TWI745939B

TWI745939B - 偵測周邊血液中ｅｇｆｒ基因突變腫瘤細胞之方法

Info

Publication number: TWI745939B
Application number: TW109113267A
Authority: TW
Inventors: 謝佳訓; 林鴻至; 潘文明; 吳旻憲; 陳冠宇; 王宏銘; 林永昌; 廖俊達; 閻紫宸
Original assignee: 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2021-11-11
Also published as: TW202140797A

Abstract

一種偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，利用血球分離技術及使用螢光接合抗體純化出標的細胞，接著再採用即時定量PCR(real-time PCR)結合溫控模組對標的細胞進行檢測，即可偵測血液中循環腫瘤細胞的EGFR基因突變。

Description

偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法

本發明係關於一種偵測血液中微量腫瘤細胞之方法，特別是針對周邊血液中帶有EGFR基因突變的腫瘤細胞之偵測方法。

已知血液中不到百分之一是廣義白血球，如單核球，淋巴球，嗜中性球等等，最終可能不到萬分之一的比例是標的腫瘤細胞；因此，想要獲得標的腫瘤細胞就需要經過層層篩選。循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)在癌症病患血液中非常稀少，循環腫瘤細胞在癌症病患血液中的數量多寡與特性被認為與癌症轉移及癌症復發息息相關。習知係利用免疫化學方式辨識及定量全血中之循環腫瘤細胞，以評估癌症程度與治療反應，其中，辨識包括正選擇(positive selection)及負選擇(negative selection)。

實務上，正選擇經常搭配負選擇合併使用。使用的免疫辨識套組為上皮細胞黏合蛋白(EpCAM)、細胞角質蛋白(cytokeratin)8(CK8)、細胞角質蛋白18(CK18)、細胞角質蛋白19(CK19)及CD45。從全血中計算EpCAM+、CK8+、CK18+、CK19+和CD45-表現的循環腫瘤細胞數目，但此方法因有大量血球細胞干擾，且並非所有腫瘤細胞皆會表現EpCAM+、CK8+、CK18+及CK19+，所以腫瘤細胞的捕捉效率較低、專一性亦不佳，且耗費大量抗體導致實驗費用高昂。另一相關技術係將血液中血球細胞去除，再利用免疫化學方式辨識循環腫瘤細胞，再經由磁性流體捕捉具免疫辨識之腫瘤細胞，其使用之免疫抗體套組為EpCAM、表皮生長因素受體(EGFR)、人類表皮生長因素受體(HER2)及鈣粘蛋白(N-cadherin)辨識捕捉腫瘤細胞。由磁性流體方式僅能捕捉腫瘤細胞，但無法直接提供科學化的定量方式。

上述偵測技術皆以抗原抗體直接辨識腫瘤細胞，但偵測到的循環腫瘤細胞數目並不多，在數量上若有些微誤差，將容易導致偽陽性或偽陰性的結果，造成錯誤判斷等問題。由於周邊血液中腫瘤細胞稀少，故開發有效偵測周邊血液中循環腫瘤細胞的技術，使檢驗結果的靈敏度(sensitivity)及特異性(specificity)大幅度提升有其必要性。

為改善先前技術之缺失，本發明提供一種偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，該方法係利用去除血球細胞技術以及使用螢光接合專一抗體來純化周邊血液中循環腫瘤細胞，再採用即時定量PCR(real-time PCR)搭配溫控模組進行檢測。經由本發明偵測周邊血液循環腫瘤細胞之表皮生長因子受體(EGFR)突變分析，有助於提供臨床癌症病患用藥參考與治療追踨。

本發明為一種偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，包括：

步驟a. 取得周邊血液檢體；

步驟b. 去除血液中之紅血球；

步驟c. 使用CD45抗體及CD235a抗體排除檢體中非標的細胞之白血球；

步驟d. 添加至少一種辨識腫瘤細胞的螢光接合專一抗體至血液中，將上述抗體與步驟c收集得到表現微弱或不表現CD45及CD235a之白血球細胞結合，並純化出表現螢光的標的細胞；

步驟e. 將上述表現螢光的標的細胞進行去氧核醣核酸的萃取，並在即時定量PCR(real-time PCR)中結合溫控模組，對上述細胞使用至少三組由高溫以預定時間下降預定溫度至低溫，接著再從低溫以預定時間上升預定溫度回到高溫，而形成至少三段式的溫差區間變化；

