CN112763701A - 微流控检测芯片及微流控检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微流控检测芯片及微流控检测方法，所述微流控检测芯片包括包括至少一个检测单元，所述检测单元包括加样腔体、免疫结合池、免疫检测池、免疫清洗液池、免疫缓冲液池、核酸检测池和废液池。本发明的微流控检测芯片以微流控技术作为载体，将肿瘤标志物检测的免疫学检测方法和分子生物学检测方法结合于封闭的微流控芯片中，实现少量的样本同时完成不同类别肿瘤标志物的检测与分型，得出针对性的基于免疫及分子检测项目的测试结果，能够为临床判断提供更加细致、全面、多维度的数据，而且简化了流程和仪器设备的需求，缩短了检测周期，减少了交叉污染，也提高了检测结果的有效性和准确性。

Description

微流控检测芯片及微流控检测方法

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，特别是涉及一种微流控检测芯片及微流控检测方法。

背景技术

肿瘤标志物检测的免疫学检测方法是以体液中的蛋白标志物作为抗原并与用酶、同位素、生物素和亲和素、荧光素等标记的抗体产生特异性结合而被定位和检测，常规的用于酶联免疫分析、化学发光免疫分析、放射免疫分析等。虽然已经发现了很多种蛋白标志物，但并不是所有的癌症都有蛋白标志物，也不是所有的蛋白标志物升高都是癌症引起的，某些非癌症的情况也会导致某些蛋白标志物升高。

此外，分子生物学检测方法(液体活检)已经持续应用于癌症病人的病程管理当中，近些年来，其应用潜力也得到了积极开发，它能够弥补免疫学检测方法的一些缺陷。液体活检通过采集患者血液、尿液等体液标本中的肿瘤相关产物，包括血液中游离的循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体等，再结合肿瘤靶基因的分子生物学检测方法，实现高通量、高特异性和高敏感性检测结果，对血浆和其他体液中游离DNA(cfDNA)的检测分析已经成功鉴别到了多种癌症相关分子类型，包括基因突变、拷贝数变异、移位、甲基化变异、基因表达变异及病毒DNA等。

以上提及的肿瘤检测手段，无论是免疫学检测方法(蛋白标志物检测)还是分子生物学检测方法(液体活检)均有各自的优势，又具有很强的互补性，两者本质上是针对不同时间段、不同测试靶对象的诊断手段。将二者的检测结果结合，将能够得到更加全面、综合的针对不同肿瘤阶段的患者在免疫水平和分子水平上的动态数据和指标，能够为临床医生在实际诊断中提供更好的参考依据。但是以常规方式分别进行免疫学检测方法和分子生物学检测方法不仅流程复杂，而且需要分别独立使用多种仪器设备，存在大量繁琐的人工操作，检测周期长，设备间的样本转移也使得检测过程有极大的风险出现交叉污染，从而影响检测结果。

发明内容

基于此，有必要提供一种既能进行免疫学检测方法又能进行分子生物学检测方法的微流控检测芯片。

一种微流控检测芯片，包括至少一个检测单元，所述检测单元包括加样腔体、免疫结合池、免疫检测池、免疫清洗液池、免疫缓冲液池、核酸检测池和废液池；

所述加样腔体用于样本液的输入和存储；所述免疫结合池与所述加样腔体连接，所述免疫结合池用于预装包被有捕获抗体或捕获抗原的捕获载体；所述免疫检测池与所述免疫结合池连接，所述免疫检测池用于预装标记抗体；所述免疫清洗液池与所述免疫检测池连接，所述免疫清洗液池用于预装能够洗去所述标记抗体的清洗缓冲液；所述免疫缓冲液池与所述免疫检测池连接，所述免疫缓冲液池用于预装检测缓冲液；所述废液池与所述免疫检测池连接以用于收容废液；所述核酸检测池与所述加样腔体连接，所述核酸检测池用于预装能够扩增靶序列的PCR反应试剂；

所述微流控检测芯片具有旋转中心，所述免疫结合池、所述免疫检测池和所述废液池自所述旋转中心近心端至远心端依次分布，所述免疫清洗液池和所述免疫缓冲液池相对于所述免疫检测池更靠近所述旋转中心，所述核酸检测池相对于所述废液池更靠近所述旋转中心，所述免疫结合池、所述免疫检测池和所述废液池之间均设有阀门。

本发明的微流控检测芯片在使用时，可将样本液加至加样腔体，然后将样本液释放至免疫结合池与捕获载体孵育，则待测抗原被捕获载体所捕获。然后将捕获载体和样本液释放至免疫检测池以与标记抗体孵育，从而形成标记抗体-待测抗原-捕获载体复合物，将孵育后的液体排入废液池并将捕获载体留存于免疫检测池。接着释放免疫清洗液池的清洗缓冲液至免疫检测池进行清洗，然后将清洗液排入废液池并将捕获载体留存于免疫检测池，则未结合至捕获载体的标记抗体及杂质等被洗至废液池。然后释放免疫缓冲液池的检测缓冲液至免疫检测池，检测免疫检测池中的标记物，即可完成免疫学检测。同时，还可以将加样腔体中的部分样本液释放至核酸检测池，然后进行PCR扩增和检测，即可完成分子生物学检测。本发明的微流控检测芯片以微流控技术作为载体，将肿瘤标志物检测的免疫学检测方法(蛋白标志物检测)和分子生物学检测方法(液体活检)结合于封闭的微流控芯片中，实现少量的样本同时完成不同类别肿瘤标志物的检测与分型，得出针对性的基于免疫及分子检测项目的测试结果，能够为临床判断提供更加细致、全面、多维度的数据，而且简化了流程和仪器设备的需求，缩短了检测周期，减少了交叉污染，也提高了检测结果的有效性和准确性。

