CN114096849A - 使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法 - Google Patents
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Abstract
[问题]检测循环肿瘤细胞的方法的提供。[解决手段]一种检测循环肿瘤细胞的方法,其包含以下的步骤:(a)在红细胞与白细胞的交联剂存在下对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了血细胞的被检样品的步骤;(b)在步骤(a)中制备的被检样品中,使病毒进行感染的步骤;(c)对步骤(b)中得到的被检样品进行标记的步骤;以及(d)从步骤(c)中得到的被检样品中,检测循环肿瘤细胞的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法。
背景技术
在外周血中循环的癌细胞(Circulating Tumor Cell;CTC)是离开实体肿瘤病灶,与血液一同在体内循环的癌细胞,与以往的肿瘤标记相比,有望成为更锐敏的癌早期诊断生物标记物。
端粒酶是参与细胞的永生化的酶,其在所有的癌细胞中都高度地活化。OBP-401(TelomeScan)是搭载有人类端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子以及GFP基因的基因编辑腺病毒(专利文献1:WO 2006/036004)。并且,使用该OBP-401简便地检测CTC的方法正在被开发(非专利文献1:Kojima T.,et al,J.Clin.Invest.,119;3172,2009)。
在该方法中,由于其感染癌细胞并增殖、而端粒酶活性依赖性地大量表达GFP,因此能够不依赖于细胞表面抗原而捕捉所有类别的“活着的”CTC。例如,即使是以下这样的CTC也能够检测到:发生了上皮间质转化(Epithelia l-Mesenchymal Transition;EMT)而使细胞表面抗原的表达的程度或有无发生了变化的CTC,其无法被以CellSearchTM为代表的、利用上皮细胞标记的以往的CTC检测法检测到。该EMT-CTC与癌干细胞的关联性强,被认为具有治疗抵抗性且恶性度高(非专利文献2:Science.2013Yu M et al.),近年来作为重要的生物标记物而受到瞩目。
然而,在使用了OBP-401的CTC检测法中的以往的血液预处理方法中,是将血液中的红细胞溶解后,通过离心分离除去红细胞残渣,由此对CTC进行浓缩的(非专利文献1)。
然而,在用以往的血液预处理方法浓缩CTC后利用OBP-401进行CTC检测的情况下,依然存在以下的问题:虽然对添加至血液中的癌细胞株具有极高的灵敏度,能够以高特异度进行检测,但实际想要从癌患者处采集的血液样品(以下,称为“临床检体”)中检测CTC时,灵敏度以及特异度会降低。
此外,非专利文献3的第4页公开了一般的CTC检测方法中的多种血液预处理方法以及其问题,其公开了:在使用了RosetteSepTM的血液预处理方法中,由于使用以多个细胞表面蛋白为靶标的抗体混合物,因此会在除去血细胞的同时连CTC一同除去,而使CTC的回收率降低。
此外,在使用了病毒的CTC检测方法中适用的血液预处理方法,特别是,就适宜用于从临床检体中检测CTC的血液预处理方法而言,目前为止还未被发现。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO 2006/036004
非专利文献
非专利文献1:Kojima T.,et al,J.Clin.Invest.,119;3172,2009
非专利文献2:Science.2013Yu M et al.
非专利文献3:Scientific reports.2016 07 19;6;28929
发明内容
本发明所解决的技术问题
如上所述,就使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法而言,需要开发一种从临床检体中也能够以高灵敏度、高特异度检测CTC的方法。
解决技术问题的技术手段
本发明者为了解决所述问题而进行了深入研究,结果发现:在使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法中,通过使用给定试剂从血液样品中分离红细胞以及白细胞,可以在除去血细胞的同时增加检测出的CTC的数量,其结果,即使在临床检体中也能够提高灵敏度以及特异度这两者,从而完成了本发明。
即,本发明如下:
[1]
一种检测循环肿瘤细胞的方法,其包含以下的步骤:
(a)在不与循环肿瘤细胞结合而与循环肿瘤细胞以外的细胞(非循环肿瘤细胞)结合的试剂的存在下,对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了所述非循环肿瘤细胞的被检样品的步骤;
(b)在步骤(a)中制备的被检样品中,使病毒进行感染的步骤;
(c)对步骤(b)中得到的被检样品进行标记的步骤;以及
(d)从步骤(c)中得到的被检样品中,检测循环肿瘤细胞的步骤。
[2]
[1]所述的方法,其中,
病毒为进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒。
[3]
[2]所述的方法,其中,
进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒为由端粒酶逆转录酶启动子控制的重组病毒。
[4]
[1]~[3]中任一项所述的方法,其中,
病毒包含荧光蛋白基因。
[5]
[1]~[4]中任一项所述的方法,其中,
与非循环肿瘤细胞结合的试剂为与白细胞结合的试剂。
[6]
[1]~[5]中任一项所述的方法,其中,
在步骤(a)中,白细胞的80~90%被除去。
[7]
[5]所述的方法,其中,