步驟f. 偵測到EGFR基因突變腫瘤細胞。

藉由上述方法，本發明之效果能提供準確偵測循環腫瘤細胞，且有效排除非目標細胞之干擾；此外，若純化出的循環腫瘤細胞含有微量突變DNA，可被本發明所設計的EGFR基因突變DNA增幅反應偵測到；若純化出的循環腫瘤細胞不含有微量突變DNA，則不會有非專一性的訊號產生。

S1:步驟a

S2:步驟b

S3:步驟c

S4:步驟d

S5:步驟e

S6:步驟f

S11:第一段溫差區間步驟

S12:第二段溫差區間步驟

S13:第三段溫差區間步驟

〔圖1〕係本發明偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法流程圖

〔圖2〕係本發明揭露的三段式溫差區間變化之方法流程圖

〔圖3〕係本發明使用區間溫度以SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2針對EGFR exon 18基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖4〕係本發明使用單一溫度以SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2針對EGFR exon 18基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖5〕係本發明使用單一溫度以SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2針對EGFR exon 18基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖6〕係本發明使用單一溫度以SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4針對EGFR exon 19基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖7〕係本發明使用區間溫度以SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6針對EGFR exon 20基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖8〕係本發明使用單一溫度以SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6針對EGFR exon 20基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖9〕係本發明使用單一溫度以SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6針對EGFR exon 20基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖10〕係本發明使用區間溫度以SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8針對EGFR exon 21基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖11〕係本發明使用單一溫度以SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8針對EGFR exon 21基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

〔圖12〕係本發明使用單一溫度以SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8針對EGFR exon 21基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果

充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明，說明如後：

參閱圖1，揭露一種偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，包括：

步驟a S1. 取得周邊血液檢體。可利用EDTA採取周邊血液檢體約10ml左右。

步驟b S2. 去除血液中之紅血球。先添加固定密度之液體(如ficoll-paque)再離心上述周邊血液檢體，離心可將紅血球及血漿分開形成分層，其中間會分離出一層膚色血球層(buffy coat)，取出膚色血球層(buffy coat)，其成分為周邊血液單核球細胞(peripheral blood monocytic cell，PBMC)，可利用物理分離(physical separation)或化學去除的方式裂解紅血球，在裂解紅血球的部分，可利用滲透壓原理，紅血球屬於無核脆弱之細胞，配置適當濃度的反應試劑可裂解紅血球，僅保留PBMC。物理分離的步驟包括：1.取一可造成細胞密度差異分離之物質，如蔗糖或其他多醣類，將含有PBMC的血液緩慢加入此物質，使其交界液面不受到擾動。這一混合液中，此物質與血液的體積比為1：1；2.離心(3000g)30分鐘，使該混合液分層，最上層為血清層，中層為透明溶液層，底層為紅血球層；3.取血清層與透明溶液層之間乳白色交界的PBMC；4.以細胞培養液沖數次後，獲得不含紅血球之血液。而化學去除係利用滲透壓(osmotic pressure)原理，使血液中無細胞核的紅血球脹破，有細胞核的白血球保留，步驟包括：1.配製紅血球裂解緩衝液1000g(8.30g的氯化銨(NHCl4)、1.18g的碳酸氫鈉(NaHCO3)、1.00g 0.1重量莫爾濃度的乙二胺四乙酸(EDTA)、加入無菌去離子水(ddH2O)至1000g)，調整pH值至7.3，並以無菌過濾膜過濾；2.混合紅血球裂解緩衝液與含有PBMC的血液，其體積比為10：1，靜置5分鐘；3.離心(400g)10分鐘；4.去除上清液後加入10毫升之細胞培養液沖洗一次；5.再次離心(400g)10分鐘；6.去除上清液後，剩餘的即為白血球細胞。

