CN113121638B - 一种纯化重组蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质化学领域，具体涉及一种纯化重组蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将含有目的重组蛋白的发酵液，通过至少一个切向流膜过滤步骤进行澄清、浓缩处理，然后进行疏水层析、反相层析、除热原、超滤和装瓶，获得纯度99.5％的重组白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，该方法适合于规模化工业生产重组白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白。

Description

一种纯化重组蛋白的方法
技术领域
本发明属于蛋白质化学领域，具体涉及一种纯化重组蛋白的方法。
背景技术
重组蛋白类药物通常采用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等进行表达，其中结合基因工程大规模培养生产蛋白质药物已成为当今生物制药领域的主流。临床许多蛋白类药物需用较高剂量或长期用药，市场需求量大，因此该类生物制药的大规模生产对工艺质量要求较高，必须符合严格的制药标准。抗体类或者Fc融合蛋白类药物通常采用一步ProteinA亲和层析即可达到90％以上纯度，其他污染性杂质如脱落的Protein A、宿主细胞蛋白(HCP)、聚集体(D/A)以及DNA等主要通过离子交换等层析方法去除；其他重组蛋白药物的HCP、聚集体及DNA等杂质则往往需要更多的纯化步骤进行去除。
目前，重组蛋白的分离纯化主要有以下几种方法：a)一步法，包括一步凝胶筛分法、一步镍离子螯合层析法、一步亲和层析等；b)两步法，包括亲和层析—阴离子交换层析、亲和层析-阳离子交换层析、阴离子交换层析-分子筛层析、阴离子交换层析-镍离子螯合层析法、反向层析-镍离子螯合层析法、疏水层析-羟基磷灰石柱层析、疏水层析—阳离子交换层析、阴离子交换层析-阳离子交换层析等；c)多步法，包括羟基磷灰石柱层析-羟基磷灰石柱层析-反向层析、热处理-离子交换-乙醇沉淀法，热处理-活性炭吸附-二次活性炭吸附，疏水层析-离子交换层析-分子筛层析，阴离子交换层析-疏水层析-羟基磷灰石柱层析-阳离子交换层析，阴离子层析柱-氨基苯硼酸柱层析或苯基交联琼脂糖凝胶层析柱-陶瓷羟基磷灰石层析柱-阳离子层析柱等。
发明CN105418768A公开了一种重组嵌合蛋白的制备方法和用途，使用镍离子螯合层析纯化获得重组蛋白，该方法涉及蛋白反复复性操作，影响蛋白活性；且梯度洗脱中使用大量含氮杂环化合物的洗脱液、工艺繁琐。
早在1972年，Hjelm等人就提出采用IgG亲和层析的方法纯化重组蛋白：以交联琼脂糖凝胶为载体，采用溴化氰活化工艺，以IgG为功能基制成亲和层析柱纯化重组蛋白。该方法操作简单，且一步层析操作即可使纯化的重组蛋白纯度达到95％。然而，由于IgG属生物大分子，分子量大(Mr＝150000)，因此为减少空间位阻，单位体积载体上只能偶联少量的IgG，造成亲和层析柱动态载量低，难以大规模生产，多用于实验室规模纯化；且偶联IgG时利用的是IgG表面大量的氨基，属于多点偶联工艺，必然导致固定化的蛋白空间取向不均一，增大了空间位阻。
发明US 5075423A使用亲和层析—阴离子交换层析纯化重组蛋白，仍存在亲和层析载量低、空间位阻大的劣势。CN101220082B公开了一种重组蛋白提取纯化方法，使用离子交换-分子筛层析，该方法涉及反复变性、复性，影响重组蛋白活性。发明CN103695508B公开了金黄色葡萄球菌HI重组蛋白的发酵和纯化工艺，纯化工艺使用亲和层析-阳离子交换层析，洗脱使用自动上样洗脱，洗脱剂种类多、操作复杂。发明CN109055416A公开了一种可溶性重组蛋白的制备方法，纯化使用亲和层析-亲和层析，虽避免包涵体蛋白后处理复性及活性不稳定的问题，但仍涉及酶切，且洗脱中使用大量含氮杂环化合物的洗脱液，可操作性不强。发明WO 2007/035341A1，公开了一种纯化蛋白的方法，使用过滤、渗滤、以及两步连续的层析操作，其中第一步为阴离子交换层析、疏水作用层析或陶瓷羟基磷灰石层析，第二步为阳离子交换层析，该方法同样存在操作步骤多、效率低问题。发明CN103145813A公开了一种分离纯化重组蛋白A的方法，使用加热、两次活性炭吸附和疏水层析纯化蛋白，仍未避免使用含表面活性剂的缓冲液，且表面活性剂的使用量直接影响蛋白回收率；存在活性炭吸附蛋白的可能；使用加热煮沸处理影响蛋白的活性，蛋白质总回收率为53％。
发明US 5314993公开了使用加热、离子交换层析和乙醇沉淀三个步骤纯化重组蛋白的方法，该方法虽工艺简单，但产品回收率不高。Hammond等人发表了一种使用加热处理、除盐柱除盐、DEAE弱阴离子交换层析以及苯基疏水作用层析，进行大规模纯化重组蛋白A的方法，该方法操作复杂，总回收率低。CN 105884859A公开了一种分离纯化重组蛋白的方法，用PEG沉淀法对变性包涵体进行纯化后，再进行变性、复性过程，使用疏水层析-离子交换层析-分子筛层析纯化重组蛋白，仍涉及反复变性、复性等问题。
CN101970650B、CN106148302A公开了一种重组蛋白质的纯化方法，纯化步骤为微滤澄清、超滤浓缩换液后，依次经过高流速季铵琼脂糖凝胶阴离子层析柱、氨基苯硼酸柱层析或高效苯基交联琼脂糖凝胶层析柱、陶瓷羟基磷灰石I型层析柱和高效磺酸基琼脂糖凝胶阳离子层析柱，分别存在使用昂贵填料、处理量小、难以实现规模化工业生产等问题。
CN1517365A公开了一种具有抑制白细胞功能和凝血酶活性的双功能嵌合蛋白，纯化时使用Q-Sepharose FF(Pharmacia)和羟基磷灰石柱层析二次柱层析，羟基磷灰石介质的使用寿命短，大规模装柱困难，且对缓冲液条件要求严格，不适合大规模生产时使用。
综上，国内专利申请的重组蛋白的纯化方法很少涉及内毒素去除，对凝胶筛分法而言，由于处理量小、速度慢，而且无法去除内毒素，因而无法用于蛋白的工业化生产。而对于亲和层析、金属离子螯合层析等的纯化方法，为去除内毒素，必须使用大量的含表面活性剂的缓冲液(体积为层析介质体积的十几倍至几十倍)冲洗层析介质，在环保和蛋白回收上很不利。此外，镍离子螯合层析介质、亲和层析介质等层析介质一般价格昂贵、稳定性不高；蛋白A亲和层析在反复使用过程中会产生一定程度的脱落，残留在产品中的Protein A会引起不良免疫应答反应，其和抗体的复合物在体内可激活携带Fc的白细胞和补体***的免疫应答，产生氧化和过敏反应。
重组蛋白生产中，聚集体在发酵、纯化以及制剂过程中因一些物理的和化学的因素而经常产生，比如培养的温度和时间、低pH值、剪切力以及表面吸附等。聚集体不但会使病人产生免疫反应，甚至会使人对药物产生免疫耐受性，从而大大降低了药物的药效。此外，聚集体还会影响蛋白质药物的生物活性、稳定性以及保存期等。聚集体的去除主要通过层析过程来实现，层析技术比如离子交换层析，如果聚集体含量高于10％时，单步IEC或HIC的去除能力非常有限，往往需要多个层析步骤才能有效降低聚集体，这样会使蛋白收率降低，成本增加。Gagnon等提出采用羟基磷灰石层析技术来去除聚集体(US Patent 2010/0145029 A1；US Patent 2005/0107594 A1)，该方法去除聚集体的能力很高，可以将60％的聚集体去除到0.1％以下，但是，羟基磷灰石介质的使用寿命短，大规模装柱困难，且对缓冲液条件要求严格，因此并不适合在大规模生产中使用。
此外，基因重组技术所使用的细胞系是活的生物，因此需要使用复合生长培养基培养，复合生长培养基通常为含有盐、糖、氨基酸、维生素、痕量元素和蛋白胨等的混合物。从培养细胞的化合物的混合物中以及从细胞自身的副产物中分离期望的蛋白质达到足够用作为人类治疗剂的纯度仍是一种艰难的挑战。重组蛋白在表达和纯化工艺上还存在相当大的技术困难，远未达到满足人们需求的程度，发展新型的表达和纯化技术，提高包涵体的纯化效率具有重要意义。
