CN104623654A

CN104623654A - 壳寡糖的应用及含壳寡糖的疫苗剂

Info

Publication number: CN104623654A
Application number: CN201510008726.4A
Authority: CN
Inventors: 李萍; 王海漩; 乌美妮; 李彦涵; 孙静; 李建芳; 胡凝珠; 胡云章; 施建东
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Chinese Academy of Medical Sciences CAMS; Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2015-05-20

Abstract

本发明提供一种壳寡糖的应用及含壳寡糖的疫苗剂，壳寡糖作为佐剂应用在疫苗中，即每单份疫苗中含有2.5～10mg的壳寡糖。本发明提供的壳寡糖是由2～10个氨基葡萄糖构成的分子量小于3000的壳寡糖混合物，毒副作用小，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的，能够有效诱导抗原特异性的体液免疫应答，且所诱导的体液免疫应答效果优于无佐剂组，壳寡糖原料易得，为市售产品，制备工艺简单，成本低，性能稳定，生物学效价较高，无毒副作用，可添加于多种传统疫苗和基因工程疫苗中作为佐剂。

Description

壳寡糖的应用及含壳寡糖的疫苗剂

技术领域

本发明涉及一种壳寡糖的应用及含壳寡糖的疫苗剂，属于免疫学技术领域。

背景技术

随着疫苗研究的不断深入，特别是分子生物学技术的迅速发展，新型基因工程疫苗纯度高，特异性强，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要免疫佐剂来增强其免疫原性。目前国际上批准的可以用于人类的佐剂包括铝盐，MF59，AS03和AS04。铝盐佐剂在提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证实，但由于其会引起过敏、诱导退行性神经病变等缺点，迫切需要开发新型疫苗佐剂以克服这些缺陷，更好的为人类服务。

新的佐剂在不断的被发现，但是大部分佐剂因为存在成本高；安全性差；稳定性差；不易运输储藏；易引起自身性免疫疾病及强烈的毒性反应包括溶血，肉芽肿，皮下结节等问题而不能被广泛使用。因而研制开发活性强、可生物代谢、无毒副作用，甚至有治疗作用的新型佐剂势在必行。

壳寡糖（chtiosnaoligosaccharide,COS）是指2～10个氨基葡萄糖通过β（1-4）糖苷键连接而成的分子量小于3000水溶性化合物，它是由甲壳素或壳聚糖经酶降解或化学降解获得的。COS是天然糖中唯一大量存在的碱性多糖，除了具有类似壳聚糖的性质外，其还具有粘度低，水溶性好，分子量小，容易吸收利用及可降解等优点，生物活性及功能性质都较壳聚糖更加广泛。研究表明COS是极理想的生物活性物质，具有调节血糖血脂，抗氧化，抗感染，增强免疫和抗肿瘤等多种生物学活性。COS对免疫***存在着多元，多效性的调节作用。研究发现COS能够增强T细胞表面IL-2受体的表达，加速T细胞的成熟并释放IL-2，IL-2与相应受体结合后，将进一步加速静息的T细胞分化成熟为效应的T细胞。除此之外还有研究表明COS能显著激活T细胞促使巨噬细胞活化因子的释放，进而激活巨噬细胞，高浓度的COS能引起巨噬细胞等胞浆中游离的Ca²⁺浓度的升高，从而可能活化钙/钙调素依赖性蛋白激酶（CaMKⅡ）。活化的CaMKⅡ通过直接结合，磷酸化并活化TLR信号中重要的信号分子TAK1和IRF3，增强下游信号通路的活化，从而加强TLR配体诱导炎症细胞因子IL-2，TNF-a和IFN-1的分泌。总之COS能促进T,B细胞和其他免疫细胞的增殖和分化，协调免疫细胞间的相互作用，并能刺激各种免疫细胞产生多种细胞因子，从而提高免疫***的功能，具有良好的佐剂研究价值。

发明内容

为解决现有疫苗佐剂存在的成本高，毒副作用强等问题，本发明提供一种安全，有效，制备工艺简单且成本低的壳寡糖佐剂以及含有壳寡糖佐剂的疫苗剂。

本发明通过下列技术方案实现：壳寡糖作为佐剂在疫苗中的应用。

所述壳寡糖为市购产品，为2～10个氨基葡萄糖聚合而成，分子式为（C₆H₁₁NO₄）_n(n=2-10)，分子量小于3000，脱乙酰度大于92%。结构式如图1所示。