与白细胞结合的试剂为红细胞与白细胞的交联剂。
[8]
[7]所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为双重以上的特异性抗体。
[9]
[7]所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为双特异性抗体。
[10]
[9]所述的方法,其中,
双特异性抗体包含四聚体的抗体。
[11]
[8]~[10]中任一项所述的方法,其中,
双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
[12]
[8]~[10]中任一项所述的方法,其中,
双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
[13]
[7]~[12]中任一项所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为RosetteSep(TM)。
[14]
[13]所述的方法,其中,
RosetteSep(TM)的添加量为每3mL血液20~35μL。
[15]
[1]~[14]中任一项所述的方法,其中,
密度梯度离心用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。
[16]
[1]~[15]中任一项所述的方法,其中,
在步骤(a)、步骤(b)以及步骤(c)中的至少1个步骤中包含清洗细胞的步骤,至少1次的清洗细胞的步骤用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。
[17]
[1]~[16]中任一项所述的方法,其中,
在步骤(d)中,在检测循环肿瘤细胞之前,包含将被检样品供给至网眼为50~200μm的尼龙过滤器的步骤。
[18]
[1]~[17]中任一项所述的方法,其中,
在步骤(d)中,包含被检样品的溶液包含水溶性封入剂。
[19]
[1]~[18]中任一项所述的方法,其中,
步骤(c)中的被检样品的标记为细胞的免疫染色或核染色。
[20]
一种为了进行循环肿瘤细胞的检测而从血液样品中浓缩循环肿瘤细胞的方法,其包含:
在交联剂的存在下,对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了所述非循环肿瘤细胞的被检样品的步骤,所述交联剂为不与循环肿瘤细胞结合而与循环肿瘤细胞以外的细胞(非循环肿瘤细胞)结合的试剂。
[21]
一种循环肿瘤细胞的检测用样品的提供方法,其进一步包含:
在通过[20]所述的方法而制备的被验样品中,使病毒进行感染的步骤。
[22]
[21]所述的方法,其包含:
在使病毒进行感染后,进一步对被检样品进行标记的步骤。
[23]
[20]~[22]中任一项所述的方法,其中,
循环肿瘤细胞的检测是利用病毒的感染而进行的。
[24]
[20]~[23]中任一项所述的方法,其中,
病毒为进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒。
[25]
[24]所述的方法,其中,
进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒为由端粒酶逆转录酶启动子控制的重组病毒。
[26]
[20]~[25]中任一项所述的方法,其中,
病毒包含荧光蛋白基因。
[27]
[20]~[26]中任一项所述的方法,其中,
与非循环肿瘤细胞结合的试剂为与白细胞结合的试剂。
[28]
[20]~[27]中任一项所述的方法,其中,
白细胞的80~90%被除去。
[29]
[27]所述的方法,其中,
与白细胞结合的试剂为红细胞与白细胞的交联剂。
[30]
[29]所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为双重以上的特异性抗体。
[31]
[29]所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为双特异性抗体。
[32]
[31]所述的方法,其中,
双特异性抗体包含四聚体的抗体。
[33]
[30]~[32]中任一项所述的方法,其中,
双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
[34]
[30]~[32]中任一项所述的方法,其中,
双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
[35]
[29]~[34]中任一项所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为RosetteSep(TM)。
[36]
[35]所述的方法,其中,
RosetteSep(TM)的添加量为每3mL血液20~35μL。
[37]
[20]~[36]中任一项所述的方法,其中,
密度梯度离心用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。
[38]
[20]~[36]中任一项所述的方法,其中,
在密度梯度离心后包含清洗细胞的步骤,清洗细胞的步骤用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。
发明的效果
通过本发明,在使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法中,能够在除去血细胞的同时使检测出的CTC的数量增加,即使在临床检体中也以高灵敏度、高特异度检测CTC。此外,由于能够降低血细胞,CTC检测所需要的时间缩短,吞吐量提高,能够在不引起细胞的损伤的情况下,以低成本进行检测。
发明的效果
