CN110791573A - 适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物，所述的微卫星位点为，在滇金丝猴全基因组中筛选重复单元为3‑5碱基，重复数大于8，长度在100‑400bp的微卫星位点；所述的引物为10对引物组：RB1F、RB1R；RB2F、RB2R；RB3F、RB3R；RB4F、RB4R；RB5F、RB5R；RB6F、RB6R；RB7F、RB7R；RB8F、RB8R；RB9F、RB9R；RB10F、RB10R。本发明涉及一种成功率高、特异性强、多态性高的引物，用于滇金丝猴的微卫星个体识别，为滇金丝猴的遗传多样性分析、亲缘关系分析、遗传连锁图谱构建和种质资源库的建立奠定必要基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域。特别涉及滇金丝猴个体鉴定的微卫星分子标记位点及引物与应用技术领域。
背景技术
1.滇金丝猴
滇金丝猴，是中国特有的灵长目物种，被国际自然保护联盟(IUCN)列为濒危(EN)动物红色名录,同时也是我国Ⅰ级重点保护野生动物。目前，滇金丝猴仅分布在滇藏两省交界处澜沧江和金沙江之间一个狭小地域，是中国特有的世界珍宝之一。滇金丝猴还是西北云岭山脉地区及其毗邻的藏东南山地原始森林状况的重要指示物种,其生存状况是检验生态***质量的重要指标。因此，滇金丝猴具有极其重要的保护生物学价值。
2.滇金丝猴个体识别必要性
对滇金丝猴的保护与研究，仅凭借野外调查，不能评估滇金丝猴的遗传多样性，给出合理的保护建议，因此需要分子水平的遗传学研究。而进行滇金丝猴的个体鉴定，是进行遗传学研究的必要基础。
3.滇金丝猴用于个体识别的微卫星标记现状
以微卫星标记为基础的个体鉴定技术是目前动物个体鉴定中应用最为广泛最可靠的手段之一。目前使用文献提供的近缘物种微卫星标记，进行滇金丝猴个体鉴定时，引物扩增效果不良，多态性不足，不能进行个体鉴定。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种成功率高、特异性强、多态性高的引物，用于滇金丝猴的微卫星个体识别，为滇金丝猴的遗传多样性分析、亲缘关系分析、遗传连锁图谱构建和种质资源库的建立奠定必要基础。
本发明采用如下技术方案实现。
适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物，本发明所述的微卫星位点为，在滇金丝猴全基因组中筛选重复单元为3-5碱基，重复数大于8，长度在100-400bp的微卫星位点。
本发明所述的引物为10对引物组：RB1F、RB1R；RB2F、RB2R；RB3F、RB3R；RB4F、RB4R；RB5F、RB5R；RB6F、RB6R；RB7F、RB7R；RB8F、RB8R；RB9F、RB9R；RB10F、RB10R。
本发明所述的引物为10对引物组；其PCR扩增体系为，10μl PCR反应体系：模板2μl、引物F 0.1μl、引物R0.1μl、dNTP 1.2μl、Buffer 2μl、GoldStar DNAPolymerase 0.1μl、ddH2O 4.5μl。
本发明所述的10对引物组的PCR条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，touchdown温度40秒，72℃延伸40秒，设置13个循环反应，touch down温度是指每过一个循环退火温度降0.5℃；94℃变性30秒，退火温度40秒，72℃延伸40秒，设置30个循环反应，60℃后延伸30分钟。
本发明使用所述的微卫星位点筛选得到所述10对引物组的方法包括：对滇金丝猴DNA进行PCR扩增后的扩增产物通过测序仪进行测序，获取结果，并用GeneMapper软件进行位点分析，获取数据峰图，并对测序结果峰图进行了人工校正；测序峰图峰形清晰，峰与峰之间的距离满足重复单元的整数倍，峰的数量满足滇金丝猴物种二倍体鉴定结果的单峰或双峰。
本发明使用所述的微卫星位点筛选得到所述10对引物组的方法包括：提取确定为不同滇金丝猴个体的样品DNA，使用Nanodrop定量仪对其进行定量，定量结果显示DNA样品的核酸浓度为30-400ng/μl、OD260/280为1.7-2.2、OD260/230为1.5-2.0，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示目的条带清晰明亮。
本发明所述的微卫星位点或引物还用于滇金丝猴的遗传多样性分析或亲缘关系分析或遗传连锁图谱构建或种质资源库建立。
本发明的有益效果为，本发明所开发的微卫星分子标记的引物是基于全基因组水平开发的，涉及7条染色体，在基因组不同位置上分布，相互之间无影响。本发明公开的10对微卫星分子标记的引物多态性都较高，10对引物均表现为高度多态性，这为滇金丝猴个体鉴定的研究提供良好的基础，可准确进行滇金丝猴的个体鉴定。除此以外，基于本发明的10对引物的高多态性，因此本发明的微卫星位点与引物可为滇金丝猴的遗传多样性分析、亲缘关系分析、遗传连锁图谱构建和种质资源库的建立奠定必要基础。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1本发明引物RB1引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图2本发明引物RB2引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图3本发明引物RB3引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图4本发明引物RB4引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图5本发明引物RB5引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图6本发明引物RB6引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图7本发明引物RB7引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图8本发明引物RB8引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图9本发明引物RB9引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