的序列。

实施例2脱乙酰酶基因的克隆

1、提取阪崎肠杆菌的染色体DNA：

(1)将实施例1中筛选的阪崎肠杆菌菌株在LB液体培养基37℃摇床上培养12小时后，取1.5ml菌液于一灭菌Ep管中，在12000转/分钟离心机上离心1分钟,弃上清，收集菌体；

(2)用TE buffer(50mmol/LTris-HCl，pH8.0；10mmol/L的EDTA，pH8.0)洗菌体2次，之后加入50μl 100μg/ml溶菌酶(购于sigma公司)悬浮菌体，37℃水浴一小时，使溶菌酶充分发挥作用；

(3)加入上述总体积的2倍DNA裂解液(：20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-Cl(pH＝8.0)，2％SDS)，颠倒数次混匀，65℃水浴10min；

(4)放入-4℃冰箱10min(DNA复性)

(5)加入150μL 5M NaCl，颠倒混匀，在4℃放置30min，12000r/min离心10min；

(6)加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000r/min离心10min，抽提两次，弃下层，取上层；

(7)取步骤(5)的上清加入2/3体积的异丙醇轻轻混匀，4℃下12000r/min离心10min，弃上清；

(8)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤沉淀数次，弃上清，取沉淀；

(9)置于室温干燥后，加入20-50μL灭菌去离子水，置于-20℃保存备用。

2.目的基因的扩增：

根据NCBI数据库里报道的Cronobacter sakazakii CMCC 45402的脱乙酰酶的DNA序列(GenBank no.NC_023032.1)设计引物，以筛选到的阪崎肠杆菌抽提的总DNA为模板，扩增脱乙酰酶基因，扩增引物的DNA序列如下所示：

正向引物(nagA-F):5`-(BamHI)CGCGGATCCATGTACGCATTAACCCACGG，

反向引物(nagA-R):3`-(XhoI)CCGCTCGAGTTACTCAGTAACGACCTCGT；

引物序列的下划线部分为酶切位点。

PCR扩增体系如下：

PCR条件：95℃预变性4分钟；95℃40秒；60℃30秒；72℃60秒，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃5分钟结束。

3.利用碱裂解法抽提大肠杆菌质粒pGEX-6p1

(1)挑取单菌落接种于10mL含有抗性的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜；

(2)吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管，12000r/min离心1min，弃上清，收集菌体；

(3)加入100μL的溶液I，悬浮菌体；

(4)加入200μL的溶液Ⅱ，混匀；

(5)加入150μL的溶液Ⅲ，混匀，-20℃放置15min后，12000r/min离心10min，取上清；

(6)加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20℃放置20min后，12000r/min离心10min，取沉淀；

(7)加入70％乙醇，洗涤沉淀，弃上清；

(8)沉淀烘干后，加入20-50μL ddH₂O，置-20℃保存备用。

4.脱乙酰酶基因CsnagA和EcnagA PCR产物的回收、酶切、酶连和转化，构建重组质粒pGEX-6p1-CsnagA和pGEX-6p1-EcnagA

PCR产物回收、酶切步骤如下：

CsnagA和EcnagA的PCR产物分别通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带，用DNA纯化试剂盒(购自北京庄盟公司)回收PCR产物，用限制性内切酶Bam HI/XhoI(购自宝生物工程大连有限公司公司)酶解反应(100μl)，37℃过夜，双酶切，质粒载体pGEX-6P-1的制备条件和体系与上一致。

双酶切体系如下：

Bam HI(购自宝生物工程大连有限公司):3μl；

XhoI(购自宝生物工程大连有限公司):3μl；

10×K buffer:10μl；

DNA:70μl；

添加ddH2O到终体积100μl。

将酶切体系用DNA纯化试剂盒回收酶切产物，然后用T4连接酶4℃条件下过夜进行酶连。酶连体系如下：

电转化：取1μl酶连产物加入制备好大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态混合后加入预冷的电转杯(购自BioRad公司)进行电转，用2.1KV电压电击，迅速用500μl SOB复苏液在37℃摇床复苏1h，复苏后将菌液涂布于含有100μg/ml的Ampicillin(购自北京Transgene公司)的固体LB培养基，于37℃恒温培养箱培养过夜。次日，随机挑取转化子接种于10ml含有100μg/ml Ampicillin的液体LB培养基，于37℃恒温摇床过夜培养。待培养结束后，抽取质粒，以空载质粒pGEX-6p-1(购自美国GE Healthcare公司)为对照，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测鉴连接结果(重组质粒图谱见图3)。将鉴定正确的质粒送相关测序公司进行测序。