发明CN 103379949 A涉及的技术是经俘获层析树脂处理样品、在样品中灭活病毒、以及经至少一个深层过滤器和离子交换膜处理，这种纯化方法有其自身的局限性，实施方式有抗体、Fc融合蛋白，但未能对某些嵌合蛋白适用，本发明解决了这个问题，提供了一种纯化重组蛋白的方法，可获得较高纯度的重组蛋白。
发明内容
鉴于现有技术中重组蛋白纯化方法的适用范围窄、工艺路线长、操作复杂、生产成本较高、不能实现规模化工业生产重组蛋白等不足，本申请提供一种纯化方法适用范围广、工艺路线短并有望实现工业生产纯度较高的重组蛋白的方法。
本发明的技术方案为：通过基因克隆构建大肠杆菌表达菌株，获得重组蛋白工程菌，发酵获得重组表达的目的蛋白，然后将发酵液通过一步或多步切向流膜过滤步骤进行澄清或浓缩处理，然后进行层析俘获步骤，进一步精制后得到纯度较高的重组蛋白。
一种纯化重组蛋白的方法，包括如下步骤：
将含目的重组蛋白的发酵液，经初级纯化处理后，依次通过至少一个切向流膜过滤器处理样品来提供包含目的蛋白的过滤样品，通过疏水层析树脂处理过滤后洗脱物来提供包含目的蛋白的第一洗脱物，通过反相树脂处理第一洗脱物来提供包含目的蛋白的第二洗脱物，然后进行除热原、超滤，得到纯度较高的重组目的蛋白。
一种纯化重组蛋白的方法，具体包括如下步骤：
A.超滤：将初级纯化样品，经装有切向流膜的过滤器过滤，得滤液，即为含目的蛋白的过滤样品；
B.疏水层析：疏水层析填料装柱平衡后，装载步骤A所得的含目的蛋白的过滤样品，用平衡缓冲液洗涤层析柱至基线吸光度，洗脱液洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；
C.反相层析：稀释步骤B所得的含目的重组蛋白的流出液，过滤，并装载至已平衡的反相层析柱上，用平衡液冲洗层析柱至基线吸光度，梯度洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；
D.除热原：弱离子交换层析装柱后，装载步骤C所得的含目的重组蛋白的流出液，用平衡液平衡至基线吸光度，洗脱，收集含目的重组蛋白的的流出液；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含目的重组蛋白的流出液，经装有切向流膜的过滤器超滤浓缩，收集滤液，即为目的重组蛋白。
优选地，步骤A中所述的切向流滤膜为纤维素膜或聚醚砜膜，截留分子量为10～300KD；进一步优选截留分子量为100～200KD。
优选地，步骤B中所述的疏水层析的填料为Phenyl Sepharose或Source。
进一步优选地，步骤B中所述的疏水层析的填料为Phenyl Sepharose Fast Flow，Phenyl Sepharose High Performance，Source 15PHE，Source 15ISO或Source 15ETH。
优选地，步骤B中所述的洗脱液为0.05～0.5M的硫酸铵、硫酸钠、乙酸铵、氯化钠或氯化钾溶液。
进一步优选地，步骤B中所述的洗脱液为0.05～0.5M的硫酸铵、硫酸钠或乙酸铵溶液。
更为优选地，步骤B中所述的缓冲溶液为0.1～0.3M的硫酸铵、硫酸钠或乙酸铵溶液。
优选地，步骤B中所述的层析柱装载极限为每升层析树脂4～14g样品。
进一步优选地，步骤B中所述的层析柱装载极限为每升层析树脂6～10g样品。
优选地，步骤C中所述的反相层析的填料为Source RPC。
进一步优选地，步骤C中所述的反相层析的填料为Source 15RPC或Source 30RPC。
优选地，步骤C中所述的梯度洗脱液分别为A相和B相组成，其中A相为5～40mM柠檬酸三钠、70～130mM乙酸钠、氯化钠或乙酸铵中的任一种和5～10％乙腈或异丙醇的混合溶液，B相为5～40mM柠檬酸三钠、35～65mM硫酸铵、氯化钠或乙酸铵的任一种和50～70％乙腈或异丙醇的混合溶液。
进一步优选地，步骤C中所述的梯度洗脱液分别为A相和B相组成，其中A相为10～30mM柠檬酸三钠、80～120mM的乙酸钠、氯化钠或乙酸铵中的任一种和5～10％乙腈或异丙醇的混合溶液，B相为5～40mM柠檬酸三钠、40～60mM乙酸钠、氯化钠或乙酸铵中的任一种和50％～70％异丙醇或乙腈的混合溶液。
优选地，步骤C中所述的梯度洗脱液按0～30％B相到50～80％B相洗脱10～15CV。
优选地，步骤C中所述的所述的层析柱装载极限为每升层析树脂10～20g样品。
进一步优选地，步骤C中所述的所述的层析柱装载极限为每升层析树脂8～12g样品。
优选地，步骤D中所述的弱离子交换层析的填料为DEAE。
进一步优选地，步骤D中所述的弱离子交换层析的填料为DEAE Sephadex A-25、DEAE Sephadex A-50或CM Sephadex C-25。
优选地，步骤D中所述的洗脱液为0.05～0.7M氯化钠和10～35mM的柠檬酸三钠、乙酸铵和磷酸二氢钠溶液中的任一种的混合溶液。
进一步优选地，步骤D中所述的洗脱液为0.1～0.5M氯化钠和20～30mM的柠檬酸三钠、乙酸铵和磷酸二氢钠溶液中的任一种的混合溶液。
优选地，步骤D中所述的层析柱装载极限为每升层析树脂8～22g样品。
进一步优选地，步骤D中所述的层析柱装载极限为每升层析树脂12～17g样品。
优选地，步骤E中所述的切向流滤膜型号为PLC6C-C或PLCGC-C，截留分子量为5～50KD。
进一步优选地，步骤E中所述的切向流滤膜的型号为PLC6C-C或PLCGC-C，截留分子量为10～30KD。
在一个优选的技术方案中，包括如下内容：
A.超滤：将初级纯化样品，经纤维素膜PLCHK-C 100KD、PLCHK-C 200KD或聚醚砜膜BioMax 100KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩20～30倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:3～5置换，合并滤液，即为重组蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中；
B.疏水层析：室温下，使用Phenyl Sepharose High Performance或PhenylSepharose Fast Flow装柱，然后用pH为7.0～8.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液平衡后，装载步骤A所得的含重组蛋白的过滤样品，层析柱的装载极限为每升层析树脂6～10g样品，上样完毕后，用pH为7.0～8.0的5mM Tris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.0～8.0的0.1～0.3M硫酸铵、硫酸钠或乙酸铵缓冲液洗脱，收集含重组蛋白的流出液；
C.反相层析：使用Source 15RPC或Source 30RPC装柱，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为6.0～8.0的10～30mM柠檬酸三钠，80～120mM乙酸钠、氯化钠或乙酸铵中的任一种，和5～10％乙腈或异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M乙酸钠、氯化钠或乙酸铵溶液中的任一种和100％乙腈或异丙醇的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为6.0～8.0，以包含10～30mM柠檬酸三钠、80～120mM乙酸钠、氯化钠或乙酸铵和5～10％乙腈或异丙醇的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，层析柱的装载极限为每升树脂8～12g样品，然后用A相(pH为6.0～8.0的10mM柠檬酸三钠，100mM乙酸钠、氯化钠或乙酸铵中的任一种，和10％乙腈或异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为6.0～8.0的10～30mM柠檬酸三钠，80～120mM乙酸钠、氯化钠或乙酸铵中的任一种，和10％乙腈或异丙醇的溶液)，B相(pH为6.0～8.0的10～30mM柠檬酸三钠，40～60mM乙酸钠、氯化钠或乙酸铵溶液中的任一种，和50～70％乙腈或异丙醇的溶液)，(0～30％B相到50～80％B相洗脱10～15CV)进行梯度洗脱，收集含重组蛋白的流出液；