在其中一个实施例中，所述加样腔体包括第一加样池和第二加样池，所述免疫结合池与所述第一加样池连接，所述核酸检测池与所述第二加样池连接。

在其中一个实施例中，所述检测单元还包括分流池，所述分流池与所述免疫结合池连接，所述免疫检测池通过所述分流池与所述免疫结合池连接，所述核酸检测池通过所述分流池和所述免疫结合池与所述加样腔体连接；所述分流池相对于所述免疫结合池更远离所述旋转中心，且相对于所述免疫检测池和所述核酸检测池更靠近所述旋转中心，所述分流池与所述免疫检测池和所述核酸检测池之间均设有阀门。

在其中一个实施例中，所述检测单元还包括样本裂解池和裂解液池，所述样本裂解池用于预装能够使核酸释放的酶，所述裂解液池用于预装样本裂解液；所述样本裂解池分别与所述加样腔体和所述裂解液池连接，所述核酸检测池与所述样本裂解池连接，所述样本裂解池相对于所述加样腔体更远离所述旋转中心，且相对于所述核酸检测池更靠近所述旋转中心，所述裂解液池相对于样本裂解池更靠近所述旋转中心。

在其中一个实施例中，所述检测单元还包括核酸富集池、核酸清洗液池和核酸洗脱液池，所述核酸富集池用于预装能够结合核酸的核酸载体，所述核酸清洗液池用于预装能够洗去非核酸杂质的清洗液，所述核酸洗脱液池用于预装能够使核酸与所述核酸载体分离的洗脱液；所述核酸富集池分别与所述样本裂解池、所述核酸清洗液池和所述核酸洗脱液池连接，所述核酸检测池和所述废液池分别与所述核酸富集池连接，所述核酸富集池相对于所述样本裂解池、所述核酸清洗液池和所述核酸洗脱液池更远离所述旋转中心，且相对于所述核酸检测池和所述废液池更靠近所述旋转中心。

在其中一个实施例中，所述核酸检测池的数量为多个，所述检测单元还包括分液流道和第二虹吸通道，所述分液流道通过所述第二虹吸通道与所述核酸富集池连接并自该连接端围绕所述旋转中心延伸，多个所述核酸检测池在所述分液流道的外侧围绕所述旋转中心分布，且各所述核酸检测池均分别与所述分液流道连接。

在其中一个实施例中，所述核酸清洗液池的数量为至少两个，其中至少一个所述核酸清洗液池用于预装含有醇类清洗剂的清洗液，且至少一个所述核酸清洗液池用于预装能够洗去所述醇类清洗剂的清洗液。

在其中一个实施例中，所述检测单元还包括沉淀池、分离池和第一虹吸通道，所述分离池相对于所述沉淀池更靠近所述旋转中心，所述沉淀池与所述加样腔体连接，所述分离池与所述沉淀池连接，所述免疫结合池通过所述第一虹吸通道与所述分离池连接。

在其中一个实施例中，所述微流控检测芯片包括依次层叠设置的阀控层、检测核心层和离心层，所述阀门设于所述阀控层上，所述加样腔体、所述免疫结合池、所述免疫检测池、所述免疫清洗液池、所述免疫缓冲液池、所述核酸检测池和所述废液池设于所述检测核心层上，所述沉淀池和所述分离池设于所述离心层上。

本发明还提供了一种微流控检测方法，采用上述微流控检测芯片，所述微流控检测方法包括以下步骤：

将样本液加至所述加样腔体；

将所述样本液释放至所述免疫结合池与所述捕获载体孵育；

将所述捕获载体和所述样本液释放至所述免疫检测池以与所述标记抗体孵育，然后将孵育后的液体排入所述废液池并将所述捕获载体留存于所述免疫检测池；

释放所述免疫清洗液池的清洗缓冲液至所述免疫检测池进行清洗，然后将清洗缓冲液排入所述废液池并将所述捕获载体留存于所述免疫检测池；

释放所述免疫缓冲液池的检测缓冲液至所述免疫检测池，然后检测所述免疫检测池中的所述标记抗体；和/或

将所述样本液释放至所述核酸检测池，然后进行PCR扩增和检测。

附图说明

图1为一实施例的微流控检测芯片的结构示意图；

图2为一实施例的微流控检测芯片的部分结构的示意图；

图3为另一实施例的微流控检测芯片的结构示意图；

图4为一实施例的微流控检测芯片的分解图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

微流控技术指的是使用微流道(数十至数百微米)处理或操控微小流体(体积为微升甚至纳升)的***所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉技术。该***具备如下5个优势：①集成化与自动化。微流控技术能够把样本检测的多个步骤集中在一张小小的芯片上，通过流道的尺寸和曲度、微阀门、腔体设计的搭配组合来集成这些操作步骤，最终使整个检测集成小型化和自动化。②高通量。由于微流控可以设计成为多流道，通过微流道网络可以同时将待检测样本分流到多个反应单位，同时反应单元之间相互隔离，使各个反应互不相干扰，因此可以根据需要对同一个样本平行进行多个项目的检测。与常规逐个项目检测相比，大大缩短了检测的时间，提高了检测效率，具有高通量的特点。③检测试剂消耗少。由于集成检测的小型化，使微流控芯片上的反应单元腔体非常小，虽然试剂配方的浓度可能有一定比例的提高，但是试剂使用量远远低于常规试剂，大大降低了试剂的消耗量。④样本量需求少。由于只在小小的芯片上完成检测，因此需要被检测的样本量需求非常少，往往只需要微升级别。此外还可以直接用全血进行检测，对于婴儿、老人、残疾人这些血量少、静脉采集困难的人群，使其检测更加方便。同时对于非常珍贵稀少的样本，使其多项指标检测成为可能。⑤污染少。微流控芯片的集成功能，使原先在实验室里需要人工完成的各项操作全部集成到芯片上自动完成，样本对环境的污染降低到最低程度。

