CN114032295A - 一种人类白细胞抗原abcdrb1dqb1基因分型检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种人类白细胞抗原abcdrb1dqb1基因分型检测方法及试剂盒 Download PDF

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何晓妮
杨健
陈仕安
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Abstract

一种HLA基因分型检测方法，包括以下步骤：步骤1、通过对样本进行处理；步骤2、以处理样本产物为模板，通过特异性的引物组进行HLA不同位点基因长产物扩增；以长片段扩增产物为模板进行测序反应，获得测序反应产物；步骤3、以测序反应产物为待测反应孔，以一代测序仪为平台进行测序反应；步骤4、以测序反应数据进行分析，获得HLA不同位点基因型结果，包含了特异性通用型扩增引物组和特异性扩增引物组组合方式；针对HLA基因分型检测引物设计方法；针对HLA基因分型检测试剂盒，针对HLA基因分型检测单管扩增5位点分管分段测序方法，单次快速完成多个位点的检测；检测结果为4位中高分变率结果。

Description

一种人类白细胞抗原ABCDRB1DQB1基因分型检测方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种微生物领域，具体为一种人类白细胞抗原ABCDRB1DQB1基因分型检测方法及试剂盒。
背景技术
器官移植及骨髓移植是目前许多晚期致命性疾病的有效治疗方式，临床上器官与骨髓移植的成功与否，不仅取决于纯熟的外科技术，供、受者间的免疫***兼容程度亦是一大影响因素，虽然目前的外科技术正不断地进步提升，然而供者的组织抗原引起受者免疫***活化，导致受者体内发生一系列的免疫排斥反应，却是影响移植受者存活的主要障碍之一。
人类白细胞抗原分子在T细胞免疫的专一性鉴别中扮演着极重要的角色，在器官或骨髓的移植过程中，捐赠者及受赠者的人类白细胞抗原分子兼容程度对于移植结果有相当大的影响，因此双方的人类白细胞抗原分子型别鉴定测试在移植的前是一个绝对必要的步骤，过去人类白细胞抗原分子型别鉴定测试都是以血清学方式进行的，而编码人类白细胞抗原的基因是HLA，HLA位于人类第六对染色体短臂上的人类白细胞抗原分子基因具有很高的多样性，包括A、B、C、D(DR、DQ、DP)、E、F等基因，其中以A、B、C、DRB1、DQB1与移植时的免疫排斥反应最为相关，也是移植之前必须进行分型的基因。人类白细胞抗原分子基因序列解密后发现大多人类白细胞抗原分子间仅有极少数、甚至只有一个氨基酸的差异存在。传统的以血清学方式进行抗原分子鉴定测试的方法已经无法满足临床需求，因此，本发明基于一代测序(Sanger法)技术，通过设计针对HLA基因A、B、C、DRB1、DQB1的特异性扩增引物和测序引物以及高效特异性的试剂方法，完成HLA基因分型的检测。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种人类白细胞抗原ABCDRB1DQB1基因分型检测方法及试剂盒。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种HLA基因分型检测方法，包括以下步骤：
步骤1、通过对样本进行处理；
步骤2、以处理样本产物为模板，通过特异性的引物组进行HLA不同位点基因长产物扩增；以长片段扩增产物为模板进行测序反应，获得测序反应产物；
步骤3、以测序反应产物为待测反应孔，以一代测序仪为平台进行测序反应；
步骤4、以测序反应数据进行分析，获得HLA不同位点基因型结果。
进一步的，所述样本处理方式为核酸处理方式，核酸释放剂处理产物。
进一步的，所述核算处理方式具体包括：通过纯化试剂盒进行核酸提取纯化产物；以核酸释放剂对样本进行核酸释放的产物；以免提取试剂盒的其他方式处理的核酸产物，包括物理法的加热、速冻，研磨或样本稀释。
进一步的，所述特异性的引物组由HLA A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DRB1位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组组成。
进一步的，还包括特异性扩增引物组扩增长片段产物的方法，包括但不限于以下一种或多种：
1)5位点特异性扩增引物组多扩增子单管扩增；
6)A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组一类分子扩增引物组MIX和DRB1及DQB1扩增组Mix,实现两管扩增HLA 5位点长片段产物；
7)A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组、DRB1位点特异性的扩增引物组独立扩增长产物，实现为5位点单独扩增；
