CN112946303B - Tag54:2-fa18:1及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用 - Google Patents

Tag54:2-fa18:1及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了TAG54:2‑FA18:1及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用。本发明提供的血清脂质TAG54:2‑FA18:1或TAG54:2‑FA18:1联合LPE(16:0)或TAG54:2‑FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)可以诊断区分健康人和2型糖尿病患者或健康人和早期糖尿病肾病，具有开发制备成诊断2型糖尿病或早期糖尿病肾病的试剂盒的前景；本发明提供的血清脂质TAG54:2‑FA18:1或TAG54:2‑FA18:1联合LPE(16:0)可以诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病，具有开发制备成诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病的试剂盒的前景。

Description

TAG54:2-FA18:1及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面 的应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及代谢标志物在疾病诊断中的应用，具体涉及TAG54:2-FA18:1及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用。
背景技术
生物标志物可以作为反映生物体结构和功能发生改变的信号指标，用于检测复杂疾病的发生和进展。近年来“组学”领域的生物标志物作为辅助手段用于预先、准确、灵敏地判断出疾病发生情况，取得了较好的效果。多个生物标志物联合诊断可以区分疾病的类型以及疾病所处的阶段，辅助临床治疗。而且以血清标志物为例，该方法具有简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用，对患者非常友好。
为了开发糖尿病、糖尿病肾病诊断的血清标志物或其组合物，特提出本发明。
发明内容
本发明旨在提供TAG54:2-FA18:1及其组合物在糖尿病、糖尿病肾病诊断方面的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
血清脂质TAG54:2-FA18:1或血清脂质TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)或血清脂质TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)在制备诊断2型糖尿病或早期糖尿病肾病的试剂、试剂盒中的应用。
血清脂质TAG54:2-FA18:1或血清脂质TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)在制备诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病的试剂、试剂盒中的应用。
一种诊断2型糖尿病或早期糖尿病肾病的试剂盒，含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1的检测试剂，或含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1和LPE(16:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)的检测试剂。
一种诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病的试剂盒，含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1的检测试剂，或含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1和LPE(16:0)的检测试剂。
有益效果：
1、本发明提供的诊断指标为血清脂质，只需要采取少量血液即可检测，基本无创；
2、本发明提供的血清脂质TAG54:2-FA18:1或血清脂质TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)或血清脂质TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)可以诊断区分健康人和2型糖尿病患者或健康人和早期糖尿病肾病，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断2型糖尿病或早期糖尿病肾病的试剂或试剂盒的前景。
3、本发明提供的血清脂质TAG54:2-FA18:1或血清脂质TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)可以诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病的试剂或试剂盒的前景。
附图说明
图1为脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)在2-DM和HCs血清中的含量水平；
图2为脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)在DKDE和HCs血清中的含量水平；
图3为脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)在DKDE和2-DM血清中的含量水平；
图4为TAG54:2-FA18:1独立诊断区分2-DM vs HCs的ROC曲线；
图5为TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分2-DM vs HCs的ROC曲线；
图6为TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)诊断区分2-DM vs HCs的ROC曲线；
图7为TAG54:2-FA18:1独立诊断区分DKDE vs HCs的ROC曲线；
图8为TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分DKDE vs HCs的ROC曲线；
图9为TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)诊断区分DKDE vs HCs的ROC曲线；
图10为TAG54:2-FA18:1独立诊断区分DKDE vs 2-DM的ROC曲线；
图11为TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分DKDE vs 2-DM的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：血清脂质对糖尿病、糖尿病肾病的诊断效能
一、实验样本和试剂
收集江苏省中医院169例健康受试者(HCs)、170例2型糖尿病患者(2-DM)、238例2型糖尿病并发糖尿病肾病患者(其中124例早期DKDE，114例晚期DKDA)。健康受试者为体检健康的正常人，2型糖尿病、2型糖尿病并发糖尿病肾病根据《2015美国糖尿病指南》和肾脏病理确诊。各组患者的年龄、性别和体重指数匹配，无显著性差异。按表1将各组受试者或患者随机分为训练集样本和验证集样本。
表1训练集样本和验证集样本样本数量
排除标准：①明确诊断的原发性肾脏疾病；②可引起脂质尿的其他***性疾病；③近1个月内有糖尿病急性并发症及***；④合并有心脑血管、肝、肾脏和造血***等严重原发性疾病；⑤患有精神疾病不能合作者；⑥妊娠或哺乳期妇女，或准备妊娠者；⑦近1个月内参加其它临床试验者；⑧不愿接受本研究者。
主要实验试剂：甲醇，MTBE，异丙醇，乙腈，醋酸铵，氢氧化铵。
二、实验方法
1、血清样本的采集及储存
采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。
2、UHPLC技术测定血清中目标脂质的含量水平
检测仪器：UHPLC system(Shimazu Nexera X2 LC-30AD,Japan)，ESI-triplequadrupole mass spectrometer(SCIEX Triple Quad 5500+,Singapore)；