实施例3脱乙酰酶表达与纯化

1、重组脱乙酰酶在大肠杆菌诱导表达：

将重组质粒pGEX-6p1-CsnagA电转化E.coli BL21(DE3)进行表达纯化，转化步骤参照实施例2。将得到的转化子接种于100mL加有100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃培养过夜，以1％的接种量转接至1L含100μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃培养2-3hrs，使OD₆₀₀达到0.6-0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，在18℃，180转/分钟的摇床上培养14小时。在低温(4℃)高速(8000r/min)离心收集菌体，再在8000r/min下离心8min，然后用适量ddH₂O重悬菌体，在8000r/min下离心8min，再用磷酸盐缓冲液即PBS(配制方法：137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10.0mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，pH 7.4)洗涤2次，最后用50ml PBS悬浮，然后用高压破碎仪破碎细胞，收集细胞破碎液。于4℃、12000转/分钟离心机上离心50分钟，收集上清。对上清进行初步活性试验，用SDS-PAGE检测上清是否有目的蛋白表达。

2、GST亲和层析纯化蛋白：

将收集得到上清液进行亲和层析纯化(整个操作步骤在4℃冰箱内进行)，具体步骤如下：

(1)上柱：取l mL柱材料GST亲和配体Sepharose 4B至层析柱中，用50ml PBS缓冲液过柱，平衡柱材料。将洗净的柱材料与获得的上清蛋白液混合，放置在冰上振荡结合2h，使目标蛋白与配基充分结合，然后倒入纯化柱，反复上柱三次

(2)洗脱：用2L pH 7.0的PBS缓冲液过柱，流速控制在1mL/min左右，洗脱出没有结合的蛋白

(3)酶解：取10μl浓度为10个U/μl的3C蛋白酶(购自Pharmacia公司)与500μl的PBS缓冲液混匀，加入层析柱酶切，在4℃酶解16小时。

(4)收集蛋白：收集上次添加的PBS缓冲液，然后再加500μlPBS缓冲液第二次洗脱收集。PBS缓冲液中即溶有目的蛋白CsNAGPase。

(5)纯化蛋白保存：加入等体积100％的甘油(购自Sigma公司)与纯化的蛋白质充分混匀，小量分装于-20°保存。

3、利用SDS-PAGE检测重组脱乙酰酶纯度：

SDS-PAGE凝胶的制备：12％分离胶(下层胶)的配制：洗净烘干并固定好制备PAGE胶的1.0mm的胶板，按照下面的配方，按顺序依次在洁净烧杯中加入混匀。缓缓注入制胶板中，加入量大约为7mL，然后在其上层缓缓注入1～2mL去离子水至溢出，于37℃条件下放置约30min，待其凝固。待凝胶凝固后倾倒掉上层水，并用滤纸吸取残留的水和未凝聚的丙烯酰胺。

分离胶浓度为12％，配方如下：

5％浓缩胶(上层胶)的配制：按照以下溶液的先后顺序，在洁净烧杯中依次加入，混匀后，注入到分离胶上层，选择1.0mm的10孔梳子小心***浓缩胶中，于37℃下聚合凝固后，去掉胶条，轻轻拔去梳子待用。

浓缩胶浓度为5％，配方如下：

取10μl纯化的蛋白样品，加1/5体积的蛋白上样缓冲液(5×)，沸水浴10min，然后上样10μl电泳检测。SDS-PAGE电泳检测结果(图4)表明，纯化的蛋白为单一条带，大小为41.3kDa。4、脱乙酰酶CsNAGPase蛋白浓度测定：

根据Bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生工生物工程技术服务有限责任公司)说明书测定脱乙酰酶蛋白浓度。配制1mg/mL标准蛋白样品BSA，将其依次稀释成0，5，10，20，25，30，50，,60，100，150，200，250，300μg/mL浓度梯度，绘制标准曲线。取上述浓度的标准蛋白样品20μL加入到96孔板中，然后各加入新稀释的1×200μl Bradford试剂，于室温条件下反应5min。反应结束后，测其在A595nm的吸收值。以蛋白质的浓度为横坐标，吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。在相同体系以及反应条件下测定纯化的目的蛋白A595nm的OD值，根据标准曲线计算其浓度。最后计算获得脱乙酰酶浓度为1.6mg/ml。

实施例4脱乙酰酶的酶学性质的测定方法

1、脱乙酰酶最适pH测定方法：

采用荧光胺比色法测定生成氨基葡萄糖的含量(Huang and Hernick 2011)：荧光胺本身不能显荧光，可以和伯氨生成一种荧光物质，荧光胺不能跟底物乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)产生荧光，当与产物氨基葡萄糖反应时可以形成荧光，这种物质在发射光395nm，吸收光485nm处有吸收值，而且与产物的浓度呈直线关系，根据这一特点来测定脱乙酰酶产物的含量。

取2μl纯化的脱乙酰酶加入200μl用不同pH值缓冲液配制1mM的底物乙酰氨基葡萄糖(pH4.0-8，缓冲液为0.2M Na₂HPO₄/0.1M的柠檬酸缓冲液；pH 9.0-10.0的缓冲液为0.05M的Na₂B₄O₇·10H₂O，0.2M的NaOH)，50℃反应20min，然后加热终止，取100μl的反应终止液加入到96孔板中，再加入40μl 10mM荧光胺(FSA)(溶剂：乙腈)，反应20min之后，在多功能酶标仪下测定Ex 395nm，Em 485nm处的OD值，以最高酶活为100％，计算不同条件下的相对酶活。图5表明，CsNAGPase的最适pH为8.0，高于pH8，酶活迅速降低。在pH 9.0时只有20％左右的活性；在pH7.5时仍有85％的活性。