图10本发明引物RB10引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图11本发明引物RB1引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图12本发明引物RB2引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图13本发明引物RB3引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图14本发明引物RB4引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图15本发明引物RB5引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图16本发明引物RB6引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图17本发明引物RB7引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图18本发明引物RB8引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图19本发明引物RB9引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图20本发明引物RB10引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图21文献中引物D6S271引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图22文献中引物D7S2204引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图23文献中引物D8S505引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图24文献中引物D11S2202引物PCR产物凝胶电泳检测；
图25文献中引物D17S1290引物PCR产物凝胶电泳检测；
图26文献中引物GM108引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图27文献中引物GM109引物PCR产物凝胶电泳检测图；
图28文献中引物GM213引物PCR产物凝胶电泳检测图。
注：1.框内为部分为目的条带；2.胶图下方的M为右侧Marker，每个Marker有6条亮带对应着条带长度(bp)；3.阴为阴性对照。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实验例中所使用的试剂盒、化学试剂和溶剂均为商业化获得。
参考附图：图1至图10为本发明10对引物扩增效果图示。图11至图20位本发明10对微卫星引物15个样品个体识别图。图21至图28为其它微卫星引物选用相同的15个样品进行实验图。(其它微卫星引物来源于文献：Haoet al.2007.Isolation and characterizationof 11microsatellite loci for the Sichuan snub-nosed monkey,Rhinopithecusroxellana.Conservation Genetics,8(5):1021-1024；Liu et al.2008.Identification of13Human MicrosatelliteMarkers via Cross-species Amplification of FecalSamples from Rhinopithecusbieti.Int J Primatol,29:265-272.)
1、在滇金丝猴全基因组中筛选重复单元为3-5碱基，重复数大于8，而长度在100-400bp左右的微卫星位点。
2、基于同源序列利用Primer5.0软件成功设计引物。
3、提取确定为不同滇金丝猴个体的样品DNA，使用Nanodrop定量仪对其进行定量，定量结果显示DNA样品的核酸浓度为30-400ng/μl、OD260/280约为1.7-2.2、OD260/230约为1.5-2.0，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示目的条带清晰明亮，说明已提取到质量较好的DNA。
4、分别使用本发明的10对微卫星引物(表1)对滇金丝猴DNA进行PCR扩增，滇金丝猴DNA被成功扩增，扩增产物使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示目的条带清晰明亮、大小符合预期，且目的条带范围内只存在一条带，此结果验证了实验的可操作性，同时验证了引物的特异性良好。(详细见图1至图10)
表1本发明设计的10对引物
| 引物名称 | 序列 |
| RB1F | GCAAAGACACACACATAGGCTCA |
| RB1R | ATGCCTTCTTTGTCTCTTGATCTT |
| RB2F | AGAGAGAATCCCCCTGAGCAT |
| RB2R | GAGCAAGACTCCATCTCAAAACA |
| RB3F | TTCCAACTAACACTAAAAGGAGGG |
| RB3R | CACAGGGGTGAAAATATTCAAGA |
| RB4F | GACAACCCAGAGCCATCTATGTA |
| RB4R | TGGGTGACAGAGTAAGACTCGGT |
| RB5F | CTGTGGAATCTGCCCATCAA |
| RB5R | GCCTGGACAACAGAGTAAGACAC |
| RB6F | GCTTCTGAATTCTTCCAATGTCC |
| RB6R | CCCTGAATTCCAAGAATGTCAA |
| RB7F | GTCTACTGTGGGTGAACCTGGA |
| RB7R | TGGGCCTAGAAGGTTGTGGT |
| RB8F | AGAGGTTGCAGTGAGCCAAGA |
| RB8R | GGACTACTGCTAAGCAAGGTATCG |
| RB9F | GGGTATCAGTCTGCTTTGGAATC |
| RB9R | GCACAAGTTCCCATTGCCATA |