8)A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组2管分段扩增长片段、DRB1位点特异性的扩增引物组2管分段扩增长片段，实现为5位点6～7个单独扩增子；
9)A、B、C、DRB1、DQB15位点多扩增子单管扩增，实现5位点多重PCR。
进一步的，对上述长片段产物进行测序反应，长片段产物模板包括但不限于单位点单管扩增引物组产物、多位点单管扩增引物组产物、多位点多管扩增产物中的一种或多种。
进一步的，长片段产物模板为纯化产物；纯化方式包含但不限于以下中的一种或多种，优先酶消化法；珠纯化法，磁珠包括但不限于以下几种：XP beads、SPRI beads；酶消化法，酶由0.1～100U虾碱性磷酸酶和0.1～100U的EXO I组成。
进一步的，所述测序反应由特异性位点的测序引物和测序反应试剂组成，测序引物按照不同位点和测定的区域不同进行分孔单独做测序反应，测序反应为单侧单引物的线性PCR扩增，测序反应试剂由BigDYE试剂、DNA聚合酶、PCR反应buffer、Mg2+等组成。
一种HLA ABCDQB1DRB1高分辨基因分型检测试剂盒，试剂由扩增试剂和测序试剂、核酸聚合酶、扩增缓冲液组成；扩增试剂由通用型的扩增引物组反应液和组特异性引物组反应液组成，测序试剂由根据不同位点及关注外显子数量不同而设计的不同测序引物、Tris-HCl缓冲液组成；核酸聚合酶有高保真的长产物扩增DNA聚合酶组合，包含但不限于EZ-Taq酶。
扩增试剂由扩增引物、dNTP等组成，扩增缓冲液由缓冲液、金属辅酶、特异性增强剂组成，本发明提供的检测试剂盒可适用的测序仪包含但不限于：ABI3130、ABI 3500、ABI3730中的一种或多种。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种人类白细胞抗原ABCDRB1DQB1基因分型检测方法及试剂盒，具备以下有益效果：
包含了特异性通用型扩增引物组和特异性扩增引物组组合方式；针对HLA基因分型检测引物设计方法；针对HLA基因分型检测试剂盒，针对HLA基因分型检测单管扩增5位点分管分段测序方法，单次快速完成多个位点的检测；检测结果为4位中高分变率结果。
附图说明
图1为A位点的检测图；
图2为B位点的检测图；
图3为C位点的检测图；
图4为DRB1位点的检测图；
图5为DQB1位点的检测图。
具体实施方式
一种HLA基因分型检测方法，该检测方法首先通过对样本进行处理；以处理样本产物为模板，通过特异性的引物组进行HLA不同位点基因长产物扩增；以长片段扩增产物为模板进行测序反应；以测序反应产物为待测反应孔，以一代测序仪为平台进行测序反应；以测序反应数据进行分析，获得HLA不同位点基因型结果；
进一步地，所述样本处理方式包括但不限于以下一种或多种，优先的核酸处理方式为核酸释放剂处理产物；：
1、通过纯化试剂盒进行核酸提取纯化产物；
2、以核酸释放剂对样本进行核酸释放的产物；
3、以免提取试剂盒的其他方式处理的核酸产物，包括物理法的加热、速冻，研磨、样本稀释等方式；
进一步地，所述特异性的引物组由HLA A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DRB1位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组组成；
本发明提供了一种特异性扩增引物组扩增长片段产物的方法，包括但不限于以下一种或多种，优先地5位点特异性扩增引物组多扩增子单管扩增；
1、A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组一类分子扩增引物组MIX和DRB1及DQB1扩增组Mix,实现两管扩增HLA 5位点长片段产物；
2、A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组、DRB1位点特异性的扩增引物组独立扩增长产物，实现为5位点单独扩增；
3、A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组2管分段扩增长片段、DRB1位点特异性的扩增引物组2管分段扩增长片段，实现为5位点6～7个单独扩增子；
4、A、B、C、DRB1、DQB15位点多扩增子单管扩增，实现5位点多重PCR。
本发明提供了一种长片段产物进行测序反应的方法；
进一步地，所述的长片段产物模板包括但不限于单位点单管扩增引物组产物、多位点单管扩增引物组产物、多位点多管扩增产物中的一种或多种，优先地多位点单管扩增引物产物；
进一步地、所述的长片段产物模板为纯化产物；纯化方式包含但不限于以下中的一种或多种，优先酶消化法；
1、珠纯化法，磁珠包括但不限于以下几种：XP beads、SPRI beads，优先XP beads；
