CN113975383A

CN113975383A - 一种红色红球菌免疫增强剂及其在猪用疫苗中的应用

Info

Publication number: CN113975383A
Application number: CN202111196854.8A
Authority: CN
Inventors: 严悌昆; 张毓金; 陈珊; 王文勇; 黄淑芬
Original assignee: Guangzhou Keli Biotechnology Co ltd; Guangdong Yuyue Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Keli Biotechnology Co ltd; Guangdong Yuyue Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113975383B

Abstract

本发明属于猪用生物制品技术领域，具体涉及一种红色红球菌免疫增强剂及其在猪用疫苗中的应用。本发明的红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖，所述红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖的质量比为8‑10:3‑4:1。采用本发明免疫增强剂制得的猪用油乳剂灭活疫苗安全、高效，抗体持续时间长，免疫保护效果好。

Description

一种红色红球菌免疫增强剂及其在猪用疫苗中的应用

技术领域

本发明属于猪用生物制品技术领域，具体涉及一种红色红球菌免疫增强剂及其在猪用疫苗中的应用。

背景技术

近年来，养猪业所面对的是比以往更复杂多变的猪病，不仅疾病种类越来越多，而且越来越难防治。这种现象主要是由多种外来病的引入以及病毒的变异更新所致。随着传染性病毒病如猪蓝耳病、猪圆环2型、猪瘟、猪伪狂犬病等疫病的大肆流行,市场上的新疫苗也随之应运而生。目前国内诸病免疫抑制性疾病的发生几率普遍升高，产生严重危害。在这种情况下，猪疫病的防控工作变得更加重要，而且需要将重点放在免疫抑制性疾病的全面控制方面。在猪病防控中，免疫增强剂的应用至关重要。

虽然现有技术中存在应用于猪用疫苗中的免疫增强剂，但是应用于猪用疫苗中的免疫增强剂存在免疫保护效果差等问题。因此，迫切需要开发出一种高效猪用免疫增强剂。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种红色红球菌免疫增强剂及其在猪用疫苗中的应用。采用本发明免疫增强剂制得的猪用油乳剂灭活疫苗安全、高效，抗体持续时间长，免疫保护效果好。

本发明的技术方案是：

一种红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖。

进一步地，所述红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖的质量比为8-10:3-4:1。

进一步地，所述红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖的质量比为9:3:1。

进一步地，所述红色红球菌的培养物的制备方法为：

将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养24-36h，高温高压灭活，即得；所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1-2％，酵母粉2-4％，磷酸氢二钾0.01-0.02％，硫酸镁0.4-0.7％，胰蛋白胨3-5％，发酵助剂0.3-0.5％，纯化水87.78-92.29％。

进一步地，所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1％，酵母粉3％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.5％，胰蛋白胨4％，发酵助剂0.4％，纯化水91.09％。

进一步地，所述发酵助剂包括草酸和蛋氨酸。

进一步地，所述草酸和蛋氨酸的质量比为2-4:10-15。

进一步地，所述培养基的pH为7.0-7.2。

进一步地，将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6％、装液量为罐容积的70％、温度30±1℃。

进一步地，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min。

本发明的另一目的在于提供上述的红色红球菌免疫增强剂在制备猪用油乳剂灭活疫苗中的应用。

一种猪用油乳剂灭活疫苗，包括上述的红色红球菌免疫增强剂。

所述的猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1取红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖，采用121℃高压蒸汽灭活30min，灭菌后待温度降至室温时，4℃保存备用；

S2将红色红球菌的培养物进行定量，得定量的红色红球菌的培养物；

S3将步骤S2所得定量的红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖按乳化配方添加至抗原水相中，搅拌均匀并进行常规乳化，得初始的猪用油乳剂灭活疫苗；

S4将步骤S3所得初始的猪用油乳剂灭活疫苗经物理性状检测，安全性检测、效力试验检测及商品动物免疫检测，验证合格后，即得。

进一步地，所述步骤S2中红色红球菌的培养物的定量过程为：无菌移取30mL免疫增强剂样本平分到3支15mL离心管中，12000r/min高速离心5min，弃除上清液后，置于103℃干燥箱中充分干燥2小时，测定样本干物质重量。

进一步地，所述步骤S3的具体操作为：取2.5mg定量的红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖添加到抗原液中，加入5mL的Tween-80后混匀，充分混合溶解后，最终总体积为100mL，制备成抗原水相；按照抗原水相：油相＝1:2比例，使用IKAT25乳化机，12000r/min高速乳化5min。

进一步地，所述步骤S3中的抗原包括高致病性蓝耳病病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪圆环2型病毒抗原、猪支原体、猪瘟病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎、采用基因工程表达的猪蓝耳病GP5抗原、采用基因工程表达猪圆环病毒Cap蛋白、采用基因工程表达的猪瘟E2蛋白。