D.除热原：使用DEAE Sephadex A-25或DEAE Sephadex A-50装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为6.0～8.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为6.0～8.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，离子交换层析柱的装载极限为每升树脂12～17g样品，然后用pH为6.0～8.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为6.0～8.0的0.1-0.5M氯化钠和20-30mM的柠檬酸三钠、乙酸铵和磷酸二氢钠缓冲液中的任一种的混合溶液洗脱，收集含重组蛋白的流出液；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含重组蛋白的流出液，经PLC6C-C 10KD、PLCGC-C-20KD或PLCGC-C-30KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩3～5倍后，2–8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻干燥，所得产品即为目的重组蛋白。
所述的重组蛋白为本领域公知的重组蛋白、融合蛋白、嵌合蛋白或氨基酸片段等。
在一个优选的技术方案中，所述重组蛋白为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白。
本发明与现有技术相比具有如下突出优点：
1、本发明所公开的一种纯化重组蛋白的方法，适用范围广，该方法可得到纯度99.5％白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率60.6％以上；
2、本发明使用的切向流膜过滤器可有效收集目的蛋白，去除宿主细胞碎片和部分杂蛋白，用于提高纯化效率，简化操作，且蛋白吸附量较低；
3、本发明疏水层析可在富集蛋白的同时有效去除绝大多数杂蛋白，使用反相层析可进一步去除二聚体、异构体等杂质，使用弱离子交换层析可有效去除细菌内毒素等热原；
4、本发明的纯化方法适用于本领域公知的重组蛋白、融合蛋白、嵌合蛋白或氨基酸片段等；
5、所采用的层析方法容易线性比例放大至大规模生产条件下使用，满足工业生产的需要。
具体实施方式
下面列举实施例予以进一步说明：所述的蛋白可以是本领域公知的重组蛋白、嵌合蛋白或氨基酸片段，本发明要保护的技术方案不仅仅限于以下实施例。
实施例中单体纯度、宿主细胞蛋白、抗凝血酶活性、热原、有关物质、异构体的检测方法可按本领域公知的方法进行检测，其中抗凝血酶活性按照中国药典附录1-1测定，纯度按照中国药典附录1-7测定，高分子蛋白含量按照中国药典附录1-3测定，细菌内毒素按照中国药典四部通则1143测定，异构体按照中国药典附录1-4测定。
白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的表达：参照Novagen公司《pET***操作手册》(第10版)，按照常规分子克隆技术构建白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白质粒，转入大肠杆菌表达菌株，获得白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白工程菌，发酵获得重组表达的白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，在100L发酵体积下，OD600达到80，目的蛋白表达率可达到35％；
初级纯化：将发酵所得湿菌体用pH7.0的1M柠檬酸三钠缓冲液悬浮，90MPa均质三次离心后收集包涵体，所得的包涵体依次使用缓冲液A(4M尿素、50mMTris、1％曲拉通、1MNaCl，PH7.0)，缓冲液B(50mMTris，PH7.0)和缓冲液C(8M尿素、1％巯基乙醇)进行洗涤溶解，所得包涵体用缓冲液D(20mM Tris、1mMEDTA、PH7.0)稀释复性得到初级纯化样品。
实施例1
A.超滤：将初级纯化样品(103.4L，0.3g/L)，经纤维素膜PLCHK-C 100KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩25倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:4置换，合并滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率93.6％；
B.疏水层析：室温下，使用Phenyl Sepharose High Performance装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，然后用pH为7.5的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液平衡后，装载步骤A所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，上样完毕后，用pH为7.5的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.5的0.2M硫酸铵缓冲液洗脱，在280nm处从200mAU开始至300mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率95.3％；
C.反相层析：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为7.0的10mM柠檬酸三钠、100mM乙酸钠和10％乙腈的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M乙酸钠与100％乙腈或异丙醇的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为6.0～8.0，以包含10mM柠檬酸三钠、100mM乙酸钠、10％乙腈的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH为7.0的10mM柠檬酸三钠、100mM乙酸钠和10％乙腈的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为7.0的10mM柠檬酸三钠、100mM乙酸钠和10％乙腈的溶液)和B相(pH7.0的10mM柠檬酸三钠、50mM乙酸钠和65％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(10％～60％B相洗脱15CV)，在280nm处从100mAU开始至200mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率87.8％；