步驟c S3. 使用CD45抗體及CD235a抗體排除檢體中非標的細胞之白血球。由於PBMC仍有多種細胞，且大部分的細胞屬於非標的細胞；因此，需再加入5-100μl「奈米磁珠結合CD(cluster of differentiation)45抗體」及5-100μl「奈米磁珠結合CD235a抗體」排除非標的細胞。CD45抗體係用以辨識非標的細胞(表現CD45之白血球)，換言之，CD45之四尾雙聚體辨識白血球，用以去除血液檢體中所有表現CD45的白血球細胞，經過磁鐵或磁場處理，所有被「奈米磁珠-CD45抗體」吸引的細胞將會被其抓住，未被抓住的細胞可通過磁場，通過磁場的細胞即包括標的細胞。同時使用CD235a抗體作為輔助，能針對紅血球進行與CD45抗體相通原理之處置，即使用CD235a之四尾雙聚體辨識紅血球，以排除紅血球干擾。此外，PBMC常表現上皮細胞黏合蛋白，而使用細胞角質蛋白是因為此蛋白常表現於表皮細胞上，通常腫瘤細胞起源於表皮細胞。上述中，可再加入細胞核染劑更進一步地排除紅血球，如DAPI、Hoechst、Drag 5或Syto 62，細胞核染劑可確認有核細胞，因此可排除紅血球，但不會排除其他細胞。

步驟d S4. 添加至少一種辨識腫瘤細胞的螢光接合專一抗體至血液中，將上述抗體與步驟c S3收集得到表現微弱或不表現CD45及CD235a之白血球細胞結合，並利用微流體多參數細胞分選儀(On-Chip Sort)定量、純化與分離表現螢光接合抗體之標的細胞。利用螢光接合專一抗體加強辨識標的細胞及挑選標的細胞，亦即將螢光接合專一抗體與不表現CD45和CD235a之標的細胞結合，其中該螢光接合專一抗體包括波型蛋白(Vimentin)、鈣粘蛋白(Cadherin)、CD133、CD44、纖連蛋白(Fibronectin)、p16(INK4A)、Snail1、Snail2(Slug)、上皮細胞黏合蛋白(EpCAM)或細胞角質蛋白(cytokeratin,CK)。上述所提到的微流體多參數細胞分選儀係用於分選細胞的儀器，可對細胞表面或內部表現抗原蛋白質用特殊螢光標誌染色，細胞通過流道時可被特定波長的雷射激發螢光，再由接收器接收螢光。本發明所使用的微流體多參數細胞分選儀之特點在於採用拋棄式微流道晶片，樣本會接觸到的範圍就只有在此晶片內，因此可形成完全封閉的空間，適合分析、分選少量細胞。分選係以空氣壓控制液體流動(flow shift)方式，僅在晶片內進行細胞分選：以鞘液挾帶樣本流動，在雷射檢出目標螢光訊號時，橫向的空氣壓會將液體推入收集槽的系統。此系統可將細胞回收損失最小化，特別是對於目標細胞在極少數的情況。由步驟d S4所得之螢光接合專一抗體結合不表現CD45和CD235a之標的細胞，利用微流體多參數細胞分選儀將發出螢光的細胞以及沒有發出螢光的細胞分流，專一純化出具螢光表現之標的細胞集中回收至微量分裝管中，接著在微量分裝管中加入核酸萃取試劑，進行標的細胞去氧核醣核酸之萃取。

步驟e S5. 將上述表現螢光的標的細胞進行去氧核醣核酸的萃取，並在即時定量PCR(real-time PCR)檢測突變基因分型。生長因素受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的基本型態受體若接受一分子的細胞成長激素刺激，可啟動一分子的成長效果，而突變型態的EGFR可能接受一分子的細胞成長激素刺激，卻啟動一百個分子的成長效果，亦即下游產生過度的訊息傳遞，造成過度活化。EGFR的突變情況有多種，本發明係針對DNA表現序列(exon)18、19、20及21的突變進行測定，使用以EVA Green螢光染劑為基礎的即時定量PCR可檢測到微量的細胞DNA存在，其原理是使用非專一性螢光物質接合在DNA片段上，借由機器的激發發出螢光，而未接合於DNA片段上的螢光物質則不會發出螢光。利用即時定量PCR的方式，搭配聚合酶連鎖反應器及本發明所設計之核酸引子進行DNA增幅反應，並結合溫控模組，對上述細胞使用至少三組由高溫以預定時間下降預定溫度至低溫，接著再從低溫以預定時間上升預定溫度回到高溫，而形成至少三段式的溫差區間變化。上述中，即時定量PCR係利用核酸引子(primer)的專一性，辨識核酸序列(DNA sequence)的特定位置，藉由PCR的核酸放大技術，放大特定片段，而同時利用即時定量PCR的螢光呈現強度反映放大出來的核酸片段數量。一組核酸引子包含一前置引子(forward primer)及一反置引子(reverse primer)，認定為一片段的頭尾，頭尾所包圍的一段核酸即放大的目標特定片段。