色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(100mm×2.1mm I.D.,1.7μm；Waters,Milford,MA,USA)。柱温为35℃，流速为500μl/min。注射体积为5μl。流动相的组成有两个溶剂:A相含10mM醋酸铵(NH4OAc)的水:乙腈(5:95,v/v)溶液，B相含10mM醋酸铵(NH4OAc)的水:乙腈(50:50,v/v,氢氧化铵调整pH 8.2)。梯度洗脱：0-10.0min，0.1％-20％B；10.0-11.0min，20％-98％B；11.0-13.0min，98％B；13.0-13.1min，98％-0.1％B；13.1-16.0min，0.1％B；
质谱条件：该质谱仪在电喷雾电压(毛细管电压)为4500/-4500V的正负电离模式下工作。典型源条件如下:幕气设置为35。离子源温度调至500℃。离子气源1(GS1)和离子气源2(GS2)均设置为50和60。减垢电位设置为80/-80伏。在正、负模式下，碰撞出口电位设置为9/-11v；
样本处理：将40μl血清与225μl冰甲醇混合。然后将每个样品涡旋10秒后加入750μl的冷MTBE，将混合物涡流10秒，在4℃轨道混合器中振荡10分钟。加入室温LC/MS级水188μl，涡旋20秒后4℃，14000rcf离心2min。上层液体被转移到干净管子,然后SpeedVac样本集中器中45℃挥干2h。用100μl的异丙醇/乙腈/水(30:65:5,v/v/v)混合物溶解干油脂,样本涡旋10秒钟,然后4℃，14000rcf离心10分钟。
以各样本中各目标脂质的检测峰面积表示其含量水平。
3、数据处理方法
训练集中，运用Logistic回归建立单个或多个目标血清脂质含量水平的回归方程，产生新变量logit[P]，对该新变量进行ROC曲线分析，并根据ROC曲线得到最佳cut-off值；验证集中，根据SPSS 25.0软件给出的预测概率计算目标血清脂质的诊断准确率。
三、实验结果
1、目标血清脂质在不同临床样本中含量水平的差异
(1)TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)在2-DM、HCs血清中含量水平差异
训练集中，脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)在2-DM、HCs血清中的含量水平存在明显差异，分别如图1所示。
(2)TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)在DKDE、HCs血清中含量水平差异
训练集中，脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)在DKDE、HCs血清中的含量水平存在明显差异，分别如图2所示。
(3)TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)在DKDE、2-DM血清中含量水平的差异
训练集中，脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)在DKDE、2-DM血清中的含量水平存在明显差异，分别如图3所示。
2、目标血清脂质对不同临床样本的诊断区分效能
2.1训练集构建逻辑回归方程
(1)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分2-DM vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平为自变量，以组别(2-DM、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.153+1.661X1，其中：X1为TAG54:2-FA18:1的含量水平。
(2)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分2-DM vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平为自变量，以组别(2-DM、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.268+1.583X1+1.202X2，其中：X1为TAG54:2-FA18:1的含量水平，X2为LPE(16:0)的含量水平。
(3)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)诊断区分2-DM vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)、PE(16:0/20:2)含量水平为自变量，以组别(2-DM、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.450+2.275X1+1.828X2，其中：X1为PE(16:0/20:2)含量水平，X2为TAG54:2-FA18:1含量水平。
(4)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分DKDE vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平为自变量，以组别(DKDE、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.552+2.404X1，其中：X1为TAG54:2-FA18:1的含量水平。
(5)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分DKDE vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平为自变量，以组别(DKDE、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.626+1.954X1+3.439X2，其中：X1为TAG54:2-FA18:1的含量水平，X2为LPE(16:0)的含量水平。
(6)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)诊断区分DKDE vs HCs
在训练集中，以各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)、PE(16:0/20:2)含量水平为自变量，以组别(DKDE、HCs)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.372+2.553X1+2.762X2+2.296X3，X1为PE(16:0/20:2)的相对含量，X2为TAG54:2-FA18:1的相对含量,X3为LPE(16:0)的相对含量。
(7)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分DKDE vs 2-DM
在训练集中，以各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平为自变量，以组别(DKDE、2-DM)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.699+1.019X1，其中：X1为TAG54:2-FA18:1的含量水平。
(8)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分DKDE vs 2-DM
在训练集中，以各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平为自变量，以组别(DKDE、2-DM)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.877+0.960X1+1.747X2，其中：X1为TAG54:2-FA18:1的含量水平，X2为LPE(16:0)的含量水平。
2.2训练集确定最佳鉴别阈值
(1)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分2-DM vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图4所示)，AUC可达0.661，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分2-DM vs HCs的最佳cut-off值0.449。
(2)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分2-DM vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图5所示)，AUC可达0.713，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分2-DM vs HCs的最佳cut-off值0.504。
(3)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)诊断区分2-DM vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)、PE(16:0/20:2)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图6所示)，AUC可达0.803，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分2-DM vs HCs的最佳cut-off值0.457。