进一步地，所述步骤S4中商品动物免疫检测是采用市购的商品猪进行动物实验，模拟临床进行疫苗效果评估。

疫苗的安全、高效是评价其质量的重要指标，而选择合适的免疫增强剂对于疫苗的安全性和效力至关重要。本发明采用由红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖特定组分及质量比组成的红色红球菌免疫增强剂，各组分协同作用，可以增强各种抗原的免疫原性，延长抗体持续时间，提高疫苗的免疫效果。

采用本发明特定的培养基制得的红色红球菌的培养物中类脂类化合物、多糖等成分含量高，能够非特异性刺激细胞免疫功能，并且可以显著促进多种细胞因子分泌，将其添加到猪用油乳剂灭活疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体的产生，且抗体持续时间长。

将本发明的免疫增强剂用于猪用油乳剂灭活疫苗的制备过程，可以根据选择的抗原不同，从而使获得针对不同病毒的疫苗，适用范围宽。采用本发明免疫增强剂制得的猪用油乳剂灭活疫苗具有高度安全性，疫苗注射局部无明显残留，安全、高效。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)本发明采用由红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖特定组分及质量比组成的红色红球菌免疫增强剂，各组分协同作用，可以增强各种抗原的免疫原性，提高疫苗的免疫效果，免疫保护效果好。

(2)本发明的红色红球菌的培养物通过在发酵罐中对红色红球菌进行培养得到，培养过程简单，发酵时间短，有利于红色红球菌的培养物的大规模获得。

(3)将本发明的免疫增强剂用于猪用油乳剂灭活疫苗的制备过程，可以根据选择的抗原不同，从而使获得针对不同病毒的疫苗，具有适用范围宽，特异性强的优点。

(4)将本发明免疫增强剂用于制备猪用油乳剂灭活疫苗，具有高度安全性，疫苗注射局部无明显残留，且抗体持续时间长，免疫保护效果好。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明中所用原料如无特殊说明均为市售。如壳寡糖可购自浙江康兴生物科技有限公司，货号：K6；云芝多糖可购自西安瑞尔丽生物工程有限公司，货号：REL1056；本发明中红色红球菌可购自广东省微生物菌种保藏中心，GDMCC No.：GDMCC 1.819。

实施例1、一种红色红球菌免疫增强剂

所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖；所述红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖的质量比为8:4:1。

所述红色红球菌的培养物的制备方法为：将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养24h，培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6％、装液量为罐容积的70％、温度30℃，高温高压灭活，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min，即得；

所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1％，酵母粉2％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.4％，胰蛋白胨3％，发酵助剂0.3％，纯化水92.29％；所述发酵助剂由草酸和蛋氨酸按质量比2:15组成；所述培养基的pH为7.0。

实施例2、一种红色红球菌免疫增强剂

所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖；所述红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖的质量比为10:3:1。

所述红色红球菌的培养物的制备方法为：将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养36h，培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6％、装液量为罐容积的70％、温度30℃，高温高压灭活，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min，即得；

所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖2％，酵母粉4％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸镁0.7％，胰蛋白胨5％，发酵助剂0.5％，纯化水87.78％；所述发酵助剂由草酸和蛋氨酸按质量比4:10组成；所述培养基的pH为7.2。

实施例3、一种红色红球菌免疫增强剂

所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖；所述红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖的质量比为9:3:1。

所述红色红球菌的培养物的制备方法为：将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养30h，培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6％、装液量为罐容积的70％、温度30℃，高温高压灭活，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min，即得；

所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1％，酵母粉3％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.5％，胰蛋白胨4％，发酵助剂0.4％，纯化水91.09％；所述发酵助剂由草酸和蛋氨酸按质量比3:14组成；所述培养基的pH为7.2。

实施例4、一种猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法

所述猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

I.红色红球菌免疫增强剂样本灭菌处理及定量

取实施例3包括红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的红色红球菌免疫增强剂样本若干，采用121℃高压蒸汽灭活30min，灭菌后样本待温度降至室温时，4℃保存备用。

红色红球菌的培养物样本使用前，需进行定量。定量过程为：无菌移取30mL免疫增强剂样本平分到3支15mL离心管中，12000r/min高速离心5min，弃除上清液后，置于103℃干燥箱中充分干燥2小时，测定样本干物质重量。

II.添加红色红球菌免疫增强剂的油乳剂灭活疫苗的制备

(1)抗原水相的制备

取2.5mg定量的红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖添加到高致病性蓝耳病病毒抗原中，加入5mL的Tween-80后混匀，充分混合溶解后，最终总体积为100mL，制备成抗原水相。同时设立未添加红色红球菌免疫增强剂的高致病性蓝耳病病毒抗原对照组，对照组与试验组的差异仅为是否添加红色红球菌免疫增强剂，其他均相同处理。