2、脱乙酰酶最适温度测定方法：

脱乙酰酶最适温度的测定是在pH 8.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(按常规方法配制)中以不同温度下测定酶活。图6表明CsNAGPase的最适温度为50℃。

3、脱乙酰酶的Km和Vmax测定方法：

采用反相高效液相色谱的方法来精确定量产物氨基葡萄糖，从而测定脱乙酰酶的Km和Vmax(Tekko et al.2006)。反相高效液相色谱的方法如下：用pH 8.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制不同浓度的乙酰氨基葡萄糖底物(0.1mM-50mM)，在50℃反应20min，加热终止反应，在进行酶促反应结束后要将产物GlcN进行柱前衍生，将酶促反应的反应终止液400μl或者氨基葡萄糖盐酸标准品(色谱级)于1.5ml Ep管中，加入100μl体积的100μg/ml浓度的氨基半乳糖盐酸(色谱级)作为内标，然后再加入0.3M的磷酸二氢钠/正磷酸250μl和200μl的甲醇(色谱级)，震荡混匀后静置15min后，加入250μl体积的1％PITC(溶剂：甲醇)，振荡器震荡摇匀，80℃反应30min，4℃冷却，在液相分析前用0.45μm的针筒过滤器将样品进行过滤，流速控制在1ml/min，柱温：30℃，流动相：甲醇：水：冰醋酸(体积比10:89.96:0.04)，在245nm检测衍生产物的峰面积，以此来计算脱乙酰酶的Km和Vmax。经测定，CsNAGPase Km，k_cat和k_cat/Km分别是0.020mol/L，3.66s-1，0.179s-1mM-1。

4、各种金属离子、化学试剂对脱乙酰酶活的影响测定：

各种金属离子和EDTA、SDS(终浓度为1mm、5mm)与脱乙酰酶混匀，然后按常规方法测定酶活。以对照酶活为100％，计算相对酶活。结果表明(表1)，Co²⁺，Zn²⁺，Mg²⁺(1mM)对脱乙酰酶有强烈的激活作用，SDS，Cu²⁺有强烈的抑制作用。

表1各种金属离子对脱乙酰酶活性的影响

5、脱乙酰酶转化率测定方法：

测定方法同Km和Vmax测定方法，根据液相色谱的测定结果计算不同浓度下的脱乙酰酶的转化率，与大肠杆菌中脱乙酰酶作对比，其结果如图7。CsNAGPase在酶促反应2h后转化效率达到100％，EcNAGPase在反应5h后转化效率达到60.75％，CsNAGPase(Co²⁺)在反应30min后转化率达到100％。CsNAGPase最大转化率比EcNAGPase高64.61％，转化效率是EcNAGPase的2.5倍；CsNAGPase(Co²⁺)转化效率是CsNAGPase的三倍。Co²⁺可以在不明显影响CsNAGPase的动力学常数的情况下，将转化效率提高三倍。因此本发明克隆的编码基因及其转化的大肠杆菌可望在在高产氨基葡萄糖的工业酶促转化生产中应用。

参考文献

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Claims

1.一株包含N乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因(CsnagA)的保藏编号为CCTCC NO：M 2016162阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazaki)0360在高产氨基葡萄糖的工业酶促转化生产中的应用，其特征在于包括以下步骤：

(1)CsnagA基因的扩增

根据NCBI库里报道的登陆号为Gene ID：565643472的Cronobacter sakazakii CMCC 45402的脱乙酰酶的DNA序列，设计引物，分别在引物的5`端引入Bam HI和Xho I的酶切位点，扩增脱乙酰酶基因，扩增引物(酶切位点用下划线标出)如下：

正向引物(CsnagA-F):5’-(Bam HI)CGCGGATCCATGTACGCATTAACCCACGG，

反向引物(CsnagA-R):5’-(Xho I)CCGCTCGAG TTACTCAGTAACGACCTCGT；

PCR反应体系：10×Taq DNA buffer，5μL；正向引物(10mM)，1μL；反向引物(10mM)，1μL；基因组DNA，1μL；Taq DNA Polymerase(5U/μL)，1μL；dNTP(10mM)，1μL；加双蒸水至终体积50μL

以阪崎肠杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得基因CsnagA,其核苷酸序列和编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

(2)重组质粒载体pGEX-6p-1-CsnagA构建

(3)质粒的转化

2.一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶基因，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶基因，它编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一株分离的阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazaki)0360，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016162。

5.一种用于高产氨基葡萄糖的酶促转化的重组大肠杆菌，其特征在于，该菌株包含有权利要求3所述的脱乙酰酶基因。