本发明提供一种含有壳寡糖的疫苗剂，其特征在于：每单份疫苗中含有2.5～10mg的壳寡糖。

所述每单份疫苗剂为临床使用的常规单次注射参考量。

所述壳寡糖的含量优选5mg。

本发明的还提供一种含有壳寡糖疫苗剂的制备方法，其特征在于经过下列各步骤：按每单份疫苗剂加入2.5～10mg壳寡糖的量，在抗原剂中加入用无菌水溶解的壳寡糖，再加生理盐水至注射所需量，按常规混合均匀，即得含有壳寡糖的疫苗剂。

所述壳寡糖与无菌水的固液比mg/μL为2.5～10：50～120。

所述抗原剂为常规甲肝抗原、乙肝抗原、狂犬病毒抗原中的一种。

本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：（1）有研究表明壳聚糖佐剂能够与疫苗配合达到很好的诱导机体免疫的效果，但是壳聚糖存在分子量大，难溶于水等缺点，壳寡糖是壳聚糖脱乙酰化后的产物，其分子量小，易溶于水，生物活性较壳聚糖更加广泛。（2）壳寡糖属低分子量聚糖，安全，无毒副作用，成本低，制备工艺简单。（3）壳寡糖佐剂能有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，且其所诱导的体液免疫应答效果优于无佐剂组。（4）壳寡糖诱导体液免疫应答的能力与铝佐剂相当，具有良好的佐剂应用价值。

附图说明

图1为壳寡糖的分子结构式，图中2≤n≤10。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。

实施例1

本例提供的含有壳寡糖佐剂的甲肝疫苗是：按每单份疫苗剂加入2.5mg壳寡糖的量，在甲肝（HAV）抗原中加入用50μL无菌水溶解的壳寡糖，再加生理盐水至200μL，按常规混合均匀，即得含有壳寡糖的甲肝疫苗剂。

其中，壳寡糖为市购产品，为2～10个氨基葡萄糖聚合而成的，分子量小于3000，购自湖北威得利化学科技有限公司；HAV抗原为市购的滴度为256EU/ml的18EU HAV抗原液，由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所提供。

实施例1所得含有壳寡糖佐剂的甲肝疫苗的免疫实验和效果如下：

A、免疫

将6～8周龄，18～22g的清洁剂ICR小鼠随机分为壳寡糖佐剂组，氢氧化铝佐剂组，无佐剂组和空白组，共四组，每组8只；所用氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京：人民卫生出版社。2005：:18-119），在人体中的剂量为1.8～2.7mg。

对壳寡糖佐剂组：注射实施例1的含有壳寡糖佐剂的甲肝疫苗至小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μl，其中200μl中含有壳寡糖2.5mg，甲肝抗原18EU。

对氢氧化铝佐剂组：将氢氧化铝0.3mg与甲肝抗原18EU混合后加生理盐水至200μl,经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μl。

对无佐剂组：将甲肝抗原18EU与生理盐水混合至200μl，再经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μl.

对空白组：仅注射生理盐水，注射剂量为每只小鼠200μl.

免疫方案：在第0周经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。

B、ELISA检测血清抗-HAV IgG水平

在免疫后的第4,8,12,16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，按KPL公司通用ELISA试剂盒说明书操作检测小鼠血清IgG抗体。数据分析。

对所获得的实验数据以SPSS18.0软件进行单因素方差分析，以P<0.05为有统计意义的差异。

表1为使用实施例1提供的佐剂免疫后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG水平（抗体效价值）：

表1

通过数据分析可以看出，从免疫后第四周开始，除空白组外，各实验组都能产生抗-HAV IgG抗体，并普遍于第8周达到峰值，其中铝佐剂组效果最佳，16周之内抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，P<0.05。壳寡糖佐剂组的抗体水平也显著高于无佐剂疫苗组，其在4～12周内与铝佐剂对照组抗体水平相当，但到第16周其抗体水平有所降低。说明壳寡糖2.5mg剂量组具有体液免疫增强作用。

实施例2

本例提供的含有壳寡糖佐剂的甲肝疫苗是：按每单份疫苗剂加入5mg壳寡糖的量，在甲肝（HAV）抗原中加入用100μL无菌水溶解的壳寡糖，再加生理盐水至200μL，按常规混合均匀，即得含有壳寡糖的疫苗剂。其中，壳寡糖、HAV抗原同实施例1；