如图1所示，本发明一实施方式的微流控检测芯片200，包括至少一个检测单元，检测单元包括加样腔体11、免疫结合池21、免疫检测池31、免疫清洗液池41、免疫缓冲液池51、核酸检测池61和废液池71。

加样腔体11用于样本液的输入和存储。免疫结合池21与加样腔体11连接，免疫结合池21用于预装包被有捕获抗体或捕获抗原的捕获载体。免疫检测池31与免疫结合池21连接，免疫检测池31用于预装标记抗体。免疫清洗液池41与免疫检测池31连接，免疫清洗液池41用于预装能够洗去标记抗体的清洗缓冲液。免疫缓冲液池51与免疫检测池31连接，免疫缓冲液池51用于预装检测缓冲液。废液池71与免疫检测池31连接以用于收容废液。核酸检测池61与加样腔体11连接，核酸检测池61用于预装能够扩增靶序列的PCR反应试剂。

可以理解，微流控检测芯片200的中部为旋转安装部，其具有旋转中心，该旋转中心即离心操作时的转动中心。免疫结合池21、免疫检测池31和废液池71自旋转中心近心端至远心端依次分布，免疫清洗液池41和免疫缓冲液池51相对于免疫检测池31更靠近旋转中心，核酸检测池61相对于废液池71更靠近旋转中心，免疫结合池21、免疫检测池31、免疫清洗液池41、免疫缓冲液池51和废液池71之间均设有阀门。

本发明的微流控检测芯片200在使用时，可将样本液加至加样腔体11，然后将样本液释放至免疫结合池21与捕获载体孵育，则待测抗原被捕获载体所捕获。然后将捕获载体和样本液释放至免疫检测池31以与标记抗体孵育，从而形成标记抗体-待测抗原-捕获载体复合物，将孵育后的液体排入废液池71并将捕获载体留存于免疫检测池31。接着释放免疫清洗液池41的清洗缓冲液至免疫检测池31进行清洗，然后将清洗液排入废液池71并将捕获载体留存于免疫检测池31，则未结合至捕获载体的标记抗体及杂质等被洗至废液池71。然后释放免疫缓冲液池51的检测缓冲液至免疫检测池31，检测免疫检测池31中的标记物，即可完成免疫学检测。同时，还可以将加样腔体11中的部分样本液释放至核酸检测池61，然后进行PCR扩增和检测，即可完成分子生物学检测。本发明的微流控检测芯片200以微流控技术作为载体，将肿瘤标志物检测的免疫学检测方法(蛋白标志物检测)和分子生物学检测方法(液体活检)结合于封闭的微流控芯片中，实现少量的样本同时完成不同类别肿瘤标志物的检测与分型，得出针对性的基于免疫及分子检测项目的测试结果，能够为临床判断提供更加细致、全面、多维度的数据，而且简化了流程和仪器设备的需求，缩短了检测周期，减少了交叉污染，也提高了检测结果的有效性和准确性。

可以理解，根据免疫检测原理，针对样本中检测对象的不同(检测抗体或检测抗原)，载体类型可有所不同，即若检测对象为抗体，则捕获载体上包被的是捕获抗原，若检测对象为抗原，则捕获载体上包被的是捕获抗体。

在一个具体示例中，检测单元还包括分流池22，分流池22与免疫结合池21连接，免疫检测池31通过分流池22与免疫结合池21连接，核酸检测池61通过分流池22和免疫结合池21与加样腔体11连接。分流池22相对于免疫结合池21更远离旋转中心，且相对于免疫检测池31和核酸检测池61更靠近旋转中心，分流池22与免疫检测池21和核酸检测池61之间均设有阀门。如此，可通过分流池22将与捕获载体孵育后的样本液分成两份以分别用于免疫学检测和分子生物学检测。分流池22的中部内径缩小从而使腔体分成两个相同大小的区域，便于将液体等分成两份分别用于免疫学检测和分子生物学检测。可选地，检测单元还包括与分流池22连接的溢流池，溢流池与旋转中心的距离等于分流池22与旋转中心的距离，用于收容多余的液体。可以理解，免疫检测池31中根据检测靶标的不同可以预装不同的标记抗体，并选择不同检测设备不同检测器及光学***实现多抗体靶标检测的需要。