通过本发明,在使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法中,可以在除去血细胞的同时使检测出的CTC的数量增加,能够在临床检体中也以高灵敏度、高特异度检测CTC。此外,由于能够降低血细胞,CTC检测所需要的时间缩短,吞吐量提高,能够在不引起细胞的损伤的情况下,以低成本进行检测。
附图说明
[图1]是表示通过本申请发明的方法,在添加RosetteSepTM25ul的情况下,从临床检体中检测CTC的结果的图。
[图2]是表示通过本申请发明的方法,在添加RosetteSepTM50ul的情况下,从临床检体中检测CTC的结果的图。
[图3]是表示本申请发明的方法与以往方法的检测结果的比较的图。
[图4]是表示通过以往方法,进行健康人和肺癌患者的CTC的检测的比较的结果的图。
本发明的具体实施方式
本发明涉及检测循环肿瘤细胞的方法,包含以下的步骤:
(a)在红细胞与白细胞的交联剂的存在下对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了血细胞的被检样品的步骤;
(b)在步骤(a)中制备的被检样品中,使由端粒酶逆转录酶启动子控制的重组病毒进行感染的步骤;
(c)对步骤(b)中得到的被检样品进行免疫染色的步骤;以及
(d)从步骤(c)中得到的被检样品中,检测循环肿瘤细胞的步骤。
本发明中,在制备以重组病毒进行感染的被检样品前的血液样品的预处理步骤中,用与CTC以外的细胞结合的试剂进行处理,特别是,用红细胞与白细胞的交联剂进行处理,通过该处理,红细胞以及白细胞被除去,即使在临床检体中,也能够以高灵敏度、高特异度检测CTC。
此外在本发明中,除了所述交联剂处理之外,例如,通过在步骤(a)中的密度梯度离心步骤、在密度梯度离心后清洗细胞的步骤、步骤(b)中的病毒感染后固定细胞时或固定后清洗细胞的步骤、步骤(c)中的进行免疫染色时或免疫染色后清洗细胞的步骤等中使用含有FCS和EDTA的缓冲液;在检测循环肿瘤细胞的步骤中使用含水溶性封入剂的缓冲液;或标记细胞后使用网眼50~200μm的尼龙过滤器等,能够以进一步的高灵敏度、高特异度检测CTC。
以下,就本发明的步骤进行详述。
(1)血液预处理步骤
血液预处理是CTC的浓缩步骤。
对高吞吐量的检测***的构建而言,高效地除去血细胞是很重要的,因此在本发明中,为了血细胞的除去而进行以下的处理,对CTC进行浓缩。
首先,将采血而得的血液样品与给定的缓冲液混合,将该混合样品重层至事前充填了比重差分离液的密度梯度离心用的血细胞浓缩管中。作为使用的缓冲液,只要是具有渗透压和pH与体液相同、无细胞毒性的性质就无特别限定,但优选含有FCS和EDTA的缓冲液。例如,使用FCS为1%~5%的缓冲液,优选为2%。EDTA设为1~1.5mg/ml,优选设为1mg/ml的浓度。在本发明中,从能够降低CTC对血细胞浓缩管的吸附、提高CTC的回收率的观点出发,优选添加T缓冲液(至少,包含2%FCS、1mg/ml EDTA)而使用。T缓冲液可以从On-chipBiotechnologies处购入。需要说明的是,含有FCS和EDTA的缓冲液不仅可以用于步骤(a)中的密度梯度离心,也可以适宜地用于密度梯度离心后清洗细胞的步骤、步骤(b)中的病毒感染后固定细胞时或固定后清洗细胞的步骤、步骤(c)中的进行免疫染色时或免疫染色后清洗细胞的步骤等,能够降低管壁面上的CTC吸附、提高CTC的回收率。
血液样品和缓冲液的混合比例为血液样品:缓冲液=1:1~1:1.5,优选为1:1.3。
接下来添加不与CTC结合而与CTC以外的细胞(本说明书中,称为“非循环肿瘤细胞”或“非CTC”)结合的试剂,进行离心分离。
就不与CTC结合而与CTC以外的细胞(非CTC)结合的试剂而言,只要是在CTC以外的细胞与试剂结合的状态下进行密度梯度离心时和与试剂结合前相比,能够使该CTC以外的细胞变得容易形成沉淀,或和与试剂结合前相比,能够使其比重发生变化的物质就都可以使用。CTC中存在上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、细胞表面波形蛋白(cell-surface vimentin)等CTC特有的细胞表面标记。在本发明中,可以使用不识别这些细胞表面标记的试剂。
作为与试剂结合的CTC以外的细胞,优选为血细胞,例如可以举出红细胞、白细胞。试剂可以只与红细胞结合,可以只与白细胞,也可以以使红细胞和红细胞、白细胞和白细胞、红细胞和白细胞交联的形式进行结合,特别优选为红细胞与白细胞的交联剂。
作为与CTC以外的细胞结合的试剂,可以举出RosetteSepTM、PluriSpin(注册商标,PluriSelect公司)、Dynabeads(DYNAL公司)、blood cell separator nano(PCRopsis公司)等。
就PluriSpin(注册商标,PluriSelect公司)而言,白细胞等CTC以外的细胞通过与具有高亲和性的pluriSpin粒子结合而比重增加,之后通过离心分离的操作使其沉淀至离心管的底部。
作为红细胞与白细胞的交联剂,可以使用RosetteSepTM。作为RosetteSepTM,例如,可以举出:含有Anti-CD36的RosetteSepTMCTC富集抗体混合物(RosetteSepTMCTCEnrichment Cocktail Containing Anti-CD36)、RosetteSepTMCTC Enrichment CocktailContaining Anti-CD56、RosetteSepHuman CD45 Depletion Cocktail、RosetteSepTMHumanMonocyte Depletion Cocktail、RosetteSepTMHuman Granulocyte Depletion Cocktail等,其中,优选RosetteSepTMCTCEnrichment Cocktail Containing Anti-CD36。RosetteSepTM可以从STEMCELL Technologies处购入。
RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36包含:选自针对CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45或CD66b的抗体和针对作为红细胞的表面抗原的血型糖蛋白A(glycophorin A)的抗体中的双特异性的四聚体的抗体复合体(https://www.stemcell.com/products/rosettesep-ctc-enrichment-cocktail-containing-anti-cd36.html)。
RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD56包含:选自针对CD3、CD14、CD16、CD19、CD38、CD45、CD56、CD61或CD66b的抗体和针对作为红细胞的表面抗原的血型糖蛋白A的抗体的双特异性的四聚体的抗体复合体(https://www.stemcell.com/products/rosettesep-ctc-enrichment-cocktail-containing-anti-cd56.html)。
作为白细胞和红细胞的交联剂,可以使用双重以上的特异性抗体。作为双重以上的特异性抗体,可以使用RosetteSepTM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36以及RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD56中的任一种中使用的抗体。
关于交联剂的添加量,例如就RosetteSepTMCTC Enrichment CocktailContaining Anti-CD36而言,RosetteSepTM的贩卖者推荐相对于血液1ml添加50μL(参照STEMCELL Technologies公司Document#28583),但是这并非是以使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法为设想场景的条件,未能获得期待的结果。因此,本发明者们通过探讨,对使用了病毒的循环肿瘤细胞的检测方法中的交联剂的添加量进行了原创的重新摸索的结果,发现了能够以进一步的高灵敏度及高特异度检测CTC的条件。即,就交联剂的添加量而言,在使用RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36的情况下,优选相对于血液1ml为小于50ul,优选相对于血液3ml为超过12.5ul且小于50ul,更优选相对于血液3ml为20~35μL,特别优选相对于血液3ml为25μL。
如果使用交联剂,则血细胞会被除去。“除去”是指,以CTC的检测不会受到血细胞的存在所造成的阻碍,并且,CTC不会与血细胞一起被除去的程度而从试验体系中除去血细胞。
在该情况下,红细胞的90~99%被除去,优选为99%被除去。
此外,白细胞的80~90%被除去,优选为90%被除去。此处,如果白细胞的90%以上被除去,则存在CTC也和白细胞一起被除去(损失)的可能性,因此需要注意。因此,优选将白细胞的除去率停止在90%。
离心分离为密度梯度离心分离,作为比重差分离液,只要能够使红细胞和白细胞分离就无特别限制,例如,可以使用Ficoll-PaqueTM、LymphoprepTM等。作为Ficoll-PaqueTM,例如,可以举出Ficoll-PaqueTMPLUS、Ficoll-Paque TMPREMIUM、Ficoll-PaqueTM PREMIUM1.084、Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.073等,其中,优选为Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084。Ficoll-PaqueTM可以从GE health care处购入。LymphoprepTM可以从STEMCELLTechnologies处购入。离心分离以及细胞的清洗在600~900g、4~25℃下进行5~15分钟。例如,优选900×g、25℃下、10分钟的离心分离条件。
通过该离心分离,大部分的红细胞和白细胞会沉淀。
接下来,通过倾析,回收包含CTC以及残存白细胞的层。
(2)病毒感染步骤
在所述回收的CTC含有液样品中,使病毒进行感染。作为病毒,优选为进行肿瘤特异性增殖的病毒,更优选为由端粒酶逆转录酶启动子控制的重组病毒。此外,为了易于以感染了CTC的病毒为指标进行检测,优选病毒中包含荧光蛋白基因,更优选荧光蛋白基因以能够表达的形式而搭载。此外,作为病毒的种类,无特别限制,可以从腺病毒、疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼吸道肠道病毒、痘苗病毒、麻疹病毒等中适宜选择,其中优选腺病毒。作为该重组病毒,可以使用OBP-401(TelomeScan)(WO 2006/036004,Oncolys Biopharma株式会社)。
就病毒的感染量而言,在使用OBP-401的情况下,为1.0×108VP/mL,感染温度为25~37℃,优选为37℃。感染时间为23~25小时,优选为24小时。
感染后,根据需要,可以通过多聚甲醛等进行细胞固定以及病毒的灭活。在使用搭载有荧光蛋白基因的病毒的情况下,为了抑制在细胞内表达的荧光蛋白的溶出以及荧光降低,优选预先对细胞进行固定。
(3)标记步骤
对所述步骤(2)中得到的被检样品进行标记步骤。
标记步骤是指对含有被检样品的溶液中包含的CTC或血细胞等细胞进行标记的步骤;但也可以对细胞残渣或从细胞溶出的溶出物等细胞以外的成分进行标记。
