CN113975384B - 一种红色红球菌免疫增强剂及其在鱼用疫苗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于鱼用生物制品技术领域，具体涉及一种红色红球菌免疫增强剂及其在鱼用疫苗中的应用。本发明的红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、β‑葡聚糖和益母草碱，所述红色红球菌的培养物、β‑葡聚糖和益母草碱的质量比为15‑20:3‑6:2‑4。本发明采用由红色红球菌的培养物、β‑葡聚糖和益母草碱特定组分及质量比组成的红色红球菌免疫增强剂，各组分协同作用，可以增强各种抗原的免疫原性，提高疫苗的免疫效果。采用本发明免疫增强剂制得的鱼用油乳剂灭活疫苗安全、高效。
Description
技术领域
本发明属于鱼用生物制品技术领域，具体涉及一种红色红球菌免疫增强剂及其在鱼用疫苗中的应用。
背景技术
鱼类传染性疾病的病原主要包括细菌、病毒或寄生虫，能引起鱼类的急性、亚急性或慢性感染，导致水产养殖生产遭受病害的侵袭，造成严重损失，严重危害养殖业的可持续发展。采用抗生素或化学药物等方法进行预防或治疗，往往带来诸如微生物耐药性、产品药物残留及环境污染等弊端，对感染性疾病进行鱼类疫苗免疫接种可安全高效地控制疾病发生与流行，是国际上普遍接受的疾病控制技术，对水产养殖产业的健康可持续发展具有重要意义。
虽然现有技术中存在应用于鱼用疫苗中的免疫增强剂，但是目前在水产养殖业中应用于疫苗的有效疫苗免疫增强剂种类较少，且存在免疫保护效果差等问题。因此，迫切需要开发出一种高效鱼用免疫增强剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种红色红球菌免疫增强剂及其在鱼用疫苗中的应用。本发明采用由红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱特定组分及质量比组成的红色红球菌免疫增强剂，各组分协同作用，可以增强各种抗原的免疫原性，提高疫苗的免疫效果。采用本发明免疫增强剂制得的鱼用油乳剂灭活疫苗安全、高效，抗体持续时间长，免疫保护效果好。
本发明的技术方案是：
一种红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱。
进一步地，所述红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的质量比为15-20:3-6:2-4。
进一步地，所述红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的质量比为16:5:3。
进一步地，所述红色红球菌的培养物的制备方法为：
将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养24-36h，高温高压灭活，即得；所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1-2%，酵母粉2-4%，磷酸氢二钾0.01-0.02%，硫酸镁0.4-0.7%，胰蛋白胨3-5%，发酵助剂0.3-0.5%，纯化水87.78-92.29%。
进一步地，所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1%，酵母粉3%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.5%，胰蛋白胨4%，发酵助剂0.4%，纯化水91.09%。
进一步地，所述发酵助剂包括草酸和蛋氨酸。
进一步地，所述草酸和蛋氨酸的质量比为2-4:10-15。
进一步地，所述培养基的pH为7.0-7.2。
进一步地，将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6%、装液量为罐容积的70%、温度30±1℃。
进一步地，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min。
本发明的另一目的在于提供上述的红色红球菌免疫增强剂在制备鱼用油乳剂灭活疫苗中的应用。
一种鱼用油乳剂灭活疫苗，包括上述的红色红球菌免疫增强剂。
所述的鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1取红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱，采用121℃高压蒸汽灭活30min，灭菌后待温度降至室温时，4℃保存备用；
S2将红色红球菌的培养物进行定量，得定量的红色红球菌的培养物；
S3将步骤S2所得定量的红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱按乳化配方添加至抗原水相中，搅拌均匀并进行常规乳化，得初始的鱼用油乳剂灭活疫苗；
S4将步骤S3所得初始的鱼用油乳剂灭活疫苗经物理性状检测，安全性检测、效力试验检测及商品动物免疫检测，验证合格后，即得。
进一步地，所述步骤S2中红色红球菌的培养物的定量过程为：无菌移取30mL红色红球菌的培养物样本平分到3支15mL离心管中，12000r/min高速离心5min，弃除上清液后，置于103℃干燥箱中充分干燥2小时，测定样本干物质重量。
进一步地，所述步骤S2的具体操作为：取3mg定量的红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱添加到抗原液中，加入5mL的Tween-80后混匀，充分混合溶解后，最终总体积为100mL，制备成抗原水相；按照抗原水相：油相=1:2比例，使用IKA T25乳化机，12000r/min高速乳化5min。