| RB10F | GCCCTCCACTGCTCAATTTT |
| RB10R | GGTAGGAGAACTGCTTGATCCC |
5、通过3730测序仪进行测序，获取结果，并用GeneMapper软件进行位点分析，获取数据峰图，并对测序结果峰图进行了人工校正。测序峰图峰形清晰，峰与峰之间的距离满足重复单元的整数倍，峰的数量满足滇金丝猴物种二倍体鉴定结果的单峰或双峰。
6、用确定为滇金丝猴的多个个体的DNA进行微卫星扩增，测序结果显示10对引物能够将不同个体鉴别开，即使为亲缘个体，仍可将其区别为不同个体。具体见实验例3。
7、根据Botstein标准，PIC大于0.5为高度多态位点，PIC介于0.25和0.5之间为中度多态位点，PIC小于0.25为无多态性。本发明10对引物在亲缘关系很近，个体数量少(6个家庭，15只个体)的情况下扩增结果仍显示出较高的多态性。具体见实验例3。
8、根据图1至图10的胶图，本发明的微卫星引物的扩增效果整体较好，体现在以下几个方面
(1)特异性较好，扩增位点扩增出一条带。
(2)扩增成功率较高，样品均能扩增出来。
(3)扩增产物浓度较高，扩增产物条带较亮，产物浓度较高。
9、图11至图20的胶图，本发明的微卫星引物的扩增效果整体较好，体现在以下几个方面
(1)特异性较好，扩增位点扩增出一条带。
(2)扩增成功率较高，成功率为73.33％-100％
(3)扩增产物浓度较高，扩增产物条带较亮，产物浓度较高。
通过微卫星分型结果将样品两两之间的十个微卫星位点结果进行比较，依据10对引物都相同或仅有1对引物扩增结果不同则为同一个体的个体鉴定原则。通过已知个体的微卫星数据，确认10对引物可将不同个体区别开，成功进行个体识别。
本发明步骤二中的引物设计软件还可以是Primer premier、Oligo等。
除上述技术方案之外，本发明步骤五中的PCR试剂还可以是用于扩增样品DNA的其他生物学领域可接受的其他试剂，例如Buffer，dNTP，DNA聚合酶等。
实验例1.用于筛选扩增滇金丝猴微卫星的引物方法
(1)在滇金丝猴全基因组中筛选重复单元为3-5碱基，重复数大于8，而长度在100-400bp左右的微卫星位点。
(2)基于同源序列利用Primer5.0软件成功设计引物。
实验例2新开发微卫星扩增步骤
本发明中采用10μl的PCR体系，其组成包括：100ng-200ng DNA样品，0.1μlGoldstar Polymerase，前后引物各0.1μl(10μmol/L)，2μl Buffer,1.2μl dNTP(2.5mM),加无菌水补足到10μl的总体积。通过对退火温度进行梯度PCR实验，得到每对引物PCR扩增效果最佳状态时的最适退火温度。最终使用的PCR条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，touch down温度40秒，72℃延伸40秒，设置13个循环反应，touch down温度是指每过一个循环退火温度降0.5℃；94℃变性30秒，最适退火温度40秒，72℃延伸40秒，设置30个循环反应，60℃后延伸30分钟。得到扩增产物后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小、亮度和纯度。10μl PCR反应体系见表二。PCR反应程序见表三。10对引物最适退火温度见表四。
表二：10μl PCR反应体系
| 模板(μl) | 2 |
| 引物F(μl) | 0.1 |
| 引物R(μl) | 0.1 |
| dNTP(μl) | 1.2 |
| Buffer(μl) | 2 |
| GoldStar DNA Polymerase(μl) | 0.1 |
| ddH<sub>2</sub>O(μl) | 4.5 |
表三：PCR反应程序
表四：10对引物最适退火温度
实验例3对荧光标记引物扩增结果进行测序及个体鉴定
使用来自6个家庭的15只滇金丝猴个体的样品DNA(亲缘关系见表五)，使用本发明的10对微卫星荧光引物进行PCR扩增，并用2％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，见图11-图20。通过3730测序仪进行测序，获取结果，并用GeneMapper软件进行位点分析，获取数据峰图，并根据各微卫星位点重复单元碱基数对测序结果进行人工校正。测序峰图峰形清晰，峰与峰之间的距离满足重复单元的整数倍，峰的数量满足滇金丝猴物种二倍体鉴定结果的单峰或双峰。
根据测序结果判断样品个体两两之间的测序结果是否相同，依据10对引物都相同或仅有一对引物扩增结果不同则为同一个体的个体鉴定原则。
根据微卫星测序结果进行个体鉴定，已知的不同个体的样品通过微卫星实验可以鉴定为不同个体，鉴定结果符合样品所属个体真实情况。并且即使存在多个亲缘关系很近的个体，本发明引物仍能成功将其区别为不同个体，证明本发明引物可用于滇金丝猴的个体识别。
表五：来自6个家庭的15个个体的亲缘关系情况
| 子代 | 父亲 | 母亲 | |
| 家庭1 | 1 | 3 | 4 |
| 家庭1 | 1 | 3 | 4 |
| 家庭2 | 5 | 7 | 8 |
| 家庭2 | 6 | 7 | 8 |
| 家庭3 | 9 | 7 | 10 |
| 家庭4 | 11 | 12 | 13 |
| 家庭5 | 14 | M | 13 |
| 家庭6 | 15 | M | F |
注：M是雄性个体，F是雌性个体，仅用来说明亲缘关系。
根据Botstein标准，PIC大于0.5为高度多态位点，PIC介于0.25和0.5之间为中度多态位点，PIC小于0.25为无多态性。PIC大于0.5的位点能得到更准的结果。
本实验使用的15只个体来自同一动物园的6个家庭，本身亲缘关系较近(详细见表五)，根据实验数据统计10对引物的多态信息含量PIC值，本发明引物PIC值除引物RB3接近0.5之外，均大于0.5(详细见表六)，说明10对引物即使在亲缘关系很近的个体识别中仍能表现出较高的多态性，证明本发明引物多态性较高。为滇金丝猴的遗传多样性分析、亲缘关系分析、遗传连锁图谱构建和种质资源库的建立奠定必要基础。
表六：10对引物的PIC值
| 引物 | RB1 | RB2 | RB3 | RB4 | RB5 |
| PIC | 0.6 | 0.746 | 0.467 | 0.667 | 0.726 |
| 引物 | RB6 | RB7 | RB8 | RB9 | RB10 |
| PIC | 0.561 | 0.588 | 0.685 | 0.594 | 0.613 |