本例所得含有壳寡糖佐剂的甲肝疫苗的免疫实验同实施例1，结果见表2。

表2为使用实施例2提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG抗体水平：

表2

通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外，各实验组都能产生抗-HAV IgG抗体，并普遍于第8周达到峰值，其中铝佐剂组效果最佳，16周之内抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，P<0.05。壳寡糖佐剂组的抗体水平也显著高于无佐剂疫苗组，其在4～12周内与铝佐剂对照组抗体水平相当，但到第16周其抗体水平有所降低。说明壳寡糖5mg剂量组具有体液免疫增强作用。

实施例3

本例提供的含有壳寡糖佐剂的甲肝疫苗是：按每单份疫苗剂加入10mg壳寡糖的量，在甲肝（HAV）抗原中加入用120μL无菌水溶解的壳寡糖，再加生理盐水至200μL，按常规混合均匀，即得含有壳寡糖的甲肝疫苗剂。其中，壳寡糖、HAV抗原同实施例1；

本例所得含有壳寡糖佐剂的甲肝疫苗的免疫实验同实施例1，结果见表3.

表3为使用实施例2提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG抗体水平：

表3

通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-HAV IgG抗体，并普遍于第8周达到峰值，其中壳寡糖10mg组在16周之内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P<0.05。4～12周壳寡糖10mg剂量组抗体水平与铝佐剂相当，并在第八周显著高于铝佐剂对照组，P<0.05。至16周壳寡糖10mg剂量组抗体水平有所下降但还是明显高于无佐剂组，表明壳寡糖10mg佐剂组能有效增强体液免疫反应。

实施例4

本例提供的含有壳寡糖佐剂的乙肝疫苗是：按每单份疫苗剂加入5mg壳寡糖的量，在乙肝抗原中加入用120μL无菌水溶解的壳寡糖，再加生理盐水至200μL，按常规混合均匀，即得含有壳寡糖的乙肝疫苗剂。

其中，壳寡糖同实施例1，乙肝抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。

本例所得含有壳寡糖佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表4。

表4为使用实施例3提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原 IgG抗体水平：

表4

通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-乙肝表面抗原 IgG 抗体，并普遍于第8周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周之内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。壳寡糖佐剂组的抗体水平也显著高于无佐剂组，P<0.05。从表4中也可以看出，在第8周时，壳寡糖5mg佐剂组的抗体水平与同期的铝佐剂组抗体水平接近，但两者间的差异不具有统计学意义（P＜0.05），表明5mg壳寡糖佐剂组能有效增强体液免疫反应。

实施例5

本发明提供的含有壳寡糖佐剂的疫苗是：按每单份疫苗剂加入5mg壳寡糖的量，在狂犬病毒抗原中加入用110μL无菌水溶解的壳寡糖，再加生理盐水至200μL，按常规混合均匀，即得含有壳寡糖的狂犬疫苗剂。

其中，壳寡糖同实施例1；狂犬病毒抗原为常规的含狂犬病毒抗原0.125IU的市购产品，购自大连汉信生物制药有限公司。

本例所得含有壳寡糖佐剂的狂犬疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表5。

表5为使用实施例4提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗体水平：

表5

通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗狂犬病毒 IgG抗体，并普遍于第8周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周之内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。壳寡糖佐剂组的抗体水平也显著高于无佐剂组。但从表5中也可以看出，在第8周时，壳寡糖5mg佐剂组的抗体水平与同期的铝佐剂组抗体水平接近，但两者间的差异不具有统计学意义（P＜0.05），表明5mg壳寡糖佐剂组能有效增强体液免疫反应。

Claims

1.壳寡糖作为佐剂在疫苗中的应用。

2.一种含有壳寡糖的疫苗剂，其特征在于：每单份疫苗中含有2.5～10mg的壳寡糖。

3.根据权利要求2所述的疫苗剂，其特征在于：所述壳寡糖为市购产品，为2～10个氨基葡萄糖聚合而成，分子式为（C₆H₁₁NO₄）_n(n=2-10)，分子量小于3000，脱乙酰度大于92%。

4.根据权利要求2所述的疫苗剂，其特征在于：所述每单份疫苗剂为临床使用的常规单次注射参考量。

5.根据权利要求2所述的疫苗剂，其特征在于：所述壳寡糖的含量为5mg。

6.一种含有壳寡糖疫苗剂的制备方法，其特征在于经过下列各步骤：按每单份疫苗剂加入2.5～10mg壳寡糖的量，在抗原剂中加入用无菌水溶解的壳寡糖，再加生理盐水至注射所需量，按常规混合均匀，即得含有壳寡糖的疫苗剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述壳寡糖与无菌水的固液比mg/μL为2.5～10：50～120。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述抗原剂为常规甲肝抗原、乙肝抗原、狂犬病毒抗原中的一种。