2、酶消化法，酶由0.1～100U虾碱性磷酸酶和0.1～100U的EXO I组成，优先地1U虾碱性磷酸酶和10U exo I酶；
进一步地，所述测序反应由特异性位点的测序引物和测序反应试剂组成；
进一步地，测序引物按照不同位点和测定的区域不同进行分孔单独做测序反应；
进一步地，测序反应为单侧单引物的线性PCR扩增；
进一步地，测序反应试剂由BigDYE试剂、DNA聚合酶、PCR反应buffer、Mg2+等组成；
进一步地，测序反应是由0.1～50ng的长片段产物、0.5～100uM测序引物，BigDYE反应液组成，优先地的反应体系为：2.5uM测序引物、2～5ng长片段产物，1.5ul BigDYE反应液。
本发明还提供了针对HLA基因分析检测的特异性扩增引物和测序引物设计方法；
进一步地，所述特异性测序引物针对HLA不同基因位点的特异性检测靶标区域设计的一对或多对引物组；
进一步地，所述特性扩增引物组由通用型扩增引物组和组特异性引物组组成；
进一步地，所述通用型扩增引物组覆盖大部分分型，主要设计区域为3’UTR或5‘UTR区域或内含子区域内；
进一步地，所述特异性扩增引物组或组特异性引物组由全完全与模板互补配对碱基组和0～5不互补配对碱基组成；
进一步地，所述特异性扩增引物具有Tm调节能，引物有0～5个LAN修饰；
进一步地，所述特异性扩增引物3’倒数第二个碱基进行硫代修饰；
进一步地，所述组特异性引物组为针对该组内特异性的分型设计的特异性引物；
进一步地，所述HLA不同基因位点检测靶标区域包含A位点exon 2～exon6区域；B位点包括exon2～exon 5区域，C位点包括exon2～exon 5区域，DRB1位点包括exon2～exon5区域，DQB1位点包括exon2～exon 5区域。
本发明提供了一种HLA ABCDQB1DRB1高分辨基因分型检测试剂盒，试剂由扩增试剂和测序试剂、核酸聚合酶、扩增缓冲液组成；
进一步地，扩增试剂由通用型的扩增引物组反应液和组特异性引物组反应液组成；
进一步地，扩增试剂由扩增引物、dNTP等组成；
进一步地，测序试剂由根据不同位点及关注外显子数量不同而设计的不同测序引物、Tris-HCl缓冲液组成；
进一步地，核酸聚合酶有高保真的长产物扩增DNA聚合酶组合，包含但不限于EZ-Taq酶；
进一步地，扩增缓冲液由缓冲液、金属辅酶、特异性增强剂组成。
本发明提供的检测试剂盒针对的样本类型包含但不限于：口腔脱落细胞、全血、头发、皮肤、体液中一种或多种。
本发明提供的检测试剂盒可适用的测序仪包含但不限于：ABI3130、ABI 3500、ABI3730中的一种或多种。
为进一步理解本发明方法，结合具体实施方式进行描述；
首先采用核酸提取试剂盒对全血样本进行核酸提取纯化，再将纯化产物按照单位点单管扩增方式进行扩增，扩增产物采用酶消化方式进行消化，以除去多余的扩增引物及dNTPs；酶消化产物进行测序反应，测序反应产物进行乙醇沉淀纯化或磁珠纯化，纯化产物进行定序，定序结果进行数据分析，获得数据分型结果。
实施例1HLA ABCDRB1DQB1引物设计及筛选
1.1引物设计
根据hla database中IWHG数据库中，设计A B C DRB1 DQB1相应位点特异性扩增引物(通用型扩增引物和组特异性扩增引物)和测序引物
通用型扩增引物组
A A_L_01:GCCGACCCAGTTCTCACTCC
A_L_02:GCGGACCCAGTTCTCACTCC
A_L_03:AAGAAACCCCATAGCAGAGCT
A_L_04:AAGAAACCCCATAGCACAGCT
B
B_L_01:GTCCTTCTTCCGGGATACTCG
B_L_02:GGTCCTTCTTCCAGGATACTCG
B_L_03:ACAACAGTCATGAACAAATTGTGG
C
C_L_01:GTCCTTCTTCCTTGATACTC
C_L_02:GATCTTGAAGTCGTGAGGAG
C_L_03:AGTTCTTGAAGTCAGTTGAGGAG
DRB1
DRB1_L1_01CGTACTTGAGCGCACGTTTCTTGGAGTACTC
DRB1_L1_02CGTACTTGAGCGCACGTTTCTTGGAGGAGGT
DRB1_L1_03CGTACTTGAGCGCACGTTTCTTGTGGCAGCT
DRB1_L1_04CGTACTTGAGCGCACGTTTCCTGTGTCAGCC
DRB1_L1_05TCAGCACAGTGCCACGTTAGTTGGAGCAGGT
DRB1_L1_06TCAGCACAGTGCCACGTTTCCTGGGGCAGGG
DRB1_L1_07TCAGCACAGTGCCACGTTTCTTGAAGCAGGA
DRB1_L1_08CAGTGACCAGCAGGCGTGCTCACCTCGCCGCT
DRB1_L1_09CAGTGACCAGCAGGCATGCTCACCTCGCCTCT