实验例4用现有技术引物扩增相同样品进行效果比较
为了比较本发明引物与现有文献中的引物效果，从现有文献中挑选了8对引物合成其普通引物，用与实验例3中同样的15只滇金丝猴个体的DNA扩增进行效果对比。
使用10μl的PCR体系，其组成包括：100ng-200ng DNA样品，0.1μlGoldstarPolymerase，前后引物各0.1μl(10μmol/L)，2μl Buffer,1.2μl dNTP(2.5mM),加无菌水补足到10μl的总体积。通过对退火温度进行梯度PCR实验，得到每对引物PCR扩增效果最佳状态时的最适退火温度。最终使用的PCR条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，touch down温度40秒，72℃延伸40秒，设置13个循环反应，touch down温度是指每过一个循环退火温度降0.5℃；94℃变性30秒，最适退火温度40秒，72℃延伸40秒，设置30个循环反应，60℃后延伸30分钟。得到扩增产物后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物的大小、亮度和纯度。8对引物最适退火温度见表七。并用2％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，见图21-图28。
表七：文献中8对引物最适退火温度
| 引物 | D6S271 | D7S2204 | D8S5505 | D11S2202 |
| 温度(℃) | 61 | 61 | 62 | 62 |
| 引物 | D17S1290 | GM108 | GM109 | GM213 |
| 温度(℃) | 62 | 60 | 61 | 62 |
通过比较发现，文献中的引物在使用相同条件和相同样品进行扩增时效果很差，没有明亮单一的条带。仅有GM108这一对引物扩增成功一个样品，其余7对引物均未出现清晰可见的条带。而本发明的10对微卫星引物扩增条带亮且集中，且扩增成功率高，说明本发明微卫星引物相比现有技术引物扩增效果好。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的技术方案包含参数，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的参数和其他技术要点为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南大学
<120>适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物
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<212>DNA
<213>人工序列
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GCAAAGACACACACATAGGCTCA
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<213>人工序列
<400>2
ATGCCTTCTTTGTCTCTTGATCTT
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<213>人工序列
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AGAGAGAATCCCCCTGAGCAT
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<213>人工序列
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GAGCAAGACTCCATCTCAAAACA
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TTCCAACTAACACTAAAAGGAGGG
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CACAGGGGTGAAAATATTCAAGA
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GACAACCCAGAGCCATCTATGTA
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TGGGTGACAGAGTAAGACTCGGT
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CCCTGAATTCCAAGAATGTCAA
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GTCTACTGTGGGTGAACCTGGA
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<211>20
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TGGGCCTAGAAGGTTGTGGT
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<211>24
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GGTAGGAGAACTGCTTGATCCC
Claims (7)
1.适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物，其特征在于，所述的微卫星位点为，在滇金丝猴全基因组中筛选重复单元为3-5碱基，重复数大于8，长度在100-400bp的微卫星位点。
2.根据权利要求1所述的适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物，其特征在于，所述的引物为10对引物组：RB1F、RB1R；RB2F、RB2R；RB3F、RB3R；RB4F、RB4R；RB5F、RB5R；RB6F、RB6R；RB7F、RB7R；RB8F、RB8R；RB9F、RB9R；RB10F、RB10R。