D.除热原：使用DEAE Sephadex A-25装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为7.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为7.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，然后用pH为7.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.0的0.3M氯化钠和25mM柠檬酸三钠缓冲液洗脱，在280nm处从50mAU开始至100mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率90.1％；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，经纤维素膜PLC6C-C 10KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩4倍后，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻干燥，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率97.2％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例2
A.超滤：将初级纯化样品(107.7L，0.3g/L)，经聚醚砜膜BioMax 100KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩20倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:5置换，合并滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率92.6％；
B.疏水层析：室温下，使用Phenyl Sepharose Fast Flow装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，然后用pH为7.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液平衡后，装载步骤A所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，上样完毕后，用pH为7.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.0的0.1M硫酸钠缓冲液洗脱，在280nm处从200mAU开始至300mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率94.3％；
C.反相层析：使用Source 30Q装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为6.0的30mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M氯化钠和100％异丙醇的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为6.0～8.0，以包含30mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠、5％异丙醇的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH为6.0的30mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为6.0的30mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)和B相(pH为6.0的30mM柠檬酸三钠、40mM氯化钠和50％异丙醇的溶液)，进行梯度洗脱(10％～70％B相洗脱15CV)，在280nm处从100mAU开始至200mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率84.5％；
D.除热原：使用DEAE Sephadex A-50装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为8.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为8.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，然后用pH为8.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为8.0的0.1M氯化钠和20mM乙酸铵缓冲液洗脱，在280nm处从50mAU开始至100mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率89.8％；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，经纤维素膜PLCGC-C-20KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩3倍后，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率96.4％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例3
A.超滤：将初级纯化样品(99.5L，0.3g/L)，经纤维素膜PLCHK-C 200KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩30倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:3置换，合并滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率93.4％；
B.疏水层析：室温下，使用Phenyl Sepharose High Performance装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，然后用pH为8.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液平衡后，装载步骤A所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，上样完毕后，用pH为8.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为8.0的0.3M乙酸铵缓冲液洗脱，在280nm处从200mAU开始至300mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率95.0％；
C.反相层析：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为8.0的20mM柠檬酸三钠、120mM乙酸铵和10％乙腈的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M乙酸铵与100％乙腈的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为8.0，以包含20mM柠檬酸三钠、120mM乙酸铵和10％乙腈的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH为8.0的20mM柠檬酸三钠、120mM乙酸铵和10％乙腈的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为8.0的20mM柠檬酸三钠、120mM乙酸铵和10％乙腈的溶液)和B相(pH为8.0的20mM柠檬酸三钠、60mM乙酸铵和70％乙腈的溶液)进行梯度洗脱(0％～60％B相洗脱15CV)，在280nm处从100mAU开始至200mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率84.9％；