DRB1_L2_01CTTGCCTGCTTCTCTGG
DRB1_L2_02CTTGCCTGCTGCTCTGG
DRB1_L2_03CTCACCTGCTCCTCTGG
DRB1_L2_04AGAATTTGGGATCCATA
DRB1_L2_05AATAAGTTGGGATCCAA
DRB1_L3_01ATGATTTGGGATCCATA
DRB1_L3_02TTGACAATGCATGACA
DRB1_L3_03CTTGATGTAAGGCAAG
DQB1_L1_01GCCGCCGGGCCGATCCTAG
DQB1_L1_02CCGCCGGTTGGATCATAA
DQB1_L1_03CAGGTTCCAGGTGTAACGA
DQB1_L1_04GGCTCAGGTTCCACGGTGATT
DQB1_L1_05GCTCAGGTTCCACAGTCCG
DQB1_L1_06CTCAGGTTTCGGTGATGCCGC
DQB1_L1_07GTGGAATGAAACCTTAGGCTT
DQB1_L1_08GGTGGAATGACCCGGCTTAGA
DQB1_L1_09GTTTTCCTGTCTGAAGCTGCC
DQB1_L1_10TTTGGGTGTGTGTTACTGCCC
DQB1_L1_11TCAGGGATAACTGCTGGTAAGG
组特异性扩增引物组
A01_01TTCTCCCTCTCCCAACCTAC
A01_02GTCGGCCCATGATTCTGGAAG
A02_01 CGTGTCTTCGCGGTCGCTC
A02_02GTCGGCCCATGATTCTGGAAG
A03_01CTGCTACTCTCGCGGGCT
A03_02CCAGTGATCACAGCTCCAAAG
A04_01CCCAGGCGTGCCTCTCAGA
A04_02TAGGCGCATGATTGTGGAC
A05_01GACAGAGCGCTTGGCACAGA
A05_02TGATGCCCACCATGTGGAC
A06_01CCCTGACCCAGACCTGGGCA
A06_02ACCCCTTCTCCACCTCAGCTG
A07_01CGCAGTTTCTTTTCTGCCTCTG
A07_02 CCACCCTTCATCCCTTCA
A08_01 GGTGTATGGATTGGGCAGTCA
A08_02 ACTCCCTCCTTTTCTATCTGTGA
A09_01 GGGCTCAGGGCGAAGTA
A09_02CAGGTCCCATCACCGCCA
A10_01 GCAGTTTCTTTTCTCCCTCTC
A10_02 CCCAGGCTGGGTAGGCTC
A11_01ATGCCGAGCGTTTCTCCCA
A11_02CCAGTGATCACAGCTCCAAAG
A12_01 GACATTGAGACAGAGCGCTTC
A12_02 GGTCCTAGAGGAACGTCGTAGC
B01_01 CCCACTCCCATTGGGTATTG
B01_02 CGTACTTGAGCGCACGTTTCTTGGAGTACTC
B02_01 ACCCACCCGGACTCAGAG
B02_02 CCCCAACACCACAAGCAC
B03_01 GGTCTCAGGCTCCGAGAGCCTT
B03_02 TCAGCACAGTGCCACGTTTCCTGGGGCAGGG
B04_01 AGGATACTCGTGACGCA
B04_02 CGTACTTGAGCGCACGTTTCTTGGAGGAGGT
B05_01 CAGAGTCTCCTCACACGCCA
B05_02 CGTACTTGAGCGCACGTTTCTTGGAGGAGGT
B06_01 CTGCTGCTCTCGGGA
B06_02 CAACCATCAAGGCGATACATCT
B07_01 ATTGGGGACGCGCAGCA
B07_02 GGAACCTCCTCGTCTTGGAA
B08_01 CTCCCATTGGCTGTCGGGTG
B08_02 CGTACTTGAGCGCACGTTTCTTGTGGCAGCT
B09_01 GGTCTCAGGCTCCGAGAGCCTT
B09_02 TGGGAAAGGAGGCGAAGAC
B10_01 GGTCTCAGGCTCCGAGAGCCTT
B10_02 CTCCACCTCCTCACATTAG
B11_01 CTCCCATTGGCTGTCGGGTG
B11_02 CGTACTTGAGCGCACGTTTCTTGGAGTACTC
B12_01 CCAATCAGCCTCGCCGT
B12_02 CCCCAACACCACAAGCAC
B13_01 ACCCACCCGGACTCAGAA
B13_02GCTCCTCCACACTCCCG
B14_01 CCAATCAGCCTCGCCGT
B14_02 GGACCTGGTCAGAACCCT
C
C01_01 TCTGCGGGGGGGAACAAGGT
C01_02 AAAGCAGACTTGGGTTATGA