可选地，免疫结合池21中的捕获抗体为针对肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体。由于人体血液循环***中CTC(循环肿瘤细胞)的含量极低，肿瘤转移患者每毫升全血中仅有1～10个CTC，因此要实现CTC的检测，对其进行分选富集是一个关键的步骤。在免疫结合池21中利用特异性抗体与肿瘤细胞表面抗原进行特异性结合来捕获和富集CTC，具有高灵敏性、快速、高细胞活性的CTC分选富集特点。CTC分为上皮细胞表型、***表型和上皮***混合表型，识别上皮标志物、识别间质标志物和识别上皮间质标志物。上皮标志物在正常上皮细胞和上皮肿瘤上表达，在间质白细胞上不存在，可区分癌细胞和正常血细胞。可选地，上皮表型CTC阳性富集的细胞表面标志物为上皮细胞粘附分子(EpCAM)或细胞角蛋白家族成员(即CK8，CK18和CK19)，用于检测具有上皮表型癌症患者CTC。除了可以检测被捕获的CTC细胞外，还可以检测血浆中由肿瘤细胞释放的肿瘤标志物，包括激素、酶等抗原都可以作为肿瘤细胞代谢的产物，如下表所示。后续应用可根据肿瘤标志物治疗前结果作为基线，作为以后疗效检测和复发监测的对照标准，如经过治疗后原来升高的标志物下降了，说明治疗是有效的，反之，如标志物不降、甚至升高，说明可能治疗无效。

在一个具体示例中，如图2所示，检测单元还包括设于不同层的沉淀池12、分离池13和第一虹吸通道14，分离池13相对于沉淀池12更靠近旋转中心，沉淀池12与加样腔体11连接，分离池13与沉淀池12连接，免疫结合池21通过第一虹吸通道14与分离池13连接。如此，当样本液为血液等需要进行预处理的样品时，可以通过高速离心使样本液分层，样本液中的红细胞、白细胞、血小板以及杂质等会沉淀至沉淀池12内，血清则会填满分离池13，然后降低离心速度或停止离心，血清则会沿着虹吸通道14进入免疫结合池21内，为后续测试作准备。优选地，分离池13和沉淀池12沿背离旋转中心的径向依次设置。可以理解，沉淀池12、分离池13和第一虹吸通道14等也可以与其他腔体设置在同一层上，不限于此。

可选地，检测单元还包括与分离池13连通的余样池15，余样池15与旋转中心的距离大于等于分离池13与旋转中心的距离，以用于收容多余的样本液。如此，随着样本液逐渐填满沉淀池12和分离池13，若有多余的样本液则会进入旁边的余样池15。可选地，检测单元还包括与分离池13连通的指示池16，指示池16被填满说明所加入的样本液能够满足检测需要，有助于指导样本液的添加。

在一个具体示例中，检测单元还包括样本裂解池62和裂解液池63，样本裂解池62用于预装能够使核酸释放的酶，裂解液池63用于预装样本裂解液。样本裂解池62分别与加样腔体11和裂解液池63连接，核酸检测池61与样本裂解池62连接，样本裂解池62相对于加样腔体11更远离旋转中心，且相对于核酸检测池61更靠近旋转中心，裂解液池63相对于样本裂解池62更靠近旋转中心。可以理解，样本裂解液含有裂解细胞、细菌或病毒以及使蛋白质变性的试剂及缓冲液等组分，样本裂解池62中的酶可以是溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链霉蛋白酶等)等，用于促使细胞或病毒外壳破裂降解释放核酸，从而使该微流控检测芯片200在进行分子生物学检测时无需对样本液额外进行裂解预处理，从而能够适用于更广泛的样本类型，简化人工操作步骤。

在一个具体示例中，检测单元还包括核酸富集池64、核酸清洗液池65和核酸洗脱液池66，核酸富集池64用于预装能够结合核酸的核酸载体，核酸清洗液池65用于预装能够洗去非核酸杂质的清洗液，核酸洗脱液池66用于预装能够使核酸与核酸载体分离的洗脱液。核酸富集池64分别与样本裂解池62、核酸清洗液池65和核酸洗脱液池66连接，核酸检测池61和废液池71分别与核酸富集池64连接，核酸富集池64相对于样本裂解池62、核酸清洗液池65和核酸洗脱液池66更远离旋转中心，且相对于核酸检测池61和废液池71更靠近旋转中心。如此，样本液在样本裂解池62经过核酸裂解处理后释放至核酸富集池64，核酸富集池64中的核酸载体可以吸附富集核酸成分，然后通过核酸清洗液池65中的清洗液可将未结合的非核酸杂质洗至废液池71，接着通过核酸洗脱液池66中的洗脱液可使核酸与核酸载体分离并将核酸洗至核酸检测池61，以便于后续更好地进行PCR扩增和检测。可以理解，核酸富集池64、样本裂解池62、核酸清洗液池65、核酸洗脱液池66和废液池71之间均设有阀门，以便于控制液体的流动。

在一个具体示例中，核酸清洗液池65的数量为至少两个，其中至少一个核酸清洗液池65用于预装含有醇类清洗剂的清洗液，且至少一个核酸清洗液池65用于预装能够洗去醇类清洗剂的清洗液。如此，首先可用含有醇类清洗剂的清洗液将细胞碎片、病毒碎片、脂质、蛋白碎片等杂质洗去，然后再将醇类清洗剂残留洗去以避免醇类清洗剂等物质影响PCR扩增的效果，提高检测的准确性。在图1所示的实施例中核酸清洗液池65的数量为三个，其中两个核酸清洗液池65用于预装含有醇类清洗剂的清洗液，另一个核酸清洗液池65用于预装能够洗去醇类清洗剂的清洗液。可以理解，核酸清洗液池65的具体数量和预装的清洗液类型不限于此，可根据需要调整。