D.除热原：使用DEAE Sephadex A-25装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为6.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为6.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，然后用pH为6.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为6.0的0.5M氯化钠和30mM磷酸二氢钠缓冲液洗脱，在280nm处从50mAU开始至100mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率89.9％；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，经纤维素膜PLCGC-C-30KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩5倍后，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻干燥，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率97.6％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例4
A.超滤：将初级纯化样品(107.2L，0.3g/L)，经纤维素膜PLCHK-C 50KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩25倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:2置换，合并滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，样品过滤后，收率92.6％；
B.疏水层析：室温下，使用Source 15PHE装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，然后用pH为7.5的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液平衡后，装载步骤A所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，上样完毕后，用pH为7.5的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.5的0.4M氯化钠缓冲液洗脱，在280nm处从200mAU开始至300mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率93.4％；
C.反相层析：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为7.0的5mM柠檬酸三钠、70mM氯化钠和10％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M氯化钠和100％乙腈或异丙醇的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为7.0，以包含5mM柠檬酸三钠、70mM氯化钠、10％异丙醇的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH为7.0的5mM柠檬酸三钠、70mM氯化钠和10％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为7.0的5mM柠檬酸三钠、70mM氯化钠和10％异丙醇的溶液)和B相(pH为7.0的5mM柠檬酸三钠、35mM氯化钠和70％异丙醇的溶液)进行梯度洗脱(30％～70％B相洗脱10CV)，在280nm处从100mAU开始至200mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率83.3％；
D.除热原：使用CM Sephadex C-25装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为7.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为7.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，然后用pH为7.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.0的0.7M氯化钠和10mM柠檬酸三钠缓冲液洗脱，在280nm处从50mAU开始至100mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率88.9％；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，经纤维素膜PLC6C-C 5KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩5倍后，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻干燥，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率95.5％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例5
A.超滤：将初级纯化样品(105.8L，0.3g/L)，经纤维素膜PLCHK-C 10KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩15倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:6置换，合并滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，样品过滤后，收率92.2％；
B.疏水层析：室温下，使用Source 15 ISO装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，然后用pH为7.5的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液平衡后，装载步骤A所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，上样完毕后，用pH为7.5的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.5的0.5M硫酸铵缓冲液洗脱，在280nm处从200mAU开始至300mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率93.1％；