步驟f S6. 偵測到EGFR基因突變腫瘤細胞。

參閱圖2，揭露所述至少三段式的溫差區間之步驟包括：

第一段溫差區間步驟S11：先升溫至第一溫度定值並控溫維持第一預定時間後，溫度下降至第二溫度定值作為起點，並以每個循環下降第一預定溫度定值至第三溫度定值，維持在所述第三溫度定值進行至少30次循環，所述第一溫度定值高於所述第二溫度定值，所述第二溫度定值高於所述第三溫度定值。

第二段溫差區間步驟S12：所述第三溫度定值上升至第四溫度定值並維持第二預定時間，所述第四溫度定值的溫度小於所述第一溫度定值，且所述第四溫度定值大於所述第三溫度定值。

第三段溫差區間步驟S13：所述第四溫度定值升溫至所述第一溫度定值並持續第三預定時間，接著再以每秒下降第二預定溫度定值至 65℃並維持第四預定時間，接著再以每秒上升第三預定溫度定值至所述第一溫度定值，最後再以每秒下降第四預定溫度定值至40℃並維持第五預定時間。

其中，所述第一溫度定值為92~98℃範圍內的其中一溫度，所述第二溫度定值為56~72℃範圍內的其中一溫度，所述第三溫度定值為56~72℃範圍內的其中一溫度，所述第四溫度定值為60~78℃範圍內的其中一溫度；所述第一預定時間為2~15分鐘，所述第二預定時間為低於5分鐘內的任一時間，所述第三預定時間為10~60秒範圍內的其中一時間，所述第四預定時間為10~60秒範圍內的其中一時間，所述第五預定時間為低於5分鐘內的任一時間；所述第一預定溫度定值為0.5~2℃範圍內的其中一溫度，所述第二預訂溫度定值為1~5℃範圍內的其中一溫度，所述第三預訂溫度定值0.1~4℃範圍內的其中一溫度，所述第四預定溫度定值0.1~4℃範圍內的其中一溫度。

偵測EGFR突變基因：

EGFR的突變情況有四種，分別為EGFR exon18、19、20及21的基因突變，因此本發明係針對DNA表現序列(exon)18、19、20及21的突變進行測定，使用以EVA Green螢光染劑為基礎的即時定量PCR可檢測到微量的細胞DNA存在。

針對EGFR exon 18、19、20及21基因突變之偵測，本發明設計以下檢驗EGFR基因之核酸引子，如核苷酸序列表所記載。序列表中，SEQ ID NO：1係檢驗EGFR exon 18之前置引子；SEQ ID NO：2係檢驗EGFR exon 18之反置引子；SEQ ID NO：3係檢驗EGFR exon 19之前置引子；SEQ ID NO：4 係檢驗EGFR exon 19之反置引子；SEQ ID NO：5係檢驗EGFR exon 20之前置引子；SEQ ID NO：6係檢驗EGFR exon 20之反置引子；SEQ ID NO：7係檢驗EGFR exon 21之前置引子；SEQ ID NO：8係檢驗EGFR exon 21之反置引子。

參閱圖3及以下表1所示，針對EGFR exon 18的部分，本發明以健康人之白血球為wild type DNA來源，以含有G719C突變之質體為突變DNA來源。在兩者混和後相加的總量約為100ng時，混和不同比例之突變DNA(0.01-100%)。以SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2針對EGFR exon 18基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果。當標的細胞含有0.01%以上之突變DNA時，可被本發明所設計的EGFR基因突變去氧核醣核酸增幅反應偵測到。當標的細胞不含突變DNA時，不會有非專一性的訊號產生。exon 18使用59-66℃的區間溫度反應，已經沒有突變的組別F未跑出Ct值(陰性)，而A~E組的Ct值皆有<30(陽性)，因此均可以鑑別出突變訊號。

在此實施例中：

第一段溫差區間步驟S11：先將表現螢光的標的細胞升溫至至95℃維持5分鐘；完成上述升溫步驟後進行控溫至95℃持續15秒，接著進行64~58℃反應。起始於64℃持續30秒，隨後每個循環降低0.5℃，直至58℃持續30秒。接著以58℃重複此溫控模組共計35次循環。