C02_01 CTTCTTCTCCGCGTTTGCGA
C02_02 GATCTTGAAGTCGTGAGGAG
C03_01 CTTCTTCTCCGCGTTTGCGA
C03_02 CTACACATCACTGTAGCCAT
C04_01 TCTCCGCAGTCCTGGATTCTG
C04_02 GGTTGCGTCATGGTAAGTGATC
C05_01 AGGGAACCCTGGCCTATGG
C05_02 GGCTCTTGAATTTACAAATGA
C06_01 CCTGAGTTTCACTTCATGVTATT
C06_02 GATCTTGAAGTCGTGAGGAG
C07_01 CCAGTCACCCAGTGGAACTCG
C07_02 TACACAACTGACAAAAGCCAT
C08_01 AGTCACCCACTGGGATTCAC
C08_02 CACACTCGAGTGCTGTCCCA
C09_01 GTCCTTCTTCCTTGATACTC
C09_02 GGGAAAGGCTGGCTGTAGGTC
C10_01 CCAGTCACCCAGTGGAACTCG
C10_02 TGCTAACAGGGTGGTAGACG
C11_01 TCTCCGCAGTCCTGGATTCTG
C11_02 TCTCTCCAACTTGCCTCAT
C12_01 ACTCACAAACTCCGTTAGAG
C12_02 AAAGCAGACTTGGGTTATGA
DRB1
DRB1_01_01CCCAGTGCCCGCACCCT
DRB1_01_02CACACTCAGATTCTCCGCTT
DRB1_02_01CGGTGGGTGCTCTTGAAGGT
DRB1_02_02 ACACACACACACTCAGATTCCCA
DRB1_03_01 GCACTAAGGAAGGGTTCAG
DRB1_03_02 ACACACACACACTCAGATTCCCA
DRB1_04_01 CTTGGGATCAGAGGTACTTTTT
DRB1_04_02 ACACACACACACACTCAGATTCTCC
DRB1_05_01 GCGTCGCTGTCAGTGTT
DRB1_05_02 AGATTCCCAGCTCGGAGA
DRB1_06_01 CGCAGGCCACGCACAAA
DRB1_06_02 ATTCTAAATGCTCACAGATGG
DRB1_07_01TCAGTTAAGGTTCGAGTGCCA
DRB1_07_02 ACACACACACACTCAGATTCCCA
DRB1_08_01GCGTTGCGGGTCGGCG
DRB1_08_02 ACACACACACTCAGATTCCCA
DRB1_09_01 AACAGGCTGGAGGTAGGGAC
DRB1_09_02 ACACACACACACTCAGATTCCCA
DRB1_10_01 GGTGGGCGTTGCGGCG
DRB1_10_02 ACACACACACACTCAGATTCCCA
DRB1_11_01GGGCGTTGCGCCGGC
DRB1_11_02 ACACACACACACTCAGATTCCCA
DQB1
DQB1_01_01CGGGCCGGCCCGAACTTCT
DQB1_01_02GTCAGGTTCCAGTCGGCTACG
DQB1_02_01GGGAGGACTTCAAGTCTGC
DQB1_02_02TCAGGTTCCCAGAGGATTCGC
DQB1_03_01CAGGAACCGGGATTCCC
DQB1_03_02AAGGATGGGCCATGCAGAC
DQB1_04_01GCAGGAACGCGGATTCCG
DQB1_04_02AGGATGAAGCTTGCGGAC
DQB1_05_01GGGAGGATCGGAGGTTTGGG
DQB1_05_02AGACTAGAGGTCGGTGCTAAC
DQB1_06_01GCCGCCGGGATTATCCTAG
DQB1_06_02GCCGCCGGGCCGATCCTAG
DQB1_06_03GGTGGAATGACCCGGCTTAGA
测序引物：
A
A1F GTGTCGGGTTTCCAGAG
A2F TTGGGGACGGGGCTG
A3F GTTTCATTTTCAGTTTAGGC
A4F GTGTCTGGGTTCTGTGCTC
A2R CGGACCCGGAGACTGT
A3R TGTTGGTCCCAATTGTCTC
A4R ATAGAGGCTCCTGCTTTCC
A5F RGACCTTTAGCAGGGTCAG
B
B1F GTCCCAGTTCTAAAGTCCC
B2F01 GGGTCTCAGCCCCTCCTC
B2F02 GGGTCTCAGCCCCTCCTG
B2F03 GGGTTTCAGCCCCTCCTC
B2F04 TGGGTCTCAGCCCCTCCTT
B2F05 CAGGAACCGGGATTCCC
B2F06 CTGGGGACTGGGCTGAC