在一个具体示例中，核酸检测池61的数量为多个，检测单元还包括分液流道67，分液流道67与核酸富集池64连接并自该连接端围绕旋转中心延伸，多个核酸检测池61在分液流道67的外侧围绕旋转中心分布，且各核酸检测池61均分别与分液流道67连接。如此，可同时进行多个并行PCR扩增和检测以提高检测准确性和检测效率，例如可在多个核酸检测池61中分别预装针对不同靶序列的PCR反应试剂，从而一次获得多个靶标的检测结果。可以理解，核酸检测池61中可以预包埋以冻干微球或风干粉状的PCR反应试剂，PCR反应试剂包括针对特定靶序列的引物/探针组合、扩增所需的逆转录酶、Taq DNA聚合酶等成分。可选地，检测单元还包括第二虹吸通道68，分液流道67通过第二虹吸通道68与核酸富集池64连接。可选地，检测单元还包括余液池，余液池与分液流道67的末端即远离核酸富集池64的一端连接，以收容多余的液体。

如图3所示，在另一实施方式的微流控检测芯片200中，其加样腔体11包括第一加样池111和第二加样池112，免疫结合池21与第一加样池111连接，核酸检测池61与第二加样池112连接。如此，具有两个相对独立的第一加样池111和第二加样池112，第一加样池111可用于血液类样本的检测，第二加样池112可用于咽拭子、鼻拭子、肺泡灌洗液等非血液类样本。可以理解，第一加样池111和第二加样池112分别具有对应的加样孔。

在一个具体示例中，结合图4所示，微流控检测芯片200包括依次层叠设置的阀控层210、检测核心层220和离心层230。阀门设于阀控层210上，可配套提供与阀门交互的特定区域，从而分步骤、分时间按顺序完成芯片的所有反应步骤。加样腔体11、免疫结合池21、免疫检测池31、免疫清洗液池41、免疫缓冲液池51、核酸检测池61和废液池71等设于检测核心层220上，主要完成检测试剂与样品的混合、分离、反应及检测流程。沉淀池12和分离池13设于离心层230上，主要完成样本的预处理。进一步地，分流池22、样本裂解池62、裂解液池63、核酸富集池64、清洗液池65和洗脱液池66等也设于检测核心层220上，第一虹吸通道14、余样池15和指示池16等均设于离心层230上。此外，如图2所示，离心层230上还设有与加样腔体11连通的加样孔203，以及与各腔室连接的气孔204。可选地，气孔204上设有滤芯，可使芯片内生物反应可能产生的气溶胶在进入外环境前实现阻隔，防止生物污染。

在一个具体示例中，离心层230包括依次层叠设置的虹吸通道层231、分离存储层232和过量缓冲层233。过量缓冲层233上设有余样池15，从而为多余的样品提供存储空间。分离存储层232上设有沉淀池12、分离池13和指示池16，从而可通过高速离心使血液样本分离成血清和血细胞沉淀。虹吸通道层231上设有第一虹吸通道14，以将分离得到的血清从分离池13经由第一虹吸通道14引入检测核心层220的免疫结合池21内，虹吸通道层231也可设有连接加样腔体11和沉淀池12的微流道。

在一个具体示例中，检测核心层220包括依次层叠设置的流体通道层221、腔室存储层222和气体通道层223。结合图1所示，气体通道层223上设有用于连接各腔室和气孔204的气体流道205，以引导各个腔室的空气流动，并统一汇合到气孔204处。腔室存储层222则主要是为样品及各试剂提供存储和反应空间，例如加样腔体11、免疫结合池21、免疫检测池31、免疫清洗液池41、免疫缓冲液池51、核酸检测池61、废液池71等均设于腔室存储层222。流体通道层221上设有相应的微流道，用于实现样品和各个反应试剂在各腔室的转移流动，与阀控层210配合可完成检测的各个环节。

在一个具体示例中，阀控层210包括依次层叠设置的交互控制层211、柔性阀门层212和试剂密封层213。试剂密封层213可以是铝箔，可封住各腔室底部与通道连接处，使得液体在使用前可稳定存储于各腔室内，使用时通过外部刺破机构顶破试剂密封层213，实现液体导出，即试剂密封层213可作为免疫清洗液池41、免疫缓冲液池51、裂解液池63、核酸清洗液池65和核酸洗脱液池66与其对应连接的腔室之间的阀门。或者也可以将液体试剂以薄衣液囊的形式存储后预置于对应腔室内，后续外部设备根据需要刺破薄衣液囊而使试剂得以流入流道。柔性阀门层212则与外部设备定位机构配合，可以定点、定时精准控制各腔室与通道间的连通和关闭，并为刺破腔室后的液体流动提供界面，即柔性阀门层212可作为分流池22、免疫检测池31、样本裂解池62、废液池71与核酸富集池64之间的阀门。交互控制层211为芯片封装的最底层，其为配套设备能够定点与柔性阀门层212交互提供准确位点。

在一个具体示例中，微流控检测芯片200还包括顶层240和隔离层250，顶层240覆盖于离心层230上，作为芯片封装的最顶层，其上相应设有与气孔连通的通孔，是芯片内气压与外界气压交互的出入口；隔离层250设于检测核心层220和离心层230之间，将离心层230和检测核心层220的腔室相互隔离开，液体能够在其上方和下方进行流动而不互相干扰。

可选地，微流控检测芯片200的材料为玻璃、硅片、石英和常见的聚合物材料中的一种或多种，聚合物材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚氨酯、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃共聚物(COC)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、氟塑料和硅橡胶中的一种或多种。

可选地，微流控检测芯片200的加工方式包括CNC、激光雕刻、软光刻技术、3D打印及注塑形成模具等方式，但不限于此。可选地，捕获载体为包被有捕获抗体的免疫磁珠，核酸载体为能够吸附核酸的磁珠，标记抗体上结合的标记物为荧光标记物。