第二段溫差區間步驟S12：完成前述溫控模組後，在72℃環境中維持30秒。

第三段溫差區間步驟S13：最後進行升溫後迅速降溫，將完成上述步驟之樣品升溫至95℃持續30秒，再以4.4℃/秒的速率降溫度至65℃持續30秒，再以2.2℃/秒的速率升溫度至95℃，最後以0.14℃/秒的速率降溫度至40℃，持續10秒。

表1：

參閱圖4及圖5及以下表1-1、表1-2所示，在此實施例中係採用單一溫度將表現螢光的標的細胞進行PCR反應，先將表現螢光的標的細胞升溫至95℃維持10分鐘；完成上述升溫步驟後進行控溫至95℃持續15秒，接著進行59℃或63℃持續25秒。接著以59℃或63℃重複此溫控模組共計50次循環。完成前述溫控模組後，在72℃環境中維持28秒；最後進行升溫後迅速降溫，將完成上述步驟之樣品升溫至95℃持續30秒，再以4.4℃/秒的速率降溫度至65℃持續30秒，再以2.2℃/秒的速率升溫度至95℃，最後以0.14℃/秒的速率降溫度至40℃，持續10秒。從圖4及表1-1中可看出，使用63℃單一溫度進行測試，整體的螢光強度非常低，換言之，整體放大效率不佳，Ct數值也>30(偽陰性)。而在圖5及表1-2中，使用59℃單一溫度進行測試，已沒有突變DNA的組別F來看Ct值落在30(偽陰性)，僅有A與B組的Ct值有<30(陽性)，可以鑑別出突變訊號。

表1-1：

表1-2：

從表1-3可看出，在exon18使用59-66℃溫度區間進行PCR，相較於以59℃或63℃的固定溫度測試，約可以提升10~1000倍的靈敏度。

表1-3：

參閱圖6及以下表2所示，針對EGFR exon 19的部分，本發明以健康人之白血球為wild type DNA來源，以含有EGFR exon 19 deletion之細胞株H1650為突變DNA來源。在兩者混和後相加的總量約為100ng時，混和不同比例之突變DNA(0.01-100%)。以SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4針對EGFR exon 19基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果。當標的細胞含有0.01%以上之突變DNA時，可被本發明所設計的EGFR基因突變去氧核醣核酸增幅反應偵測到。當標的細胞不含突變DNA時，不會有非專一性的訊號產生。exon 19使用58℃單一固定溫度反應。而在圖6及表2中，使用58℃單一溫度進行測試，已沒有突變DNA的組別F未跑出Ct值(陰性)，A~E組的Ct值皆<40(陽性)，因此均可以鑑別出突變訊號。

在此實施例中：

第一段溫差區間步驟S11：將待測樣品升溫至95℃維持10分鐘；完成上述升溫步驟後進行控溫至95℃持續15秒，接著進行58℃持續60秒。接著以58℃重複此溫控模組共計35次循環。

第二段溫差區間步驟S12：完成前述溫控模組後，在60℃環境中維持1分鐘。

表2：

參閱圖7及以下表3，針對EGFR exon 20的部分，本發明以健康人之白血球為wild type DNA來源，以含有EGFR exon 20 T790M突變之細胞株H1975為突變DNA來源。在兩者混和後相加的總量約為100ng時，混和不同比例之突變DNA(0.01-100%)。以SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6針對EGFR exon 20基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果示。當標的細胞含有0.01%以上之突變DNA時，可被本發明所設計的EGFR基因突變去氧核醣核酸增幅反應偵測到。當標的細胞不含突變DNA時，不會有非專一性的訊號產生。exon 20使用67-72℃溫度區間反應，已沒有突變DNA的組別F未未跑出Ct值(陰性)，而A~E組的Ct值皆有<40(陽性)，因此均可以鑑別出突變訊號。

在此實施例中：

第一段溫差區間步驟S11：將待測樣品升溫至95℃維持5分鐘；完成上述升溫步驟後進行控溫至95℃持續15秒，接著進行66~59℃反應。起始於66℃持續30秒，隨後每個循環降低0.5℃，直至59℃持續30秒。接著以59℃重複此溫控模組共計36次循環。