B3F01TTGGGGACGGGGCTGAC
B3F02 CTGGGGACGGGGCTGAC
B3F03 CTGGGGACGGTGCTGAC
B3F04 TTGGGGACTGGGCTGAC
B4F CATGGGTGGTCCTAGGGTG
B2R GTCGTGACCTGCGCCC
B3R GAGGGCGACATTCTAGCG
B4R GGCTCCTGCTTTCCCTG
B5R AGACCCCACCCCTCAC
C
C1R ATGCTGAGACCCCCCCGAC
C2F GCGCAGGACCCCCGGGAGAG
C2R AGGCCGTCCGTCCGGGATG
C3F GGGGGACGGGAAGCTGAC
C3R CGGGGGACGGAAGCTGAC
C4F01 GGGGGACCGGAAGCTGAC
C4F02 GGGGGACTGGAAGCTGAC
C4R01 GCGGGACGGGAAGCTGAC
C4R02 ATTTTCCTCCCCTCCTCG
C4R03TTCTCAGGATGGCATGGG
C4R04 TTCTCAGGATAGCATGGG
C4R05 GCTGAAGGGCAGGCGGAC
C4R06 GAAGGGCTCCGCCGGCC
C5R GAAGGGCTCCCGGCCAGGAC
C6F CACACAGGGTGGCCAGGC
C7R01 GACTAGGACCGGTTCCCC
C7R02 CACACTCGAGTGCTGTCCCA
C7R03 CACACTCGGGGC GTCCCA
C7R04 ACACATTCGGGGCGTCCCT
DRB2F01 TCGTGTCCCCACAGCA
DRB2F02 TCTTGTCCCCCCAGCA
DRB2F03 TTGTGCCCCCACAGCA
DRB2R01GCTCACCTCGCCGCTG
DRB2R02 GCTTACCTCGCCTCTG
DRB2R03 GCTCACCTCGTCGCTG
DRB2R04 GCTCACCTCGCCTCTG
DRB2R-86 CACTGTGAAGCTCTCCAC
DRB1F CCTGGTCCTGTCCTGTT
DRB1R CTGGGCACAATGTTAAC
DRB3F CACTATCAAGATTAAG
DQB1
DQB2F01 CTGACTGGGGCGTGATTC
DQB2F02 CTGACTGGGGGGTGATTC
DQB2F03 CTGACCGGGGGGTGATTC
DQB2R01 GGCGACGAGCCCTCACCTC
DQB2R02 GTCAACCAGCCCTCACCTC
DQB3F01CCCTGTCTGAAACTGGCCTC
DQB3F02 TCCTGTCTGAAACTGGCCTT
DQB3R01 AACAGAAACTCTTTATCTGCTTAC
DQB3R02 AACAGAAACTCTTTATCCGCTTAC
1.2从IHWG购置如下HLA标准品细胞株DNA，IHWG标准品HLA ABCDRB1DQB1基因型如表所示：阴性质控品采用HLA缺陷型细胞株K5602的DNA,非人源的基因组DNA(斑马鱼、拟南芥)
Figure BDA0003421795960000171
Figure BDA0003421795960000181
Figure BDA0003421795960000191
1.3试剂配制
1.3.1引物配制
将A位点通用型扩增引物按照A01 A03，A01 A04，A02A03，A02A04，A01A03A04A02A03A04，A01A02A03A04进行组合，引物浓度按照等摩尔数混合，进行引物组筛选；
将B位点通用型扩增引物按照B01B02，B01B03，B01B02B03进行组合，引物浓度按照等摩尔数混合，进行引物筛选；
将C位点通用型扩增引物按照C01C02，C01C03，C01C02C03进行组合，引物浓度按照等摩尔数混合，进行引物筛选；
将DRB1通用型扩增引物先按照DRBL101020304等摩尔数混合，命名为DRBL1_01，DRBL1050607等摩尔数混合,命名为DRBL1_02，DRBL10809等摩尔数混合，命名为DRBL1_03；再由DRBL1_01与DRBL1_02，DRBL1_01与DRBL1_03，DRBL1_01、DRBL1_02与DRBL1_03进行等摩尔数混合，进行引物筛选；
将DRB1通用型扩增引物先按照DRBL2010203等摩尔数混合，命名为DRBL2_01，DRBL10405等摩尔数混合,命名为DRBL2_02；再由DRBL2_01与DRBL2_02进行等摩尔数混合，进行引物筛选；
将DRB1通用型扩增引物按照DRBL30102，DRBL30103，DRBL3010203组合，进行引物筛选；