C.反相层析：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为7.0的40mM柠檬酸三钠、130mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M氯化钠与100％异丙醇的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为7.0，以包含40mM柠檬酸三钠、130mM氯化钠和10％异丙醇的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH为7.0的40mM柠檬酸三钠、130mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为7.0的40mM柠檬酸三钠、130mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)和B相(pH为7.0的40mM柠檬酸三钠、65mM氯化钠和50％异丙醇的溶液)进行梯度洗脱(0～70％B相洗脱15CV)，在280nm处从100mAU开始至200mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率83.7％；
D.除热原：使用DEAE Sephadex A-25装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为7.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为7.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，，然后用pH为7.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.0的0.05M氯化钠和35mM柠檬酸三钠缓冲液洗脱，在280nm处从50mAU开始至100mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率87.9％；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，经纤维素膜PLC6C-C 40KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩2倍后，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻干燥，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率95.9％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例6
A.超滤：将初级纯化样品(104.5L，0.3g/L)，经纤维素膜PLCHK-C 300KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩35倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:3置换，合并滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率92.8％；
B.疏水层析：室温下，使用Source 15ETH装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，然后用pH为7.5的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液平衡后，装载步骤A所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，上样完毕后，用pH为7.5的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为3.5的0.05M硫酸铵缓冲液洗脱，在280nm处从200mAU开始至300mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率93.4％；
C.反相层析：使用Source 30RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为7.0的10mM柠檬酸三钠、100mM乙酸铵和10％乙腈的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M乙酸铵和100％乙腈的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为7.0，以包含10mM柠檬酸三钠、100mM乙酸铵和10％乙腈的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH为7.0的10mM柠檬酸三钠、100mM乙酸铵和10％乙腈的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为7.0的10mM柠檬酸三钠、100mM乙酸铵和10％乙腈的溶液)和B相(PH为7.0的10mM柠檬酸三钠、50mM乙酸铵和50％乙腈的溶液)进行梯度洗脱，(20％～80％B相洗脱15CV)在280nm处从100mAU开始至200mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率83.6％；
D.除热原：使用CM Sephadex C-25装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，并用pH为7.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为7.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，然后用pH为7.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.0的0.6M氯化钠和15mM柠檬酸三钠缓冲液洗脱，在280nm处从50mAU开始至100mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率88.1％；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，经纤维素膜PLC6C-C 50KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩6倍后，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻干燥，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率96.2％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例7
A.超滤：将初级纯化样品(110.1L，0.3g/L)，经Hydrosart膜100KD切向流过滤器澄清过滤，浓缩20倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:5置换，合并滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率91.4％；
B.疏水层析：室温下，使用Octyl Sepharose 4 Fast Flow装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，然后用pH为7.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液)平衡后，装载步骤A所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，上样完毕后，用pH为7.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为7.0的0.1M硫酸钠缓冲液洗脱，在280nm处从200mAU开始至300mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率90.1％；