细胞的标记可以使用公知的一般手法,例如,可以举出免疫染色、核染色等。作为免疫染色,例如,可以使用在抗体上连接有荧光色素、磁珠、生物素、琼脂糖珠、胶体金等的抗体。抗体可以根据目的而适宜选择,可以使用针对癌细胞特异性表达的蛋白质、血细胞特异性表达的蛋白质、组织特异性表达的蛋白质等的抗体。作为针对血细胞特异性表达的蛋白质的抗体,例如,可以举出抗CD45抗体、抗CD16抗体、抗CD36抗体、抗CD3抗体、抗CD14抗体、抗CD19抗体、抗CD38抗体、抗CD56抗体、抗CD61抗体、抗CD66b抗体等,其中,优选抗CD45抗体。作为荧光色素,例如,可以使用APC、PE、Cy5或FITC等。作为核染色,例如,可以使用DAPI或Hoechst等。
(4)CTC的观察以及检测步骤
接下来,在步骤(3)中得到的被检样品中观察CTC,进行检测。检测以病毒中搭载的荧光蛋白基因、免疫染色或核染色等中的荧光信号或染色信号为指标而进行。
在CTC的观察以及检测之前,也可以对被检样品进行使用尼龙过滤器进行的杂质除去处理。作为尼龙过滤器,优选网眼为50~200μm的尼龙过滤器,特别优选细胞过滤器。例如,网眼100μm的细胞过滤器可以作为pluriStrainer-Mini 100μm而从pluriSelect LifeScience处购入。
此外,在检测循环肿瘤细胞时,也可以向包含被检样品的溶液中添加水溶性封入剂、或将包含被检样品的溶液以加入了水溶性封入剂的缓冲液进行置换。通过使包含被检样品的溶液中含有水溶性封入剂,能够防止后述观察时的荧光色素的褪色。此外,通过使包含被检样品的溶液中含有水溶性封入剂,能够减轻孔内的液体的弯液面。其结果,显微镜观察时的视野变广,并且变清晰。
作为加入了水溶性封入剂的缓冲液,例如可以举出Fluoromount/PlusTM、Mount-Quick”Aqueous”、ProLongTMGlass Antifade Mountant等,其中优选Fluoromount/PlusTM。Fluoromount/PlusTM可以从Diagnostic BioSystems处购入。Mount-Quick”Aqueous”可以从大道产业株式会社处购入。ProLongTM Glass Antifade Mountant可以从Invitrogen处购入。
接着,向以poly-lysine等进行了涂层处理的多孔玻璃底板中装填被检样品,取得孔整个区域的显微镜图像,例如荧光图像以及明视野图像等。然后通过图像解析软件,计数CTC、进行检测。解析软件优选为能够定量地解析荧光亮度、面积等,并且具有自动计数功能的软件。
需要说明的是,CTC的观察以及检测并不限于显微镜观察,可以根据标记细胞的方法而适宜选择。
此外,本发明还涉及为了进行循环肿瘤细胞的检测而从血液样品中浓缩循环肿瘤细胞的方法,其包含在红细胞与白细胞的交联剂的存在下,对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了血细胞的被检样品的步骤。
作为浓缩循环肿瘤细胞的方法,可以适用上述的“检测循环肿瘤细胞的方法”中的“(1)血液预处理步骤”。
此外在本发明中,可以对所述“(1)血液预处理步骤”中得到的被检样品进一步进行所述“(2)病毒感染步骤”中所述的步骤,用病毒进行感染,将其作为用于循环肿瘤细胞的检测的样品而提供。提供时,也可以进一步进行所述“(3)标记步骤”中所述的步骤对被检样品进行标记。这些步骤可以独立进行,也可以两者连续进行。
作为在通过本发明的浓缩循环肿瘤细胞的方法浓缩循环肿瘤细胞后,检测循环肿瘤细胞的方法,除了利用病毒的感染的方法之外,也可以适用不利用病毒的感染的方法,但更优选利用病毒的感染的方法。关于利用病毒的感染的方法,可以适用上述的“检测循环肿瘤细胞的方法”中的“(2)病毒感染步骤”、“(3)标记步骤”、“(4)CTC的观察以及检测步骤”中记载的方法。作为不利用病毒的感染的方法,例如,可以适用以往公知的循环肿瘤细胞的检测方法,例如,可以使用利用了过滤器、微流路、免疫染色、介电泳、密度梯度离心、磁珠等的方法。
实施例
以下,将通过实施例对本发明进行进一步具体的说明。但是,本发明的范围不受这些实施例限制。
实施例1
1-1.CTC浓缩操作步骤
方法
使用试剂·器具如表1所示。
[表1]
作为临床检体,只要无特别记载,就是使用了从通过活检或手术而取得的肺组织的病理标本而确定为肺癌的患者处采集的血液。
1.比重差分离
<准备>
向SepMateTM-15中取5mL的比重液Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084,在300×g、设定温度25℃下离心5min(离心全部用摆动转子进行)
<步骤>
1.在FALCON 14mL圆形管(PP)内混合2%FCS/1%P.S/T缓冲液4mL、50mM EDTA·4Na/T缓冲液50μL、血液检体3mL
2.向预先准备的SepMateTM-15中添加稀释了的血液总量
(添加时以不搅乱比重液的液面的形式缓慢地添加)
3.向2%FCS/1%P.S/T缓冲液500μL中添加RosetteSepTM CTC EnrichmentCocktail Containing Anti-CD36 25μL,其是在即将开始比重差分离时添加(添加后以不搅乱比重液的液面的形式进行移液器吸取并搅拌)
4.在900×g、设定温度25℃下进行10min的离心(Brake为ON)
5.将2%FCS/1%P.S/PBS 25mL和2%FCS/1%P.S/T缓冲液5mL在50mL管内混合
6.以倾析将上清(隔膜之上的液体)回收至步骤5的50mL管中
7.在200×g、设定温度25℃下进行10min的离心
8.以抽吸器或移液管吸除上清至残液为5mL
9.以1000μL吸移管进行吸除直至残液为1mL
10.以移液器吸取使沉淀悬浮在残液中,回收至2.0mL管中
11.用10%FCS/1%P.S/DMEM 1mL清洗50mL管内部,将洗液加入步骤10的2.0mL管中
12.在300×g、设定温度25℃下进行5min的离心
13.用1000μL吸移管吸除上清