将DQB1通用型扩增引物先按照DRBL1010203等摩尔数混合，命名为DQBL1_01，DQBL10405等摩尔数混合,命名为DQBL1_02；DQBL1060708等摩尔数混合,命名为DQBL1_03；DQBL10091011等摩尔数混合,命名为DQBL1_04；再由DQBL1_01与DQBL1_03,DQBL1_01与DQBL1_04,DQBL1_02与DQBL1_03,DQBL1_02与DQBL1_04,DQBL1_01、DQBL1_02与DQBL1_03,DQBL1_01、DQBL1_02与DQBL1_04,DQBL1_01、DQBL1_02与DQBL1_03、DQBL1_04,进行组合，进行等摩尔数混合，进行引物筛选；
1.3.2反应液配制
按照EZ-Taq酶和反应液进行扩增反应，用于测试筛选扩增通用型引物。
组份 用量
EZ-Taq酶5U/ul 0.25ul
反应液 5
不同位点的扩增引物MIX 1
标准品DNA模板 50ng
NF-H2O 补至12.5ul
按照上述表格配制反应体系，混匀PCR反应体系置于PCR仪上，按照如下反应程序进行PCR扩增：
Figure BDA0003421795960000201
Figure BDA0003421795960000211
反应结束后，采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物
1.3.3实验结果
根据不同位点的引物组筛选测试获得，如下实验结果：
Figure BDA0003421795960000212
Figure BDA0003421795960000221
ID B01B02 B01B03 B01B02B03
IHW09009 单一条带、条带较亮 有非特异性条带 单一条带、条带较亮
IHW09014 有非特异性条带 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09024 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09053 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09103 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09297 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09368 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09372 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09373 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09374 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09398 有非特异性条带 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
IHW09462 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮 单一条带、条带较亮
K5602 无条带 无条带 无条带
拟南芥DNA 无条带 无条带 无条带
斑马鱼DNA 无条带 无条带 无条带
Figure BDA0003421795960000222
Figure BDA0003421795960000231
Figure BDA0003421795960000232
Figure BDA0003421795960000241
Figure BDA0003421795960000251
Figure BDA0003421795960000252
Figure BDA0003421795960000261
实施例2不同反应体系优化测试
2.1不同反应buffer体系配制
于一般的PCR检测***，HLA检测所使用的PCR缓冲液必须具备以下几个特性：(1)进行PCR反应时不使用矿物油隔绝，故必须能容忍小部分体积蒸发造成浓度的些许差异；提供适合高GC含量及高相似度的引物进行PCR的反应条件。为符合上述条件，我们测试了10种不同缓冲液组成成份的比例，具体信息见表7实验结果证明其中编号#6为最适合作为产品使用的缓冲液条件。
Buffer #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10
KCl(mM) 100 100 100 100 100 50 75 50 75 50
TrispH8.5 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15
dNTP(mM) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
MgCl2(mM) 2.5 2.5 2.0 2.0 2.0 2.0 1.5 1.5 1.5 1.0