进一步地，所述步骤S3中的抗原包括传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）抗原、石斑鱼虹彩病毒（GIV）抗原、大黄鱼虹彩病毒（LYCIV）抗原、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）抗原、神经坏死病（Viral nervous necrosis，VNN）、鳜蛙病毒、黄鳍鲷腹水病病毒、鳜鱼弹状病毒、石斑鱼虹彩病毒、真鲷虹彩病毒、流行性造血器官坏死病毒 、鲤疱疹病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒血症病毒。
进一步地，所述步骤S3中商品动物免疫检测是采用市购的商品鱼进行动物实验，模拟临床进行疫苗效果评估。
疫苗的安全、高效是评价其质量的重要指标，而选择合适的免疫增强剂对于疫苗的安全性和效力至关重要。本发明采用由红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱特定组分及质量比组成的红色红球菌免疫增强剂，各组分协同作用，可以增强各种抗原的免疫原性，提高疫苗的免疫效果。
采用本发明特定的培养基制得的红色红球菌的培养物中类脂类化合物、多糖等成分含量高，能够非特异性刺激细胞免疫功能，并且可以显著促进多种细胞因子分泌，将其添加到鱼用油乳剂灭活疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体的产生，且抗体持续时间长。将本发明的免疫增强剂用于鱼用油乳剂灭活疫苗的制备过程，可以根据选择的抗原不同，从而使获得针对不同病毒的疫苗，适用范围宽。采用本发明免疫增强剂制得的鱼用油乳剂灭活疫苗具有高度安全性，疫苗注射局部无明显残留，安全、高效。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
（1）本发明采用由红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱特定组分及质量比组成的红色红球菌免疫增强剂，各组分协同作用，可以增强各种抗原的免疫原性，提高疫苗的免疫效果，免疫保护效果好。
（2）本发明的红色红球菌的培养物通过在发酵罐中对红色红球菌进行培养得到，培养过程简单，发酵时间短，有利于红色红球菌的培养物的大规模获得。
（3）将本发明的免疫增强剂用于鱼用油乳剂灭活疫苗的制备过程，可以根据选择的抗原不同，从而使获得针对不同病毒的疫苗，具有适用范围宽，特异性强的优点。
（4）将本发明免疫增强剂用于制备鱼用油乳剂灭活疫苗，具有高度安全性，疫苗注射局部无明显残留，且抗体持续时间长，免疫保护效果好。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明中所用原料如无特殊说明均为市售。本发明中红色红球菌可购自广东省微生物菌种保藏中心，GDMCC No.：1.819。
实施例1、一种红色红球菌免疫增强剂
所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱；所述红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的质量比为15:6:4；所述红色红球菌的培养物的制备方法为：将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养24h，培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6%、装液量为罐容积的70%、温度30℃，高温高压灭活，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min，即得；
所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1%，酵母粉2%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.4%，胰蛋白胨3%，发酵助剂0.3%，纯化水92.29%；所述发酵助剂由草酸和蛋氨酸按质量比2:15组成；所述培养基的pH为7.0。
实施例2、一种红色红球菌免疫增强剂
所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱；所述红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的质量比为20:3:2；所述红色红球菌的培养物的制备方法为：将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养36h，培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6%、装液量为罐容积的70%、温度30℃，高温高压灭活，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min，即得；
所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖2%，酵母粉4%，磷酸氢二钾0.02%，硫酸镁0.7%，胰蛋白胨5%，发酵助剂0.5%，纯化水87.78%；所述发酵助剂由草酸和蛋氨酸按质量比4:10组成；所述培养基的pH为7.2。
实施例3、一种红色红球菌免疫增强剂
所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱；所述红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的质量比为16:5:3。
