CN111363793A

CN111363793A - 一种免提取全血pcr扩增反应体系及其扩增试剂盒和扩增方法

Info

Publication number: CN111363793A
Application number: CN202010228962.8A
Authority: CN
Inventors: 周杰锋
Original assignee: Ningbo Ajcore Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ningbo Ajcore Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2020-07-03

Abstract

本申请涉及全血核酸扩增方法，尤其涉及一种免提取全血PCR扩增反应体系及其扩增试剂盒和扩增方法。一种免提取全血PCR扩增反应体系，该反应体系由以下组分构成：α‑环糊精2.0‑8.0%；海藻糖10‑25%；左旋肉碱3.0‑15%；PVP2.0‑8.0%；Tris‑HCl 20‑80mM；硫酸铵5.0‑20mM；硫酸镁1.0‑7.0mM；pH8.0‑9.5；余量为水，上述的百分比为质量百分比。该反应体系不需另外加入核酸释放剂，通过α‑环糊精、海藻糖、左旋肉碱的配合作用就能起到很好的扩增作用，扩增效率高，减少了全血中对PCR的抑制作用，从而实现了快速的PCR扩增检测。

Description

一种免提取全血PCR扩增反应体系及其扩增试剂盒和扩增方法

技术领域

本申请涉及全血核酸扩增方法，尤其涉及一种免提取全血PCR扩增反应体系及其扩增试剂盒和扩增方法。

背景技术

实时荧光定量PCR技术已广泛应用于遗传病分子诊断、临床检验、动植物进出口检疫、食品安全监测、土壤微生物检测和亲子鉴定等众多领域。由于血液、食物、土壤等样本中含有大量抑制因子，如血红蛋白、高铁血红素、乳铁蛋白、腐植酸等，对常规Taq DNA聚合酶将产生明显的抑制作用。因此，必须先从这些待测样本分离提取核酸，然后用于PCR扩增。核酸提取是核酸检测第一步，也是分子生物学中关键方法之一。为下游核酸检测提供基础，提取质量和完整性直接影响临床研究或诊断。

目前常用于提取外周血中DNA的方法有酚/氯仿提取法、盐析法、碘化钾法、煮沸裂解法等基于这些方法原理开发了很多商品化的DNA提取试剂盒。尽管如此，提取DNA的操作仍然繁琐而费时，DNA质量也参差不齐，而且容易造成样本间交叉污染。如果不经过DNA提取，而直接从全血进行PCR扩增，则可以大大节约试验时间和成本，同时避免因繁多步骤造成的样本间交叉污染。

中国发明专利申请(公开号：CN 103789299A，公开日：2014.05.14)公开一种应用于生物医学分子分析研究领域中的进行全血基因组快速扩增的方法，全血基因组快速扩增的方法是通过核酸释放剂及与之相匹配的PCR反应液来实现的，该方法通过先加入核酸释放剂再加入PCR反应液来配合实现，这样虽然可以减少后续PCR的干扰，但也增加了操作的步骤。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种免提取全血PCR扩增反应体系，该反应体系不需另外加入核酸释放剂，通过α-环糊精、海藻糖、左旋肉碱的配合作用就能起到很好的扩增作用，扩增效率高，减少了全血中对PCR的抑制作用，从而实现了快速的PCR扩增检测。

为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种免提取全血PCR扩增反应体系，该反应体系由以下组分构成：

上述的百分比为质量百分比。

作为优选，该反应体系由以下组分构成：

上述的百分比为质量百分比。

作为优选，该反应体系由以下组分构成：

上述的百分比为质量百分比。

另外，本申请还公开了一种免提取全血PCR扩增试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-3任意一项权利要求所述的反应体系。

作为优选，该试剂盒还包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、dd H2O。

另外，本申请还公开了一种免提取全血PCR扩增方法，该方法包括以下的步骤：按照总体系25ul，分别加入不同血液量，血液加入量分别占总体系的5％-40％，PCR体系采用所述的反应体系；进行PCR扩增。