14.加入10%FCS/1%P.S/DMEM 900μL,用移液器吸取进行悬浮
2.OBP-401感染
以下的步骤在P2实验室内进行
<步骤>
1.向“2.比重差分离”的步骤13的管中添加OBP-401 1.0×108VP(in 100μL 10%FCS/1%P.S/DMEM)(最终液量:1mL)
2.用封口膜固定2.0mL管的盖子
3.将管装到孵育器内的旋转器上,在37℃、遮光下进行24(±1)小时的转倒搅拌
3.细胞固定
1.从孵育器内取出管,在300×g、设定温度25℃下进行5min的离心
2.以1000μL吸移管吸除上清
3.加入500μL的4%多聚甲醛/磷酸缓冲液,使沉淀悬浮
4.在室温、遮光下孵育10min
5.加入2%FCS/1%P.S/T缓冲液500μL,将全部液体移至新的1.5mL管中
6.以2%FCS/1%P.S/T缓冲液500μL清洗2mL管的内部,将洗液加入步骤5的1.5mL管中
7.在900×g、设定温度25℃下进行5min的离心
8.用1000μL吸移管吸除上清
9.加入2%FCS/1%P.S/T缓冲液1mL,使沉淀悬浮
10.重复步骤7和8
11.进入免疫染色步骤
4.基于CD45-PE抗体、DAPI的细胞染色
使用试剂·器具如表2所示。
[表2]
<准备>全部在当天准备
免疫染色液
将以下的试剂在1.5mL管内混合,保存在4℃、遮光条件下直至使用时
(i)CD45-PE抗体:20μL
(ii)DAPI:2μL
(iii)2%FCS/1%P.S/T缓冲液:176μL
观察用缓冲液
将以下的试剂在1.5mL管内混合,保存在遮光条件下直至使用时
(i)封入剂(Fluoromount/Plus):40μL
(ii)2%FCS/1%P.S/T缓冲液:360μL
96孔微孔板聚-L-赖氨酸涂层处理
1.向96孔微孔板中每1孔导入0.1%聚-L-赖氨酸溶液200μL,在RT下静置5min
2.以移液器吸出(回收聚-L-赖氨酸溶液,重复使用4次)
3.以DDW 200μL清洗孔内,以移液器吸出
4.重复步骤3
5.以移液器吸出
6.在超净工作台内使其风干
<步骤>
1.将膜透过处理液0.15%Triton X-100/10%FCS/T-缓冲液200μL添加至细胞沉淀中,以移液器吸取进行悬浮
2.在RT、遮光下孵育10min
3.添加2%FCS/1%P.S/T缓冲液1mL
4.将悬浮液移至新的1.5mL管中
5.在900×g、设定温度25℃下进行5min的离心
6.除去上清
7.添加2%FCS/1%P.S/T缓冲液1mL,以移液器吸取进行悬浮
8.在900×g、设定温度25℃下进行5min的离心
9.除去上清
10.加入免疫染色液200μL,以移液器吸取进行悬浮
11.在RT、遮光下孵育30min
12.加入2%FCS/1%P.S/T缓冲液1mL
13.在900×g、设定温度25℃下进行5min的离心
14.除去上清
15.加入4%PFA 200μL,以移液器吸取进行悬浮
16.在RT、遮光下孵育10min
17.加入2%FCS/1%P.S/T缓冲液200μL
18.将100μm细胞过滤器(pluriStrainer-Mini 100μm)装入新的1.5mL管中
19.将细胞液导入细胞过滤器,以桌上离心机进行冲洗
20.以2%FCS/1%P.S/T缓冲液200μL清洗步骤18的管
21.将洗液以与步骤19同样的方式通过100μm细胞过滤器
22.加入2%FCS/1%P.S/T缓冲液900μL
23.在900×g、设定温度25℃下进行5min的离心
24.除去上清
25.加入观察用缓冲液200μL,以移液器吸取进行悬浮
26.在96孔玻璃底板上,分别移液100μL至2个孔中
27.以观察用缓冲液200μL清洗步骤25的管,分别将100μL洗液添加至步骤26的孔中
28.以显微镜观察
29.将DAPI(+)/GFP(+)/CD45(-)细胞判定为CTC
<结果>
图1表示在添加RosetteSepTM 25ul的情况下的、从肺癌患者血液和健康人的血液3mL中检测到的CTC数的图表。在图1中,各图表表示对同一检体实施2次试验而得的平均值。
在来源于肺癌患者血液的全部阶段中,都高灵敏度地检测到了CTC。另一方面,健康人血液的平均检测个数与肺癌患者血液相比压倒性地低,可见本方法为高特异度的检测法。
图1的肺癌患者的结果的汇总如表3所示。
以下的实验结果中,灵敏度是以在经过检查的检体中,CTC>0个(同一检体的2次试验中至少一次检测到了CTC)的检体的比例的形式而算出的。特异度是以在健康人检体中,CTC=0个(同一检体的2次试验都没有检测到CTC)的检体的比例的形式而算出的。
如表3所示,在实施例1中,肺癌全部阶段的灵敏度为92.3%,特异度为76.2%。
需要说明的是,在将CTC≥1.0个设定为CTC阳性检体、将CTC<1.0个设定为阴性检体的情况下,实施例1的肺癌全部阶段的灵敏度为88.5%,特异度为90.5%。
此外,在将CTC≥2.0个设定为CTC阳性检体、将CTC<2.0个设定为阴性检体的情况下,实施例1的肺癌全部阶段的灵敏度为78.8%,特异度为95.2%。
如此,通过适宜地设定截断值,能够提供灵敏度或特异度的任一方进一步提高的CTC检测方法。
此外,同一患者检体中的血清CEA和本检测法中的CTC的阳性率的比较结果如表4所示。可以看出与血清CEA相比,CTC能够以更高的灵敏度进行检测。
[表3]
表4 CEA肿瘤标记与CTC检测性能的比较
全部阶段:52病倒
阶段0和I:29病倒
实施例2
在实施例1的“1.比重差分离”中,除了将添加25μL的RosetteSepTMCTC EnrichmentCocktail Containing Anti-CD36改为添加50μL之外,以与实施例1同样的方法进行了CTC的检测。
<结果>
图2表示在添加了RosetteSepTM 50μL的情况下,从肺癌患者血液和健康人的血液3mL中检测到的CTC数的图表。在图2中,各图表表示对各检体实施2次试验而得的平均值。