C.反相层析：使用Source 30RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为8.0的30mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和3％乙腈的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M氯化钠和100％乙腈的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为8.0，以包含10～30mM柠檬酸三钠、80氯化钠和3％乙腈的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH为8.0的30mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和3％乙腈的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为8.0的30mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和3％乙腈的溶液)和B相(pH为8.0的30mM柠檬酸三钠、40mM氯化钠和80％乙腈的溶液)进行梯度洗脱，(0～80％B相洗脱15CV)在280nm处从100mAU开始至200mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率80.9％；
D.除热原：使用ANX Sepharose FF装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为8.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为8.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，然后用pH为8.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为8.0的0.1M氯化钠和20mM乙酸铵缓冲液洗脱，在280nm处从50mAU开始至100mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率85.7％；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，经纤维素膜PLCGC-C-10KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩3倍后，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻干燥，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率93.9％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例8
A.超滤：将初级纯化样品(100.8L，0.3g/L)，经三醋酸纤维素膜200KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩30倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液按体积比1:6置换，合并滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，样品过滤后，用25mM氢氧化钠清洗过滤膜包，收率91.6％；
B.疏水层析：室温下，使用Butyl Sepharose 4 Fast Flow装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，然后用pH为8.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液平衡后，装载步骤A所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，上样完毕后，用pH为8.0的5mMTris-HCl和300mM硫酸铵缓冲液洗涤层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为8.0的0.3M乙酸铵缓冲液洗脱，在280nm处从200mAU开始至300mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率90.9％；
C.反相层析：使用Source 30RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为8.0的20mM乙酸铵、120mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M氯化钠和100％异丙醇的溶液，稀释步骤B所得的流出液，调pH为8.0，以包含20mM柠檬酸三钠、120mM氯化钠和5％异丙醇的目标浓度，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH为8.0的20mM乙酸铵、120mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为8.0的20mM乙酸铵、120mM氯化钠和5％异丙醇的溶液)和B相(pH为8.0的20mM乙酸铵、60mM氯化钠和70％异丙醇的溶液)进行梯度洗脱，(30％～80％B相洗脱10CV)在280nm处从100mAU开始至200mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率80.7％；
D.除热原：使用DEAE Sepharose FF装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为6.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液平衡，用1M的柠檬酸三钠缓冲液稀释步骤C所得的流出液，调pH为6.0，以包含25mM柠檬酸三钠的目标浓度，过滤后装载至离子交换层析柱上，然后用pH为6.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为6.0的0.5M氯化钠和30mM磷酸二氢钠缓冲液洗脱，在280nm处从50mAU开始至100mAU结束收集含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，经纤维素膜PLCGC-C-20KD切向流膜过滤器澄清过滤，浓缩5倍后，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻干燥，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，收率94.5％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
对比实例1
A.超滤：将经过初级纯化处理的含有白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的样品(110.5L，0.3g/L)，经经截留分子量为5KD的超滤膜浓缩，除盐，收率91.4％；
B.离子交换层析：使用Q Sepharose FF装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为7.0的10mM柠檬酸三钠和100mM硫酸铵缓冲液平衡，然后用pH为7.0的10mM柠檬酸三钠和100mM硫酸铵缓冲液冲洗层析柱，至流出液检测值为基线吸光度值(A280)，用25mM Tris(pH8.0)，0.35M NaCl洗脱，得含白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的流出液，收率74.8％；