可选地，微流控检测芯片200大致呈圆形，适用于全血、血浆、唾液等各种检测样本。当然，在其他实施方式中，微流控检测芯片200还可以是其他形状，例如矩形、多边形等等。微流控检测芯片200上的检测单元的数量可以为一个、两个、三个、五个、七个等等。

本发明一实施方式的微流控检测方法，采用上述微流控检测芯片200，微流控检测方法包括以下步骤：

将样本液加至所述加样腔体11；

将样本液释放至免疫结合池21与捕获载体孵育；

将捕获载体和样本液释放至免疫检测池31以与标记抗体孵育，然后将孵育后的液体排入废液池71并将捕获载体留存于免疫检测池31；

释放免疫清洗液池41的清洗缓冲液至免疫检测池31进行清洗，然后将清洗缓冲液排入废液池71并将捕获载体留存于免疫检测池31；

释放免疫缓冲液池51的检测缓冲液至免疫检测池31，然后检测免疫检测池31中的标记抗体；和/或

将样本液释放至核酸检测池61，然后进行PCR扩增和检测。

本发明的微流控检测方法以微流控技术作为载体，将肿瘤标志物检测的免疫学检测方法(蛋白标志物检测)和分子生物学检测方法(液体活检)结合于封闭的微流控芯片中，实现少量的样本同时完成不同类别肿瘤标志物的检测与分型，得出针对性的基于免疫及分子检测项目的测试结果，为临床判断提供更加细致、全面、多维度的依据。可以理解，该微流控检测方法采用上述微流控检测芯片200，不仅可用于肿瘤的早期筛查及诊断，也可以用于环境、食物等各种来源样本的检测，且可检测的分子类型不局限于疾病相关分子，实际上任何抗原抗体都可以用本方法检测，即其应用具有普适性。

在一个具体示例中，利用如图1所示的微流控检测芯片200检测血液样品中CTC免疫指标和分子指标的方法如下：

将样本液注入加样腔体11内，样本液沿流道汇入沉淀池12内，随着样本量逐渐增加，分离池13及其连通的指示池16也陆续被填满。指示池16填满说明所加入样本量足够满足检测需要，若有多余的样本加入则会填充余样池15。可采用两步梯度离心，第一步为中速离心，约5000rpm～6000rpm，保证血浆与血细胞的分离，第二步为高速离心，如15000rpm～20000rpm，保证去除剩余的血细胞。高速离心条件下，红细胞、白细胞、血小板等会沉淀至沉淀池12内，血清则会填满部分沉淀池12靠近芯片轴心区域以及分离池13。然后转为低速离心或停止离心，血清会沿着第一虹吸通道14进入免疫结合池21，为后续测试做准备。该过程中，阀门均处于关闭状态。

血清进入免疫结合池21后，顺逆时针旋转震荡芯片5～10s，然后孵育5～10min，使得血清内抗原(CTC细胞)与抗体包被的磁珠特异性结合。中速离心，使孵育形成的抗原-抗体-磁珠复合物混合液从免疫结合池21进入分流池22中，最终等分成两份。打开免疫结合池21与免疫检测池31之间的阀门，低速离心，分流池22内的一部分抗原-抗体-磁珠复合物混合液流入免疫检测池31内。待混合液完全流入，关闭免疫结合池21与免疫检测池31之间的阀门，顺逆时针旋转震荡芯片5～10s，使得抗原-抗体-磁珠复合物与免疫检测池31中的荧光标记抗体特异性结合，孵育5～10min。在芯片底部利用磁铁富集并固定孵育完成的磁珠，打开免疫检测池31与废液池71之间的阀门，低速离心，将废液排入废液池71。免疫清洗液池41底部由刺破阀刺破后，低速离心，清洗缓冲液流入免疫检测池31内。待清洗缓冲液完全流入，移走芯片底部的磁铁，顺逆时针旋转震荡芯片15～30s，使得清洗缓冲液能够充分溶解未结合的磁珠及荧光标记抗体。免疫检测池31被充分清洗后，利用磁铁富集并固定已经清洗完成的磁珠，打开免疫检测池31与废液池71之间的阀门，中速离心，将清洗废液排入废液池71。然后免疫缓冲液池51底部由刺破阀刺破，关闭其他阀门，低速离心，检测缓冲液流入免疫检测池31内。待检测缓冲液完全流入，移走芯片底部的磁铁，顺逆时针旋转震荡芯片5～10s，使得检测缓冲液能够充分分散磁珠。当磁珠被充分分散时，其上所特异性结合的抗体-抗原-荧光标记抗体也因此被充分分散，此时可以进行荧光检测。

然后将分流池22和样本裂解池62之间的阀门打开，低速离心，分流池22内的抗原-抗体-磁珠复合物混合液流入样本裂解池62内。待混合液完全流入样本裂解池62内，关闭分流池22和样本裂解池62之间的阀门，裂解液池63底部由刺破阀刺破后，低速离心，使得样本裂解液进入样本裂解池62内。顺逆时针旋转震荡芯片5～10s，使得抗原-抗体-磁珠复合物与样本裂解液充分混合，释放出细胞内部核酸物质。在芯片底部设置磁铁以富集并固定免疫磁珠，打开样本裂解池62与核酸富集池64之间的阀门，低速离心，样本裂解池62内的裂解混合液流入核酸富集池64。待混合液完全流入核酸富集池64内，关闭样本裂解池62与核酸富集池64之间的阀门，孵育10min，期间每隔2min顺逆时针旋转震荡芯片10s，使得混合液与核酸富集池64内预埋的核酸磁珠充分反应。然后在芯片底部设置磁铁以富集并固定核酸磁珠，打开核酸富集池64与废液池71之间的阀门，中速离心，使得废液排入废液池71。