3.根据权利要求1所述的适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物，其特征在于，所述的引物为10对引物组；其PCR扩增体系为，10μl PCR反应体系：模板2μl、引物F 0.1μl、引物R 0.1μl、dNTP 1.2μl、Buffer 2μl、GoldStar DNA Polymerase 0.1μl、ddH2O 4.5μl。
4.根据权利要求3所述的适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物，其特征在于，所述的10对引物组的PCR条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，touch down温度40秒，72℃延伸40秒，设置13个循环反应，touch down温度是指每过一个循环退火温度降0.5℃；94℃变性30秒，退火温度40秒，72℃延伸40秒，设置30个循环反应，60℃后延伸30分钟。
5.根据权利要求1所述的适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物，其特征在于，使用所述的微卫星位点筛选得到所述10对引物组的方法包括：对滇金丝猴DNA进行PCR扩增后的扩增产物通过测序仪进行测序，获取结果，并用GeneMapper软件进行位点分析，获取数据峰图，并对测序结果峰图进行了人工校正；测序峰图峰形清晰，峰与峰之间的距离满足重复单元的整数倍，峰的数量满足滇金丝猴物种二倍体鉴定结果的单峰或双峰。
6.根据权利要求1所述的适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物，其特征在于，使用所述的微卫星位点筛选得到所述10对引物组的方法包括：提取确定为不同滇金丝猴个体的样品DNA，使用Nanodrop定量仪对其进行定量，定量结果显示DNA样品的核酸浓度为30-400ng/μl、OD260/280为1.7-2.2、OD260/230为1.5-2.0，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示目的条带清晰明亮。
7.根据权利要求1所述的适用于滇金丝猴个体鉴定的微卫星位点与引物；其特征在于，所述的微卫星位点或引物还用于滇金丝猴的遗传多样性分析或亲缘关系分析或遗传连锁图谱构建或种质资源库建立。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114703294A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-07-05 | 西北大学 | 用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107586856A (zh) * | 2017-10-17 | 2018-01-16 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 一种基于snp位点的川金丝猴亲子鉴定和个体识别方法 |
| CN107779499A (zh) * | 2017-10-17 | 2018-03-09 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 基于snp位点的川金丝猴遗传监测和繁育管理方法 |
| CN108034696A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-05-15 | 中南大学 | 一种基于转录组测序开发ssr引物的方法 |
| CN108531609A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-09-14 | 中南大学 | 一组基于转录组测序开发的川金丝猴est-ssr引物和试剂盒 |
-
2019
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107586856A (zh) * | 2017-10-17 | 2018-01-16 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 一种基于snp位点的川金丝猴亲子鉴定和个体识别方法 |
| CN107779499A (zh) * | 2017-10-17 | 2018-03-09 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 基于snp位点的川金丝猴遗传监测和繁育管理方法 |
| CN108034696A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-05-15 | 中南大学 | 一种基于转录组测序开发ssr引物的方法 |
| CN108531609A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-09-14 | 中南大学 | 一组基于转录组测序开发的川金丝猴est-ssr引物和试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LI YU等: "Genomic analysis of snub-nosed monkeys (Rhinopithecus) identifies genes and processes related to high-altitude adaptation", 《NATURE GENETICS》 * |
| 余浩洋等: "川金丝猴基因组微卫星的分布特征研究", 《四川省动物学会会议论文集：第十三届全国野生动物生态与资源保护学术研讨会暨第六届中国西部动物学学术研讨会》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114703294A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-07-05 | 西北大学 | 用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、位点组合及引物组合、试剂盒与应用 |
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|---|---|
| CN110791573B (zh) | 2022-06-03 |
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