C.羟基磷灰石层析：使用羟基磷灰石装柱，调节层析pH为7.4，用40mM KH2PO4(pH7.4)、50mM NaH2PO4洗脱，收集合并洗脱液，收率57.6％；
D.凝胶过滤层析：使用Sephadex G-25装柱，所得产品即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，冷冻干燥后，得成品，收率85.4％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
对比实施例2
A.蛋白A俘获层析：使用
Figure BDA0002368757150000171
Ultra Plus树脂和Quickscale层析柱进行处理初级处理后的样品(100.6L，0.3g/L)，用25mM Tris、100mM氯化钠、pH 7.2平衡并用澄清后的收集物装载上样，用平衡缓冲液洗涤柱子至基线吸光度(A280)，用20mM柠檬酸三钠/柠檬酸、0.5M氯化钠、pH 6.0进行第二次洗涤，用0.1M乙酸、pH3.5将产物从柱子上洗脱下来，在280nm处1cm光程长度下从1OD开始至1OD结束收集洗脱物，收率85.4％；
B.病毒灭活、深层过滤和Q膜层析：室温下，灭活，深层过滤后，再经过Q膜处理，收率86.2％；
C.疏水层析：使用Phenyl Sepharose HP装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用水预洗柱子并用1.0M硫酸铵和18mM磷酸钠、pH 7.0进行平衡，在该精制步骤前，用2.2M硫酸铵和40mM磷酸钠、pH7.0来稀释Q膜流出物，以包含1.0M硫酸铵和18mM磷酸钠的目标浓度，上样完毕后，分别用1.1M硫酸铵和2mM磷酸钠、pH7.0和随后0.95M硫酸铵和17mM磷酸钠、pH7.0洗柱子至基线吸光度(A280)，用0.55M硫酸铵和10mM磷酸钠、pH7.0的洗脱液洗脱，在280nm处1cm光程长度下从5OD开始至1OD结束收集洗脱物，收率87.3％；
D.纳滤：将步骤C所得洗脱物进行纳滤，滤膜孔径为0.1μm，收集滤液，收率94.6％；
E.超滤和渗滤：将步骤D所得滤液经截留分子量为30KD的超滤膜，浓缩至70g/L，随后，用最小8体积的19mM组氨酸、pH 5.6进行连续渗滤，渗滤后，产品进一步浓缩至195g/L，并19mM组氨酸、pH5.6的缓冲液洗涤超滤，合并浓缩物和洗涤物，收率94.1％；
F.过滤、装瓶和冷冻干燥：2-8℃下，0.22μm过滤器泵入预先灭菌的、无致热原的聚对苯二甲酸乙二酯乙二醇容器中，将装填并标记的瓶子在-80℃下冷冻干燥，收率93.3％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
对比实施例3
A.超滤浓缩：取初级处理后的样品(108.6L，0.3g/L)，经截留分子量为3KD的超滤膜过滤，浓缩20倍后，得滤液，即为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率88.6％；
粗纯化：以Butyl Sepharose F.F.介质装柱，平衡缓冲液为25mmolTris、0.3M硫酸铵、0.5mol/LNaCl，调节pH8.0，收集透过峰目的蛋白，25mmol/L Tris pH8.0洗脱杂蛋白，得洗脱液，将所得洗脱液用盐酸调pH3.0～4.0，沉淀，所得沉淀在4℃、12000r/min下，离心15min得沉淀，沉淀用20mmol/LPB pH8.0缓冲液溶解至澄清后，0.45μm膜过滤，得滤液，收率60.3％；
精纯化：以Source 30Q.介质装柱，平衡缓冲液A为20mmol/L PB，0.2mol/LNaCl，调节pH8.0，洗脱条件为B(20mmol/L PB，0.5mol/LNaCl，pH8.0)线性梯度洗脱，收集目的蛋白峰(约35％B液)，将所得洗脱液用磷酸调pH3.0～4.0，沉淀，所得沉淀在4℃、12000r/min下，离心15min得沉淀，所得沉淀用10mmol/L PB、pH7.4缓冲液溶解至澄清后0.45μm膜过滤，得滤液，收率59.8％；
除热源和部分高分子量蛋白：以Superdex 75介质装柱，平衡缓冲液为10mmol/LPB pH6.5，洗脱液为10mmol/L PB pH6.5，得TNHH原液，收率84.7％。
冷冻干燥：将上述所得的TNHH原液用10mmol/L PB(pH7.5)稀释使TNHH蛋白浓度达3.0mg/ml后，加入甘露醇4.0％，再低温冷冻干燥成成品，收率91.2％。
表1重组蛋白的最终产物纯度检测
Figure BDA0002368757150000181
Figure BDA0002368757150000191

Claims (5)

1.一种纯化重组蛋白的方法，其特征在于，它包括如下内容：将含目的重组蛋白的发酵液通过如下步骤：
A.超滤：将初级纯化样品，经装有切向流膜的过滤器过滤，得滤液，即为含目的蛋白的过滤样品；
B.疏水层析：疏水层析填料装柱平衡后，装载步骤A所得的含目的蛋白的过滤样品，用平衡缓冲液洗涤层析柱至基线吸光度，洗脱液洗脱，收集并合并含目的重组蛋白的流出液；
C.反相层析：稀释步骤B所得的含目的重组蛋白的流出液，过滤，并装载至反相层析柱上，用平衡液冲洗层析柱至基线吸光度，梯度洗脱，收集并合并含目的重组蛋白的流出液；
D.除热原：弱离子交换层析装柱后，装载步骤C所得的含目的重组蛋白的流出液，用平衡液平衡至基线吸光度，洗脱，收集并合并含目的重组蛋白的的流出液；
E.超滤和装瓶：将步骤D所得的含目的重组蛋白的流出液，经装有切向流膜的过滤器超滤浓缩，收集滤液，即为目的重组蛋白；
其中步骤B中所述的洗脱液为0.05～0.5M的硫酸铵、硫酸钠、乙酸铵、氯化钠或氯化钾溶液；
步骤C中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为5～40mM柠檬酸三钠、70～130mM乙酸钠、氯化钠或乙酸铵中的任一种和5～10％乙腈或异丙醇的混合溶液，B相为5～40mM柠檬酸三钠、35～65mM硫酸铵、氯化钠或乙酸铵溶液的任一种和50～70％乙腈或异丙醇的混合溶液；
步骤D中所述的洗脱液为0.05～0.7M氯化钠和10～35mM的柠檬酸三钠、乙酸铵和磷酸二氢钠溶液中的任一种的混合溶液；
步骤A中所述的切向流膜为纤维素膜或聚醚砜膜；步骤B中所述的疏水层析的填料为Phenyl Sepharose或Source；步骤C中所述的离子交换层析的填料为Source RPC；步骤D中所述的弱离子交换层析的填料为DEAE；步骤E中所述的切向流膜为PLC6C-C或PLCGC-C；所述重组蛋白为白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述的切向流膜的截留分子量为10～300KD。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中所述的离子交换层析的填料为Source 15RPC或Source 30RPC 1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中所述的弱离子交换层析的填料为DEAE Sephadex A-25、DEAE Sephadex A-50或CM Sephadex C-25。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤E中所述的切向流膜的截留分子量为5～50KD。
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