注意，制备抗原水相时应先制备不加红色红球菌免疫增强剂的对照组抗原水相，然后再制备含红色红球菌免疫增强剂的试验组抗原水相。

(2)乳化制备疫苗

取上述制备的抗原水相100mL，缓慢加入到200mL按照乳化配方制备的油相中，所述油相的制备方法为：在矿物油中加入司本-80，混匀后加入硬脂酸铝，混匀，灭菌，即得；所述矿物油(V/mL)：司本-80(V/mL)：硬脂酸铝(W/g)为94:6:1.5；使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原水相加入过程中保持5000r/min低速搅拌，待抗原水相完全加入到油相后，调节乳化机转速为12000r/min高速剪切乳化5min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用，得初始的猪用油乳剂灭活疫苗。

注意，制备疫苗时应先制备不加红色红球菌免疫增强剂的对照组疫苗，然后再制备含红色红球菌免疫增强剂的试验组疫苗。

(3)猪油乳剂灭活疫苗的检测；

将所得初始的猪用油乳剂灭活疫苗经物理性状检测，安全性检测、效力试验检测及商品动物免疫检测，验证合格后，即得。

对比例1、一种红色红球菌免疫增强剂

所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物和壳寡糖；所述红色红球菌的培养物和壳寡糖的质量比为9:3。

对比例2、一种红色红球菌免疫增强剂

所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物和壳寡糖；所述红色红球菌的培养物和壳寡糖的质量比为1:1。

对比例3、一种猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法

所述猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法与实施例4类似；

与实施例4的不同在于，红色红球菌免疫增强剂为对比例1制备的红色红球菌免疫增强剂。

对比例4、一种猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法

所述猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法与实施例4类似；

与实施例4的不同在于，红色红球菌免疫增强剂为对比例2制备的红色红球菌免疫增强剂。

试验例一、猪用油乳剂灭活疫苗物理性状检测

取实施例4制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：

A.每组疫苗取10mL样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。

B.将疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况。

C.每组取30mL疫苗，分别分装入3支10mL锥底离心管，3000r/min离心15min，观察有无分层破乳现象。如有破乳分层，说明疫苗制备不成功，需重新制备。

D.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳。

试验结果如下：

A.试验组疫苗粘度35cp，对照组疫苗41cp，二者均合格。

B.试验组疫苗与对照组疫苗均合格。

C.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。

D.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。

试验例二、猪用油乳剂灭活疫苗安全性试验

采用实施例4试验组制备的疫苗免疫21日龄断奶仔猪(非洲猪瘟抗原抗体阴性、猪蓝耳病抗原抗体双阴性)，2.0mL/只，每组疫苗免疫5头，每日观察猪只健康状态，连续观察14天。

试验结果显示，仔猪无死亡，健康状况良好，由此说明采用本发明免疫增强剂制得的疫苗合格，安全。

试验例三、猪用油乳剂灭活疫苗效力性试验

分别采用实施例4试验组、对比例3、对比例4、对照组制备的疫苗免疫21日龄断奶仔猪(非洲猪瘟抗原抗体阴性、猪蓝耳病抗原抗体双阴性)，1.0mL/只，每组疫苗免疫5头，每头打上耳牌，疫苗注射后21天加强免疫一次，分别采血测定二次免疫后14和21天血清中和抗体效价。另外设置空白组，试验结果如表1所示。

表1：高致病性蓝耳病灭活疫苗抗体测定结果

由表1可知，本发明提供的疫苗二次免疫猪只21天后，其中和抗体水平与对照组呈显著差异。采用本发明免疫增强剂制得的疫苗二次免疫后14和21天后血清中和抗体效价明显优于对照组、对比例3组、对比例4组。结果表明，采用本发明免疫增强剂制得的疫苗对猪蓝耳病具有高效的保护作用。

Claims

1.一种红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，包括红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖。

2.如权利要求1所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖的质量比为8-10:3-4:1。

3.如权利要求2所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖的质量比为9:3:1。

4.如权利要求1所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述红色红球菌的培养物的制备方法为：

5.如权利要求4所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述发酵助剂包括草酸和蛋氨酸。

6.如权利要求5所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述草酸和蛋氨酸的质量比为2-4:10-15。

7.如权利要求1-6任一项所述的红色红球菌免疫增强剂在制备猪用油乳剂灭活疫苗中的应用。

8.一种猪用油乳剂灭活疫苗，包括权利要求1-6任一项所述的红色红球菌免疫增强剂。

9.如权利要求8所述的猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S3将步骤S2所得定量的红色红球菌的培养物、壳寡糖和云芝多糖按乳化配方添加至抗原水相中，搅拌均匀并进行常规乳化，得初始的猪用油乳剂灭活疫苗；S4将步骤S3所得初始的猪用油乳剂灭活疫苗经物理性状检测，安全性检测、效力试验检测及商品动物免疫检测，验证合格后，即得。

10.如权利要求9所述的猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的抗原包括高致病性蓝耳病病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪圆环2型病毒抗原、猪支原体、猪瘟病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪传染性胸膜肺炎、采用基因工程表达的猪蓝耳病GP5抗原、采用基因工程表达猪圆环病毒Cap蛋白、采用基因工程表达的猪瘟E2蛋白。