本申请由于采用了上述的技术方案，具有以下的特点：

1)直接：无需进行费事而昂贵的DNA纯化；

2)快速：10min完成样本制备，最少50分钟完成PCR反应；

3)简便：血液样品无需裂解即可直接PCR，PCR Premix为预混液的形式，减少加样步骤；

4)稳定：另外，本申请也可以加入PPCNA13聚合酶增强蛋白能有效抵抗血液中的抑制剂，从而使PCR预混液体系更为稳定；

5)本申请的反应体系使buffer***更加稳定，同时起到扩增的效果。

附图说明

图1为本申请PCR程序设置图。

图2为以EDTA保持的人血为模板直接扩增人类P53基因片段(400bp)。

图3为直接从人类全血中扩增不同大小的基因片段(0.4-4kb)。

具体实施方式

主要试剂和仪器

仪器：恒温混合仪、涡旋震荡仪、2mL EP管、PCR仪器采用常规设备。

试剂：PVP、Tris-HCl、硫酸铵、硫酸镁由sigma生产；

α-环糊精、海藻糖、左旋肉碱由国药集团生产；。

试剂盒

一种免提取全血PCR扩增试剂盒，该试剂盒包括：

DNA模板	新鲜血液5ul
		反应体系	2x PCR premix 12.5ul
引物	MCB(F+R)0.5ul+0.5ul
		酶	DNA聚合酶2ul
dd H2O	3.5ul
		合计	25ul

反应体系由以下组分构成：

上述的百分比为质量百分比。

试验例1

按照总体系25ul，分别加入不同血液量，血液加入量分别占总体系的5％-40％，采用本申请具体实施方式的PCR扩增试剂盒。PCR程序设置如图1所示。

图2为以EDTA保持的人血为模板直接扩增人类P53基因片段(400bp)，血液加入量为10％。

按照总体系25ul，分别选用不同片段长度的引物(0.4-4kb)，血液加入量分别占总体系的10％，PCR体系如上，PCR程序设置图1所示。

图3为直接从人类全血中扩增不同大小的基因片段(0.4-4kb)。血液的加入量为10％。

试验例2

取15份血液，分成5组，按照总体系25ul，分别加入10％血液量，第一组采用本申请具体实施方式的PCR扩增试剂盒。第二组反应体系中不加入α-环糊精、海藻糖和左旋肉碱；第三组反应体系中不加入α-环糊精；第四组反应体系中不加入海藻糖，第四组反应体系中不加入左旋肉碱。PCR程序设置如图1所示。以EDTA保持的人血为模板直接扩增人类P53基因片段。通过DNA分光光度法检测，数据如表1所示。

表1

组别	D<sub>260nm</sub>	D<sub>280nm</sub>	D<sub>260nm/</sub>D<sub>280nm</sub>
				第一组	0.099	0.054	1.8446
第二组	0.074	0.053	1.3962
				第三组	0.085	0.052	1.6346
第四组	0.087	0.054	1.6111
				第五组	0.078	0.053	1.4716

从表1可以看出本实验中第一组中PCR扩增的DNA纯度最高，没有蛋白质和苯酚的污染，也没有DNA的降解，而第二组-第四组存在明显的降解。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种免提取全血PCR扩增反应体系，其特征在于，该反应体系由以下组分构成：

α-环糊精 2.0-8.0%；

海藻糖 10-25%；

左旋肉碱 3.0-15%；

PVP 2.0-8.0%；

Tris-HCl 20-80mM；

硫酸铵 5.0-20mM；

硫酸镁 1.0-7.0mM；

pH8.0-9.5；余量为水，上述的百分比为质量百分比。

2.根据权利要求1所述的一种免提取全血PCR扩增反应体系，其特征在于，该反应体系由以下组分构成：

α-环糊精 3.0-5.0%；

海藻糖 12-20%；

左旋肉碱 6.0-10%；

PVP 3.0-5.0%；

Tris-HCl 40-60mM；

硫酸铵 8.0-15mM；

硫酸镁 2.0-5.0mM；

pH8.0-9.5；余量为水，上述的百分比为质量百分比。

3.根据权利要求1所述的一种免提取全血PCR扩增反应体系，其特征在于，该反应体系由以下组分构成：

α-环糊精 4.0%；

海藻糖 16%；

左旋肉碱 8.0%；

PVP 4.0%；

Tris-HCl 50mM；

硫酸铵 10mM；

硫酸镁 3.5mM；

pH8.0-9.5；余量为水，上述的百分比为质量百分比。

4.一种免提取全血PCR扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1-3任意一项权利要求所述的反应体系。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、dd H₂O。

6.一种免提取全血PCR扩增方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：按照总体系25ul，分别加入不同血液量，血液加入量分别占总体系的5%-40%，PCR体系权利要求1-3任意一项权利要求所述的反应体系；进行PCR扩增。