BSA(％) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Betaine(M) 1 1.5 1 1.5 0.5 1 0.5 1 1 1
Glycerol(％) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
2.2PCR反应体系的配制
按照实施例1筛选的最佳引物通用型引物组进行反应体系配制，按照实施例1步骤进行PCR反应体系配制；
2.3标准品检测
按照实施例1中标准品，选择相应的标准品进行标准品检测
2.4实验结果
具体试验结构惨遭说明书附图。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种HLA基因分型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、通过对样本进行处理；
步骤2、以处理样本产物为模板，通过特异性的引物组进行HLA不同位点基因长产物扩增；以长片段扩增产物为模板进行测序反应，获得测序反应产物；
步骤3、以测序反应产物为待测反应孔，以一代测序仪为平台进行测序反应；
步骤4、以测序反应数据进行分析，获得HLA不同位点基因型结果。
2.根据权利要求1所述的一种HLA基因分型检测方法，其特征在于，所述样本处理方式为核酸处理方式，核酸释放剂处理产物。
3.根据权利要求2所述的一种HLA基因分型检测方法，其特征在于，所述核算处理方式具体包括：通过纯化试剂盒进行核酸提取纯化产物；以核酸释放剂对样本进行核酸释放的产物；以免提取试剂盒的其他方式处理的核酸产物，包括物理法的加热、速冻，研磨或样本稀释。
4.根据权利要求3所述的一种HLA基因分型检测方法，其特征在于，所述特异性的引物组由HLA A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DRB1位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组组成。
5.根据权利要求4所述的一种HLA基因分型检测方法，其特征在于，还包括特异性扩增引物组扩增长片段产物的方法，包括但不限于以下一种或多种：
1)5位点特异性扩增引物组多扩增子单管扩增；
2)A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组一类分子扩增引物组MIX和DRB1及DQB1扩增组Mix,实现两管扩增HLA 5位点长片段产物；
3)A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组、DRB1位点特异性的扩增引物组独立扩增长产物，实现为5位点单独扩增；
4)A位点特异性的扩增引物组、B位点特异性的扩增引物组、C位点特异性的扩增引物组、DQB1位点特异性的扩增引物组2管分段扩增长片段、DRB1位点特异性的扩增引物组2管分段扩增长片段，实现为5位点6～7个单独扩增子；
5)A、B、C、DRB1、DQB15位点多扩增子单管扩增，实现5位点多重PCR。
6.根据权利要求5所述的一种HLA基因分型检测方法，其特征在于，对上述长片段产物进行测序反应，长片段产物模板包括但不限于单位点单管扩增引物组产物、多位点单管扩增引物组产物、多位点多管扩增产物中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的一种HLA基因分型检测方法，其特征在于，长片段产物模板为纯化产物；纯化方式包含但不限于以下中的一种或多种，优先酶消化法；珠纯化法，磁珠包括但不限于以下几种：XP beads、SPRIbeads；酶消化法，酶由0.1～100U虾碱性磷酸酶和0.1～100U的EXO I组成。
8.根据权利要求7所述的一种HLA基因分型检测方法，其特征在于，所述测序反应由特异性位点的测序引物和测序反应试剂组成，测序引物按照不同位点和测定的区域不同进行分孔单独做测序反应，测序反应为单侧单引物的线性PCR扩增，测序反应试剂由BigDYE试剂、DNA聚合酶、PCR反应buffer、Mg2+等组成。
9.一种HLA ABCDQB1DRB1高分辨基因分型检测试剂盒，试剂由扩增试剂和测序试剂、核酸聚合酶、扩增缓冲液组成；扩增试剂由通用型的扩增引物组反应液和组特异性引物组反应液组成，测序试剂由根据不同位点及关注外显子数量不同而设计的不同测序引物、Tris-HCl缓冲液组成；核酸聚合酶有高保真的长产物扩增DNA聚合酶组合，包含但不限于EZ-Taq酶。
10.扩增试剂由扩增引物、dNTP等组成，扩增缓冲液由缓冲液、金属辅酶、特异性增强剂组成，本发明提供的检测试剂盒可适用的测序仪包含但不限于：ABI3130、ABI 3500、ABI3730中的一种或多种。
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