所述红色红球菌的培养物的制备方法为：将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养30h，培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6%、装液量为罐容积的70%、温度30℃，高温高压灭活，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min，即得；
所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1%，酵母粉3%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.5%，胰蛋白胨4%，发酵助剂0.4%，纯化水91.09%；所述发酵助剂由草酸和蛋氨酸按质量比3:14组成；所述培养基的pH为7.2。
实施例4、一种鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法
所述鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
I.红色红球菌免疫增强剂样本灭菌处理及定量
取实施例3包括红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的红色红球菌免疫增强剂样本若干，采用121℃高压蒸汽灭活30min，灭菌后样本待温度降至室温时，4℃保存备用。
红色红球菌的培养物使用前，需进行定量。定量过程为：无菌移取30mL红色红球菌的培养物样本平分到3支15mL 离心管中，12000r/min高速离心5min，弃除上清液后，置于103℃干燥箱中充分干燥2小时，测定样本干物质重量。
II.添加红色红球菌免疫增强剂的油乳剂灭活疫苗的制备
（1）抗原水相的制备
取3mg定量的红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱添加到鳜蛙病毒抗原中，加入5mL的Tween-80后混匀，充分混合溶解后，最终总体积为100mL，制备成抗原水相。同时设立未添加红色红球菌免疫增强剂的鳜蛙病毒抗原对照组，对照组与试验组的差异仅为是否添加红色红球菌免疫增强剂，其他均相同处理。
注意，制备抗原水相时应先制备不加红色红球菌免疫增强剂的对照组抗原水相，然后再制备含红色红球菌免疫增强剂的试验组抗原水相。
（2）乳化制备疫苗
取制备的抗原水相100mL，缓慢加入到200mL按照乳化配方制备的油相中，所述油相的制备方法为：在矿物油中加入司本-80，混匀后加入硬脂酸铝，混匀，灭菌，即得；所述矿物油（V/mL）：司本-80（V/mL）：硬脂酸铝（W/g）为94:6:1.5；使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原水相加入过程中保持5000r/min低速搅拌，待抗原水相完全加入到油相后，调节乳化机转速为12000r/min 高速剪切乳化5min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用，得初始的鱼用油乳剂灭活疫苗。
注意，制备疫苗时应先制备不加红色红球菌免疫增强剂的对照组疫苗，然后再制备含红色红球菌免疫增强剂的试验组疫苗。
（3）鱼油乳剂灭活疫苗的检测；
将所得初始的鱼用油乳剂灭活疫苗经物理性状检测，安全性检测、效力试验检测及商品动物免疫检测，验证合格后，即得。
对比例1、一种红色红球菌免疫增强剂
所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物和β-葡聚糖；所述红色红球菌的培养物和β-葡聚糖的质量比为16:5。
所述红色红球菌的培养物的制备方法为：将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养30h，培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6%、装液量为罐容积的70%、温度30℃，高温高压灭活，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min，即得；
所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1%，酵母粉3%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.5%，胰蛋白胨4%，发酵助剂0.4%，纯化水91.09%；所述发酵助剂由草酸和蛋氨酸按质量比3:14组成；所述培养基的pH为7.2。
对比例2、一种红色红球菌免疫增强剂
所述红色红球菌免疫增强剂，包括红色红球菌的培养物和β-葡聚糖；所述红色红球菌的培养物和β-葡聚糖的质量比为1:1。
所述红色红球菌的培养物的制备方法为：将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养30h，培养的条件为：搅拌转速200r/min，通气量1:1.0、接种量6%、装液量为罐容积的70%、温度30℃，高温高压灭活，所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min，即得；
所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1%，酵母粉3%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.5%，胰蛋白胨4%，发酵助剂0.4%，纯化水91.09%；所述发酵助剂由草酸和蛋氨酸按质量比3:14组成；所述培养基的pH为7.2。
对比例3、一种鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法