一个核酸清洗液池65的底部由刺破阀刺破，低速离心，含有醇类清洗剂的清洗液流入核酸富集池64内。待清洗液完全流入核酸富集池64内，移走磁铁，顺逆时针旋转震荡芯片15～30s，使得清洗液与捕获了核酸的磁珠充分接触洗涤。在芯片底部设置磁铁以富集并固定核酸磁珠，打开核酸富集池64与废液池71之间的阀门，中速离心，使得清洗废液排入废液池71。另一个核酸清洗液池65的底部由刺破阀刺破，重复上一步骤，使得清洗液与核酸磁珠进行二次洗涤。另一个核酸清洗液池65底部由刺破阀刺破后，低速离心，用于洗去醇类清洗剂的清洗液流入核酸富集池64内，重复上一步骤，洗涤溶解前次清洗液中的醇类残留。核酸洗脱液池66底部由刺破阀刺破，低速离心，洗脱液流入核酸富集池64内。待洗脱液完全流入核酸富集池64内，移走磁铁，顺逆时针旋转震荡芯片10～15s，使得洗脱液与核酸磁珠充分接触后孵育5min，孵育期间每隔2min顺逆时针旋转震荡芯片5～8s，使得核酸从磁珠表面彻底洗脱溶解。再次固定核酸磁珠，中速离心后停止或转为低速离心，含有核酸的洗脱液经过第二虹吸通道68进入分液流道67。待洗脱液全部通过第二虹吸通道68流入并填充满分液流道67，中速或高速离心，使得分液流道67内的洗脱液进入各核酸检测池61(图1中为13个)，并与核酸检测池61内预先包埋的核酸检测试剂混合。然后进行实时荧光定量PCR流程，设备完成核酸扩增及信号检测。

可选地，上述低速离心约为1000～3000rpm，中速离心约为5000rpm～6000rpm，高速离心约为15000rpm～20000rpm，但不限于此。可选地，顺逆时针旋转震荡芯片的参数如下：震荡角度约90°～180°，震荡频率约1～2次/s，震荡时间根据需要选择。

cfDNA分子是人体不同组织释放的DNA混合物，其中一部分来源于肿瘤细胞。肿瘤细胞释放的ctDNA的含量是影响液体活检准确性的一个关键因素。和血细胞数量相比，cfDNA浓度相当低，血浆样本中血细胞污染会极大稀释肿瘤来源的ctDNA，从而影响下游分析。因此优选地，在制备样本液时，尽量降低血液收集和存储过程中的细胞裂解，特别是在血液收集过程中应避免出现溶血。血液样本应该在采集后6小时内进行血浆和血细胞的分离处理，时间超过6小时会导致大量血细胞DNA的释放。使用该芯片仅需从患者体内抽取少量的外周血(几毫升左右)作为样本，这一过程是无创的、即抽即测的、没有任何副作用的样本采集方式，且同一患者能够反复多次采集，不需要通过对患者进行手术或者穿刺等方式来获取组织切片。当然，也能够使用如下规格类型的采血管装载的全血样本：①装载量≥5mL，使用EDTA抗凝采血管，4h内送达检测点；②装载量≥5mL，使用PAXgene ccfDNA采血管或者Streck BCT采血管，6～28℃运输，3天内送达检测点。以上所用采血管为抗凝类采血管(短时间运输存储)或专门进行cfDNA分析的采血管(中长时间运输存储)，含有稳定血细胞的添加物，所用型号和规格不限于上述列举。为了满足测试准确性，要求采血完后需轻轻转动混匀，尽可能装满采血管，以减少因为运输过程中的震动导致的溶血。

在一个具体示例中，利用如图3所示的微流控检测芯片200进行检测的方法与前述步骤基本相同，区别主要在于血液样本加至第一加样池111，随后经过离心沉淀等步骤以进行免疫学检测例如检测人体产生的抗病原体抗体，其他成分相对简单的样品可加至第二加样池112以进行分子生物学检测例如检测病原体核酸。

相对传统检测方法，本发明的微流控检测方法基于上述微流控检测芯片200，可一次性完成大量癌症的风险检查，且检测指标覆盖蛋白标志物的免疫检测及肿瘤靶基因的分子检测，为临床判断提供更加完整、全面的指导信息。所需的样本提取方便，只需抽取5mL静脉血，相对通过手术、组织活检来获取肿瘤标本的侵入性方式，或进行MRI、PET-CT等影像检查，该检测方法属无创无风险，且也无需担心辐射。除样本加样外，其他所有流程均在芯片中完成，无需具备专业知识的医务人员也能够轻松完成检测并得到结果，芯片结构为封闭空间，降低交叉污染，结果准确性更高，干扰更小，且反应过程也不会污染外界环境。患者参与的检测过程耗时极短，且一次抽血即可完成免疫及分子多项检测结果，极大提高检测效率并能够有更具性价比的检测花费。该检测方法为癌症病情追踪和用药指导带来革命性的突破，检测循环肿瘤细胞相关标志物水平以及肿瘤细胞遗传基因的变异情况、含量上的变化，配合分析生理或耐药性，可提供适合个人情况的药物类型和剂量，并可对患者进行综合的预后评估及病情监测，并及时更新适合的治疗方案。芯片可在短时间内同时分析大量的生物指标，快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成千上百倍，兼容几乎所有的免疫及分子检测需要。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种微流控检测芯片，其特征在于，包括至少一个检测单元，所述检测单元包括加样腔体、免疫结合池、免疫检测池、免疫清洗液池、免疫缓冲液池、核酸检测池和废液池；