图2的肺癌患者的结果的汇总如表5所示。在实施例2中,肺癌全部阶段的灵敏度为43.5%,特异度为100%。
[表51
实施例3
在实施例1的“1.比重差分离”中,除了将添加25μL的RosetteSepTMCTC EnrichmentCocktail Containing Anti-CD36改为添加12.5μL之外,以与实施例1同样的方法进行了CTC的检测。
<结果>
由于血细胞过多而无法测定。
[比较例1]
<PBMC部分的回收以及病毒感染>
作为临床检体,只要无特别记载,就是使用了从通过活检或手术而取得的肺组织的病理标本而确定为肺癌的患者处采集的血液。
将被检者的血液7.5mL采集至加入了CPD(Citrate Phosphate Dextrose)溶液的真空采血管中,保持在15-25℃下。在采血后24小时以内,相对于7.5mL的血液,使用120mL的红细胞裂解液(Red blood cell lysis buffer)(Sigma-Aldrich),进行红细胞的溶血,通过离心回收外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells)(包含有PBMCs、CTC的白细胞部分)。使用加入了10%血清的培养基清洗2次回收的PBMCs。将清洗的PBMCs悬浮至1mL的加入了10%血清的培养基中,加入3×106pfu的OBP-401,在37℃下培养24小时后,进行下述染色。
<CD45免疫染色>
将感染结束后的PBMCs通过离心而回收,以加入了10%血清的PBS进行10分钟的封闭,以抗CD45抗体(BioLegend,304002)进行30分钟的1次抗体反应。通过清洗去除1次抗体,以荧光标记的2次抗体(Invitrogen,A21235)进行30分钟反应后,以4%多聚甲醛进行10分钟的固定。
<检体的解析>
将进行了所述CD45免疫染色的检体分注至96孔板中,用荧光显微镜(Olympus,IX71)进行观察。为了高效地进行观察,首先通过FITC filter探测OBP-401来源的GFP阳性细胞,对于检测到的GFP阳性细胞进行了GFP、CD45染色图像以及明视野的图像取得。将GFP(+)/CD45(-)细胞判定为CTC。
<结果>
图3表示实施例1与比较例1中从肺癌患者血液3mL检测到的CTC数的比较。实施例1更能够以高灵敏度检测CTC。
图4是表示对于比较例1,在区分肺癌患者和健康人的情况下的CTC数的比较的图(左),以及计算灵敏度和特异度的结果的图(右)。
图3以及图4的肺癌患者的结果的汇总如表6所示。在比较例1中,肺癌全部阶段的灵敏度为73.3%,特异度为22.2%。
[表6]
实施例4
T-缓冲液对CTC检测率的效果
实施例1中,代替临床检体,使用将调整了细胞数的100个左右的癌细胞株添加至3mL的健康人的血液中而得的峰模型(Spike model),进行了评价。
1.峰模型作制
峰模型是指,将活着的癌细胞株在调整了细胞数后添加至血液中(峰)的模型样品。在本实施例中,对于用24孔培养用板培养A549的情况制作了峰模型。
<步骤>
1.以实验当天达到60~80%汇合状态的形式培养细胞
2.除去培养基上清,以PBS(-)进行2次清洗
3.添加AccutaseTM 200μL,在室温下反应5min
(确认在显微镜下细胞的形状变圆,开始剥离)
4.添加10%FCS/1%P.S/DMEM 850μL,以移液器吸取使细胞剥离
5.将细胞悬浮液回收至1.5mL管中,在300×g、设定温度25℃下进行5min的离心
6.吸除上清,添加PKH26溶液(Diluent C:125μL+PKH26:0.5μL),以移液器吸取进行悬浮
7.在室温下反应2min
8.添加10%FCS/1%P.S/DMEM 1mL,在300×g、设定温度25℃下进行5min的离心
9.吸除上清,添加10%FCS/1%P.S/DMEM 1mL,以移液器吸取进行悬浮
10.以10%FCS/l%P.S/DMEM制作步骤9的细胞悬浮液的稀释系列,以使得100吐中包含目标细胞数的形式进行调整
11.将稀释的细胞悬浮液100吐添加至96孔板中,静置30分钟,直至细胞沉至板底面
12.用荧光显微镜计数以PKH26标记的细胞数
13.计数后,将孔内的细胞悬浮液总量添加至实施例1“1.比重差分离”的步骤1的管中
14.在荧光显微镜下对孔内残存的细胞数进行计数
(峰数=步骤12中计数的细胞数-步骤14中计数的细胞数)
以下,以与实施例1相同的步骤处理样品,对细胞株进行了检测。
此外,在实施例1中添加了T缓冲液的全部的步骤中,添加PBS代替T缓冲液,以此作为比较对象。
<结果>
检测率的结果如表7所示。
[表7]
缓冲液 | 检测率(%) |
T缓冲液 | 68.8 |
PBS | 59 |
与添加了PBS的情况相比,在添加了T缓冲液的情况下,癌细胞株的检测率得到了提高。
Claims (38)
1.一种检测循环肿瘤细胞的方法,其包含以下的步骤:
(a)在不与循环肿瘤细胞结合而与循环肿瘤细胞以外的细胞(非循环肿瘤细胞)结合的试剂的存在下,对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了所述非循环肿瘤细胞的被检样品的步骤;
(b)在步骤(a)中制备的被检样品中,使病毒进行感染的步骤;
(c)对步骤(b)中得到的被检样品进行标记的步骤;以及
(d)从步骤(c)中得到的被检样品中,检测循环肿瘤细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,
病毒为进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,
进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒为由端粒酶逆转录酶启动子控制的重组病毒。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,