(4)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分DKDE vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图7所示)，AUC可达0.744，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDE vs HCs的最佳cut-off值0.356。
(5)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分DKDE vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图8所示)，AUC可达0.852，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDE vs HCs的最佳cut-off值0.258。
(6)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)诊断区分DKDE vs HCs
在训练集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)、PE(16:0/20:2)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图9所示)，AUC可达0.897，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDE vs HCs的最佳cut-off值0.340。
(7)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分DKDE vs 2-DM
在训练集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图10所示)，AUC可达0.605，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDE vs 2-DM的最佳cut-off值0.338。
(8)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分DKDE vs 2-DM
在训练集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图11所示)，AUC可达0.690，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分DKDE vs 2-DM的最佳cut-off值0.390。
2.3验证集验证诊断准确率
(1)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分2-DM vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分2-DM vs HCs的准确率69.7％(83/119)。
(2)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分2-DM vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平数据导入SPSS25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分2-DM vs HCs的准确率68.9％(82/119)。
(3)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)诊断区分2-DM vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)、PE(16:0/20:2)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分2-DM vs HCs的准确率73.9％(88/119)。
(4)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分DKDE vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDE vs HCs的准确率80.5％(99/123)。
(5)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分DKDE vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平数据导入SPSS25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDE vs HCs的准确率84.6％(104/123)。
(6)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)诊断区分DKDE vs HCs
在验证集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)、PE(16:0/20:2)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDE vs HCs的准确率84.6％(104/123)。
(7)TAG54:2-FA18:1独立诊断区分DKDE vs 2-DM
在验证集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDE vs 2-DM的准确率66.1％(82/124)。
(8)TAG54:2-FA18:1联合LPE(16:0)诊断区分DKDE vs 2-DM
在验证集中，将各样本的血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)含量水平数据导入SPSS25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分DKDE vs 2-DM的准确率69.4％(86/124)。
实施例2：诊断试剂盒
一种诊断2型糖尿病的试剂盒，含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1的检测试剂，或含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1和LPE(16:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)的检测试剂。
一种诊断早期糖尿病肾病的试剂盒，含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1的检测试剂，或含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1和LPE(16:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1、LPE(16:0)和PE(16:0/20:2)的检测试剂。
一种诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病的试剂盒，含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1的检测试剂，或含有用于检测血清脂质TAG54:2-FA18:1和LPE(16:0)的检测试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (5)

1.血清脂质TAG54:2-FA18:1在制备诊断2型糖尿病或早期糖尿病肾病的试剂、试剂盒中的应用；其中，糖尿病肾病为2型糖尿病并发糖尿病肾病。
2.血清脂质TAG54:2-FA18:1联合血清脂质LPE(16:0)在制备诊断2型糖尿病或早期糖尿病肾病的试剂、试剂盒中的应用；其中，糖尿病肾病为2型糖尿病并发糖尿病肾病。
3.血清脂质TAG54:2-FA18:1联合血清脂质LPE(16:0)和血清脂质PE(16:0/20:2)在制备诊断2型糖尿病或早期糖尿病肾病的试剂、试剂盒中的应用；其中，糖尿病肾病为2型糖尿病并发糖尿病肾病。
4.血清脂质TAG54:2-FA18:1在制备诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病的试剂、试剂盒中的应用；其中，糖尿病肾病为2型糖尿病并发糖尿病肾病。
5.血清脂质TAG54:2-FA18:1联合血清脂质LPE(16:0)在制备诊断区分2型糖尿病和早期糖尿病肾病的试剂、试剂盒中的应用；其中，糖尿病肾病为2型糖尿病并发糖尿病肾病。
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