所述加样腔体用于样本液的输入和存储；所述免疫结合池与所述加样腔体连接，所述免疫结合池用于预装包被有捕获抗体或捕获抗原的捕获载体；所述免疫检测池与所述免疫结合池连接，所述免疫检测池用于预装标记抗体；所述免疫清洗液池与所述免疫检测池连接，所述免疫清洗液池用于预装能够洗去所述标记抗体的清洗缓冲液；所述免疫缓冲液池与所述免疫检测池连接，所述免疫缓冲液池用于预装检测缓冲液；所述废液池与所述免疫检测池连接以用于收容废液；所述核酸检测池与所述加样腔体连接，所述核酸检测池用于预装能够扩增靶序列的PCR反应试剂；

所述微流控检测芯片具有旋转中心，所述免疫结合池、所述免疫检测池和所述废液池自所述旋转中心近心端至远心端依次分布，所述免疫清洗液池和所述免疫缓冲液池相对于所述免疫检测池更靠近所述旋转中心，所述核酸检测池相对于所述废液池更靠近所述旋转中心，所述免疫结合池、所述免疫检测池和所述废液池之间均设有阀门。

2.根据权利要求1所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述加样腔体包括第一加样池和第二加样池，所述免疫结合池与所述第一加样池连接，所述核酸检测池与所述第二加样池连接。

3.根据权利要求1所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述检测单元还包括分流池，所述分流池与所述免疫结合池连接，所述免疫检测池通过所述分流池与所述免疫结合池连接，所述核酸检测池通过所述分流池和所述免疫结合池与所述加样腔体连接；所述分流池相对于所述免疫结合池更远离所述旋转中心，且相对于所述免疫检测池和所述核酸检测池更靠近所述旋转中心，所述分流池与所述免疫检测池和所述核酸检测池之间均设有阀门。

4.根据权利要求1所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述检测单元还包括样本裂解池和裂解液池，所述样本裂解池用于预装能够使核酸释放的酶，所述裂解液池用于预装样本裂解液；所述样本裂解池分别与所述加样腔体和所述裂解液池连接，所述核酸检测池与所述样本裂解池连接，所述样本裂解池相对于所述加样腔体更远离所述旋转中心，且相对于所述核酸检测池更靠近所述旋转中心，所述裂解液池相对于样本裂解池更靠近所述旋转中心。

5.根据权利要求4所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述检测单元还包括核酸富集池、核酸清洗液池和核酸洗脱液池，所述核酸富集池用于预装能够结合核酸的核酸载体，所述核酸清洗液池用于预装能够洗去非核酸杂质的清洗液，所述核酸洗脱液池用于预装能够使核酸与所述核酸载体分离的洗脱液；所述核酸富集池分别与所述样本裂解池、所述核酸清洗液池和所述核酸洗脱液池连接，所述核酸检测池和所述废液池分别与所述核酸富集池连接，所述核酸富集池相对于所述样本裂解池、所述核酸清洗液池和所述核酸洗脱液池更远离所述旋转中心，且相对于所述核酸检测池和所述废液池更靠近所述旋转中心。

6.根据权利要求5所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述核酸检测池的数量为多个，所述检测单元还包括分液流道和第二虹吸通道，所述分液流道通过所述第二虹吸通道与所述核酸富集池连接并自该连接端围绕所述旋转中心延伸，多个所述核酸检测池在所述分液流道的外侧围绕所述旋转中心分布，且各所述核酸检测池均分别与所述分液流道连接。

7.根据权利要求5所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述核酸清洗液池的数量为至少两个，其中至少一个所述核酸清洗液池用于预装含有醇类清洗剂的清洗液，且至少一个所述核酸清洗液池用于预装能够洗去所述醇类清洗剂的清洗液。

8.根据权利要求1～7任一项所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述检测单元还包括沉淀池、分离池和第一虹吸通道，所述分离池相对于所述沉淀池更靠近所述旋转中心，所述沉淀池与所述加样腔体连接，所述分离池与所述沉淀池连接，所述免疫结合池通过所述第一虹吸通道与所述分离池连接。

9.根据权利要求8所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述微流控检测芯片包括依次层叠设置的阀控层、检测核心层和离心层，所述阀门设于所述阀控层上，所述加样腔体、所述免疫结合池、所述免疫检测池、所述免疫清洗液池、所述免疫缓冲液池、所述核酸检测池和所述废液池设于所述检测核心层上，所述沉淀池和所述分离池设于所述离心层上。

10.一种微流控检测方法，其特征在于，采用权利要求1～9任一项所述的微流控检测芯片，所述微流控检测方法包括以下步骤：

将样本液加至所述加样腔体；

将所述样本液释放至所述免疫结合池与所述捕获载体孵育；

将所述捕获载体和所述样本液释放至所述免疫检测池以与所述标记抗体孵育，然后将孵育后的液体排入所述废液池并将所述捕获载体留存于所述免疫检测池；

释放所述免疫清洗液池的清洗缓冲液至所述免疫检测池进行清洗，然后将清洗缓冲液排入所述废液池并将所述捕获载体留存于所述免疫检测池；

释放所述免疫缓冲液池的检测缓冲液至所述免疫检测池，然后检测所述免疫检测池中的所述标记抗体；和/或

将所述样本液释放至所述核酸检测池，然后进行PCR扩增和检测。

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