病毒包含荧光蛋白基因。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法,其中,
与非循环肿瘤细胞结合的试剂为与白细胞结合的试剂。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法,其中,
在步骤(a)中,白细胞的80~90%被除去。
7.根据权利要求5所述的方法,其中,
与白细胞结合的试剂为红细胞与白细胞的交联剂。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为双重以上的特异性抗体。
9.根据权利要求7所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为双特异性抗体。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,
双特异性抗体包含四聚体的抗体。
11.根据权利要求8~10中任一项所述的方法,其中,
双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
12.根据权利要求8~10中任一项所述的方法,其中,
双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
13.根据权利要求7~12中任一项所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为RosetteSep(TM)。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,
RosetteSep(TM)的添加量为每3mL血液20~35μL。
15.根据权利要求1~14中任一项所述的方法,其中,
密度梯度离心用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。
16.根据权利要求1~15中任一项所述的方法,其中,
在步骤(a)、步骤(b)以及步骤(c)中的至少1个步骤中包含清洗细胞的步骤,至少1次的清洗细胞的步骤用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。
17.根据权利要求1~16中任一项所述的方法,其中,
在步骤(d)中,在检测循环肿瘤细胞之前,包含将被检样品供给至网眼为50~200μm的尼龙过滤器的步骤。
18.根据权利要求1~17中任一项所述的方法,其中,
在步骤(d)中,包含被检样品的溶液包含水溶性封入剂。
19.根据权利要求1~18中任一项所述的方法,其中,
步骤(c)中的被检样品的标记为细胞的免疫染色或核染色。
20.一种为了进行循环肿瘤细胞的检测而从血液样品中浓缩循环肿瘤细胞的方法,其包含:
在交联剂的存在下,对血液样品进行密度梯度离心处理而制备除去了所述非循环肿瘤细胞的被检样品的步骤,所述交联剂为不与循环肿瘤细胞结合而与循环肿瘤细胞以外的细胞(非循环肿瘤细胞)结合的试剂。
21.一种循环肿瘤细胞的检测用样品的提供方法,其包含:
在通过权利要求20所述的方法而制备的被验样品中,进一步使病毒进行感染的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法,其包含:
在使病毒进行感染后,进一步对被检样品进行标记的步骤。
23.根据权利要求20~22中任一项所述的方法,其中,
循环肿瘤细胞的检测是利用病毒的感染而进行的。
24.根据权利要求20~23中任一项所述的方法,其中,
病毒为进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒。
25.根据权利要求24所述的方法,其中,
进行肿瘤细胞特异性增殖的病毒为由端粒酶逆转录酶启动子控制的重组病毒。
26.根据权利要求20~25中任一项所述的方法,其中,
病毒包含荧光蛋白基因。
27.根据权利要求20~26中任一项所述的方法,其中,
与非循环肿瘤细胞结合的试剂为与白细胞结合的试剂。
28.根据权利要求20~27中任一项所述的方法,其中,
白细胞的80~90%被除去。
29.根据权利要求27所述的方法,其中,
与白细胞结合的试剂为红细胞与白细胞的交联剂。
30.根据权利要求29所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为双重以上的特异性抗体。
31.根据权利要求29所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为双特异性抗体。
32.根据权利要求31所述的方法,其中,
双特异性抗体包含四聚体的抗体。
33.根据权利要求30~32中任一项所述的方法,其中,
双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
34.根据权利要求30~32中任一项所述的方法,其中,
双重以上的特异性抗体为针对CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b或血型糖蛋白A的抗体。
35.根据权利要求29~34中任一项所述的方法,其中,
红细胞与白细胞的交联剂为RosetteSep(TM)。
36.根据权利要求35所述的方法,其中,
RosetteSep(TM)的添加量为每3mL血液20~35μL。
37.根据权利要求20~36中任一项所述的方法,其中,
密度梯度离心用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。
38.根据权利要求20~36中任一项所述的方法,其中,
在密度梯度离心后包含清洗细胞的步骤,清洗细胞的步骤用含有FCS和EDTA的缓冲液进行。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220225 |