所述鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法与实施例4类似；
与实施例4的不同在于，红色红球菌免疫增强剂为对比例1制备的红色红球菌免疫增强剂。
对比例4、一种鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法
所述鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法与实施例4类似；
与实施例4的不同在于，红色红球菌免疫增强剂为对比例2制备的红色红球菌免疫增强剂。
试验例一、油乳剂灭活疫苗物理性状检测
取实施例4制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：
A.每组疫苗取10mL样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。
B.将疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况。
C.每组取30mL疫苗，分别分装入3支10mL锥底离心管，3000r/min离心15min，观察有无分层破乳现象。如有破乳分层，说明疫苗制备不成功，需重新制备。
D.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳。
试验结果如下：
A.试验组疫苗粘度32cp，对照组疫苗40cp，二者均合格。
B.试验组疫苗与对照组疫苗均合格。
C.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
D.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
试验例二、鱼用油乳剂灭活疫苗安全性试验
采用实施例4试验组制备的疫苗免疫20~40g健康鳜鱼，0.2mL/尾，每组疫苗免疫50尾，每日观察鳜鱼健康状态，连续观察14天。
试验结果显示，鳜鱼无死亡，健康状况良好，由此说明采用本发明免疫增强剂制得的疫苗合格，安全。
试验例三、鱼用油乳剂灭活疫苗效力性试验
分别采用实施例4试验组、对比例3、对比例4、对照组制备的疫苗免疫20~40g健康鳜鱼，0.1mL/尾，每组疫苗免疫50尾，疫苗免疫后28天，用传染性脾肾坏死病毒进行攻毒。另外设置空白组，试验结果如表1所示。
表1：鳜蛙病毒病灭活疫苗攻毒保护结果
| 试验组别 | 鳜鱼数量（尾） | 免疫后28天攻毒保护 |
| 空白组 | 50 | 45/50发病，且40/50死亡 |
| 对照组 | 50 | 35/50保护 |
| 试验组 | 50 | 45/50保护 |
| 对比例3组 | 50 | 43/50保护 |
| 对比例4组 | 50 | 40/50保护 |
由表1可知，采用本发明实施例4试验组制备的疫苗免疫鳜鱼28天后，其攻毒后保护率与对照组呈显著差异，且攻毒保护效果优于对比例3组、对比例4组。试验结果表明，采用本发明免疫增强剂制备的疫苗免疫保护效果好。
Claims (8)
1.一种用于增强抗原免疫原性的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，包括红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱；所述抗原为鳜蛙病毒抗原；所述红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的质量比为15-20:3-6:2-4；所述红色红球菌购自广东省微生物菌种保藏中心，GDMCC No.1.819。
2.如权利要求1所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱的质量比为16:5:3。
3.如权利要求1所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述红色红球菌的培养物的制备方法为：
将红色红球菌置于添加有培养基的30L的发酵罐中培养24-36h，高温高压灭活，即得；所述培养基包括以下组分及其质量百分数：葡萄糖1-2%，酵母粉2-4%，磷酸氢二钾0.01-0.02%，硫酸镁0.4-0.7%，胰蛋白胨3-5%，发酵助剂0.3-0.5%，纯化水87.78-92.29%。
4.如权利要求3所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述发酵助剂包括草酸和蛋氨酸。
5.如权利要求4所述的红色红球菌免疫增强剂，其特征在于，所述草酸和蛋氨酸的质量比为2-4:10-15。
6.如权利要求1-5任一项所述的红色红球菌免疫增强剂在制备鱼用油乳剂灭活疫苗中的应用，所述鱼用油乳剂灭活疫苗含有鳜蛙病毒抗原。
7.一种鱼用油乳剂灭活疫苗，包括权利要求1-5任一项所述的红色红球菌免疫增强剂和鳜蛙病毒抗原。
8.如权利要求7所述的鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1取红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱，采用121℃高压蒸汽灭活30min，灭菌后待温度降至室温时，4℃保存备用；
S2将红色红球菌的培养物进行定量，得定量的红色红球菌的培养物；
S3将步骤S2所得定量的红色红球菌的培养物、β-葡聚糖和益母草碱按乳化配方添加至抗原水相中，搅拌均匀并进行常规乳化，得初始的鱼用油乳剂灭活疫苗；
S4将步骤S3所得初始的鱼用油乳剂灭活疫苗经物理性状检测，安全性检测、效力试验检测及商品动物免疫检测，验证合格后，即得。
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