表3：

參閱圖8及圖9及以下表3-1、表3-2所示，在此實施例中係採用單一溫度將表現螢光的標的細胞進行PCR反應，將表現螢光的標的細胞升溫至95℃維持10分鐘；完成上述升溫步驟後進行控溫模組：控溫至95℃持續15秒，接著進行67℃或69℃持續25秒。接著以67℃或69℃重複此溫控模組共計35次循環。完成前述溫控模組後，在72℃環境中維持28秒；最後進行升溫後迅速降溫，將完成上述步驟之樣品升溫至95℃持續30秒，再以4.4℃/秒的速率降溫度至65℃持續30秒，再以2.2℃/秒的速率升溫度至95℃，最後以0.14℃/秒的速率降溫度至40℃，持續10秒。從圖8及表3-1中可看出，使用69℃單一溫度進行測試，已沒有突變DNA的組別F來看Ct值落在34(偽陽性)，僅有A與B組的Ct值有<30(陽性)，可以鑑別出突變訊號。而在圖9及表3-2中，使用67℃單一溫度進行測試，已沒有突變DNA的組別F來看Ct值落在30(偽陽性)，僅有A、B、C組的Ct值有<30(陽性)，可以鑑別出突變訊號。

表3-1：

表3-2：

從表3-3可看出，在exon 20使用67-72℃溫度區間進行PCR，相較於以67℃或69℃的固定溫度測試，約可以提升10~1000倍的靈敏度。

表3-3：

參閱圖10及以下表4所示，針對EGFR exon 21的部分，本發明以健康人之白血球為wild type DNA來源，以含有EGFR exon 21 L858R突變之細胞株H1975為突變DNA來源。在兩者混和後相加的總量約為100ng時，混和不同比例之突變DNA(0.01-100%)。以SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8針對EGFR exon 21基因突變去氧核醣核酸增幅反應之結果。當標的細胞含有0.01%以上之突變DNA時，可被本發明所設計的EGFR基因突變去氧核醣核酸增幅反應所偵測到。當標的細胞不含突變DNA時，不會有非專一性的訊號產生。Exon 21使用63-70℃溫度區間反應，已沒有突變DNA的組別F未未跑出Ct值(陰性)，而A~E組的Ct值皆有<40(陽性)，因此均可以鑑別出突變訊號。

在此實施例中：

第一段溫差區間步驟S11：將待測樣品升溫至95℃維持5分鐘；完成上述升溫步驟後進行控溫至95℃持續15秒，接著進行70~63℃反應。起始於70℃持續30秒，隨後每個循環降低0.5℃，直至63℃持續30秒。接著以63℃重複此溫控模組共計41次循環。

表4：

參閱圖11及圖12及以下表4-1、表4-2所示，在此實施例中係採用單一溫度將表現螢光的標的細胞進行PCR反應，將表現螢光的標的細胞升溫至95℃維持10分鐘；完成上述升溫步驟後進行控溫至95℃持續15秒，接著進行63℃或67℃持續25秒。接著以63℃或67℃重複此溫控模組共計50次循環。完成前述溫控模組後，在72℃環境中維持28秒；最後進行升溫後迅速降溫，將完成上述步驟之樣品升溫至95℃持續30秒，再以4.4℃/秒的速率降溫度至65℃持續30秒，再以2.2℃/秒的速率升溫度至95℃，最後以0.14℃/秒的速率降溫度至40℃，持續10秒。從圖11及表4-1中可看出，使用67℃單一溫度進行測試，整體的螢光強度非常低，整體放大效率不佳，Ct數值也都>30(偽陰性)。而在圖12及表4-2中，使用63℃單一溫度進行測試，已沒有突變DNA的組別F來看Ct值落在32(偽陽性)，僅有A、B、C組的Ct值有<32(陽性)，可以鑑別出突變訊號。

表4-1：

表4-2：

從表4-3可看出，在exon 20使用63-70℃溫度區間進行PCR，相較於以63℃或67℃的固定溫度測試，約可以提升10~1000倍的靈敏度

表4-3：

本發明之方法提高了周邊血液循環腫瘤細胞分離後的純度，利於後續的基因突變分析。在微流體多參數細胞分選儀純化出周邊血液循環腫瘤細胞後，再以即時定量PCR進行去氧核醣核酸增幅反應，專一偵測EGFR基因突變，將其運用在癌症診斷與預後治療評估，有利於癌症病人預後治療。

本發明在上文中以較佳實施例揭露，然所屬技術領域中具有通常知識者應理解的是，該實施例僅用於描述本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應設為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍應當以申請專利範圍所界定者為準。

<110> 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院

<120> 周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞偵測之方法

<160> 8

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 檢驗EGFR exon 18之前置引子

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 檢驗EGFR exon 18之反置引子

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 檢驗EGFR exon 19之前置引子

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 檢驗EGFR exon 19之反置引子

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 檢驗EGFR exon 20之前置引子

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 檢驗EGFR exon 20之反置引子

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 檢驗EGFR exon 21之前置引子

<400> 7

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 檢驗EGFR exon 21之反置引子

<400> 8

S1:步驟a

S2:步驟b

S3:步驟c

S4:步驟d

S5:步驟e

S6:步驟f

Claims

一種偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，包括：步驟a.取得周邊血液檢體；步驟b.去除血液中之紅血球；步驟c.使用CD45抗體及CD235a抗體排除檢體中非標的細胞之白血球；步驟d.添加至少一種辨識腫瘤細胞的螢光接合專一抗體至血液中，上述螢光接合專一抗體包括波型蛋白(Vimentin)、鈣粘蛋白(Cadherin)、CD133、CD44、纖連蛋白(Fibronectin)、p16(INK4A)、Snail1、Snail2(Slug)、上皮細胞黏合蛋白(EpCAM)或細胞角質蛋白(cytokeratin,CK)，將上述抗體與步驟c收集得到表現微弱或不表現CD45及CD235a之白血球細胞結合，並純化出表現螢光的標的細胞；步驟e.將上述表現螢光的標的細胞進行去氧核醣核酸的萃取，並在即時定量PCR(real-time PCR)中結合溫控模組，對上述細胞使用至少三組由高溫以預定時間下降預定溫度至低溫，接著再從低溫以預定時間上升預定溫度回到高溫，而形成至少三段式的溫差區間變化，所述至少三段式的溫差區間之步驟包括：第一段溫差區間步驟先升溫至第一溫度定值並控溫維持第一預定時間後，溫度下降至第二溫度定值作為起點，並以每個循環下降第一預定溫度定值至第三溫度定值，維持在所述第三溫度定值進行至少30次循環，所述第一溫度定值高於所述第二溫度定值，所述第二溫度定值高於所述第三溫度定值；第二段溫差區間步驟：所述第三溫度定值上升至第四溫度定值並維持第二預定時間，所述第四溫度定值的溫度小於所述第一溫度定值，且所述第四溫度定值大於所述第三溫度定值；第三段溫差區間步驟：所述第四溫度定值升溫至所述第一溫度定值並持續第三預定時間，接著再以每秒下降第二預定溫度定值至65℃並維持第四預定時間，接著再以每秒上升第三預定溫度定值至所述第一溫度定值，最後再以每秒下降第四預定溫度定值至40℃並維持第五預定時間；其中，所述第一溫度定值為92~98℃範圍內的其中一溫度，所述第二溫度定值為56~72℃範圍內的其中一溫度，所述第三溫度定值為56~72℃範圍內的其中一溫度，所述第四溫度定值為60~78℃範圍內的其中一溫度，所述第一預定溫度定值為0.5~2℃範圍內的其中一溫度，所述第二預訂溫度定值為1~5℃範圍內的其中一溫度，所述第三預訂溫度定值0.1~4℃範圍內的其中一溫度，所述第四預定溫度定值0.1~4℃範圍內的其中一溫度；步驟f.偵測到EGFR基因突變腫瘤細胞。
如請求項1之偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，其中所述第一預定時間為2~15分鐘，所述第二預定時間為低於5分鐘內的任一時間，所述第三預定時間為10~60秒範圍內的其中一時間，所述第四預定時間為10~60秒範圍內的其中一時間，所述第五預定時間為低於5分鐘內的任一時間。
如請求項1之偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，其中於步驟c中，可再加入細胞核染劑，該細胞核染劑包括DAPI、Hoechst、Drag 5及Syto 62。
如請求項1之偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，其中於步驟e中，係以即時定量PCR(real-time PCR)技術搭配聚合酶連鎖反應器及核酸引子進行偵測。
如請求項1之偵測周邊血液中EGFR基因突變腫瘤細胞之方法，其中所述即時定量PCR(real-time PCR)技術係使用EVA Green螢光染劑。